一种基于适配体的游离钆(III)传感器

摘要

描述了使用多脱氧核苷酸（44-mer 适配体）分子在水溶液中检测游离钆(III)离子的方法。通过传感器荧光发射的增强来检测该离子的存在。

摘要

一种检测游离三价钆离子（Gd³⁺）存在的方法³⁺) 在水溶液中的表现被展示。Gd³⁺ 由于配体与离子反应不完全或发生解离，基于钆的对比剂样品中常含有游离钆离子。鉴于该离子具有毒性，其检测至关重要。本文介绍了用于检测 Gd³⁺ 的适体传感器（Gd-sensor）的设计与使用方法。³⁺ 描述了该传感器在响应离子浓度增加时会产生荧光变化，其检测限达到纳摩尔级别（信噪比为3时约为100 nM）。该检测可在384孔微孔板中、于常温pH条件（~7 - 7.4）的水相缓冲液中进行。该传感器对其他生理相关的金属离子（如钠离子、钾离子和钙离子）反应较弱，但对Gd不具有特异性。³⁺ 与其他三价镧系元素（如铕(III)和铽(III)）相比具有优势。然而，镧系元素在对比剂或生物系统中并不常见，因此该传感器可用于选择性测定未螯合的Gd³⁺ 在水相条件下。

引言

磁共振成像（MRI）在临床诊断中的重要性日益增加，但该技术受限于其固有的灵敏度，这推动了新型钆基对比剂（GBCA）研究的迅速发展¹。GBCA 是一类用于提高图像质量的分子，通常具有三价钆离子（Gd³⁺）与多齿配体配位的化学结构。这种配位作用至关重要，因为未螯合的 Gd³⁺ 具有毒性，已在部分肾病或肾功能衰竭患者中被证实与肾源性系统性纤维化的发展有关²。因此，检测水相中游离离子的存在对于确保 GBCA 的安全性具有关键作用。GBCA 溶液中出现未螯合的 Gd³⁺ 通常是由于配体与离子之间的反应不完全、配合物解离，或被其他生物金属阳离子置换所致³。

在目前用于检测 Gd³⁺ 存在的多种技术中，基于色谱法和/或光谱法的技术在通用性和适用性方面居于领先地位⁴。这些方法的优势包括高灵敏度和高准确性、能够分析多种样品基质（包括人血清⁵、尿液和毛发⁶、废水⁷以及对比剂制剂⁸），以及可同时定量多种 Gd³⁺ 配合物（Telgmann et al. 的综述文章中总结了2013年之前的相关研究）⁴。其唯一缺点是其中一些方法需要特定仪器设备（如电感耦合等离子体质谱）^4....

方案

注意：所有缓冲液和溶液的配制均使用分子生物学级水。所有一次性离心管（微量离心管和PCR管）及移液器吸头均应无DNase和RNase。使用任何化学品前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。强烈建议使用适当个人防护装备（PPE）。

1. 适配体储备液的制备

1. 从商业渠道购买两条聚脱氧核苷酸链。两条链均需通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。
   链 1（Gd-适配体）：
   5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   链 2（QS）：
   5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'
2. 将每条链分别溶于水中，配制成浓度为 100 μM 的 Gd-适配体和 QS 单独储备液。
3. 将这些溶液储存于 -20 °C。目前这些溶液在 3 年内保持稳定。
4. 为尽量减少冻融循环，将储备液以 10 μL 分装储存。

2. 2倍Gd传感器溶液的制备

1. 配制检测缓冲液（20 mM HEPES，2 mM MgCl₂，150 mM NaCl，5 mM KCl）。使用 NaOH 和 HCl 将 pH 调整至约 7.4，并通过带有 0.2 μm PES 膜的无菌一次性瓶顶过滤器过滤。将缓冲液储存于无....

结果

Gd传感器溶液在存在未螯合Gd时的典型荧光变化³⁺ 如图所示 图2. 发射光可绘制为荧光倍数变化（图2A）或原始荧光读数（图2B) 的任意单位（AFU）。两条曲线均得到非常相似的校准曲线，对 Gd 浓度的线性范围³⁺ 以下 1 μM 信号的饱和 > 3 μM检测限约为100 nM，信噪比为3。

在含有目标钆基对比剂（GBCA）的溶液中，与“空白”溶液相比，游离态 Gd³⁺ 的存在将导致传感器的荧光信号增强。图3展示了两种不同批次 Gd-DOTA 复合物溶液的荧光变化示例，其中一个批次纯度较高，另一个较低。Gd-DOTA（钆特酸）是一种钆离子 Gd³⁺ 与有机配体 DOTA 形成的络合物，存在于市售的对比剂中。高纯度批次在 Gd.......

讨论

使用基于适配体的钆传感器，可观察到荧光发射强度的增加，其与未螯合的 Gd³⁺ 浓度成正比。为了最大限度减少样品用量，该检测可在384孔微孔板中进行，每孔总样品体积为45 μL。在此设计中，选择荧光素（FAM）和二甲基偶氮苯（dabcyl，Dab）主要基于试剂成本；若需调整发射波长，可选用其他荧光基团与淬灭基团的组合¹¹。

需要注意的是，为了获得传感器的最佳检测效果，一个关键步骤是在检测缓冲液中加热至 95 °C 并缓慢冷却（步骤 2.4），以实现 Gd-适配体与 QS 链之间的最佳杂交。如实验方案中先前所述，若无热循环仪，可在水浴中完成 95 °C 的孵育。另一个需要控制的关键参数是缓冲液的组成；建议使用步骤 2.1 中列出的检测缓冲液来溶解对比剂，也可使用去离子水。然而，应避免使用可能含有干扰物质的溶液。例如，含有磷酸根阴离子的缓冲液会与未螯合的 Gd³⁺ 配位，形成不溶性的磷酸钆沉淀¹²。该沉淀物不会与传感器发生反应，从而导致假阴性结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gd-适配体	IDTDNA	在订单表中输入序列及荧光标记信息	可使用发射波长不同的荧光染料。该适配体也可从其他公司订购。
淬灭链	IDTDNA	在订单表中输入序列及淬灭基团修饰信息	可选用不同淬灭基团以实现从荧光染料到淬灭基团的最佳能量转移。该适配体也可从其他公司订购。
分子生物学级水			无特定生产厂家要求，DEPC处理或未处理的水均可使用
无水氯化钆(III)	Strem	936416	有毒
HEPES	赛默飞世尔科技	BP310-500
无水氯化镁	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
氯化钠	Acros Organics	327300025
氯化钾	赛默飞世尔科技	P333-500
氢氧化钠颗粒	赛默飞世尔科技	BP359	腐蚀性
盐酸	赛默飞世尔科技	SA49	有毒且具腐蚀性
384孔低裙边黑色平底聚苯乙烯NBS板	Corning	3575	需使用适用于荧光检测的微孔板。
Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌瓶顶过滤器	Thermo Scientific	5680020	瓶顶配备0.2微米PES膜
一次性无菌250 mL离心瓶	Corning	430281	可使用更大或更小容量的瓶子
1.5 mL微量离心管			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
0.2 mL PCR管			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
移液器			无特定生产厂家要求
适当规格的无滤芯移液器吸头			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
仪器
酶标仪	Biotek Synergy H1		其他厂家的酶标仪同样适用