一种基于适配体的游离钆(III)传感器

摘要

描述了使用多脱氧核苷酸（44-mer 适配体）分子在水溶液中检测游离钆(III)离子的方法。通过传感器荧光发射的增强来检测该离子的存在。

摘要

一种检测游离三价钆离子（Gd³⁺）存在的方法³⁺) 在水溶液中的表现被展示。Gd³⁺ 由于配体与离子反应不完全或发生解离，基于钆的对比剂样品中常含有游离钆离子。鉴于该离子具有毒性，其检测至关重要。本文介绍了用于检测 Gd³⁺ 的适体传感器（Gd-sensor）的设计与使用方法。³⁺ 描述了该传感器在响应离子浓度增加时会产生荧光变化，其检测限达到纳摩尔级别（信噪比为3时约为100 nM）。该检测可在384孔微孔板中、于常温pH条件（~7 - 7.4）的水相缓冲液中进行。该传感器对其他生理相关的金属离子（如钠离子、钾离子和钙离子）反应较弱，但对Gd不具有特异性。³⁺ 与其他三价镧系元素（如铕(III)和铽(III)）相比具有优势。然而，镧系元素在对比剂或生物系统中并不常见，因此该传感器可用于选择性测定未螯合的Gd³⁺ 在水相条件下。

引言

磁共振成像（MRI）在临床诊断中的重要性日益增加，但该技术受限于其固有的灵敏度，这促使了针对新型钆基对比剂（GBCA）研发的迅速发展¹。GBCA 是一类用于提高图像质量的分子，通常具有三价钆离子（Gd³⁺）与多齿配体配位形成的化学结构。这种配位作用至关重要，因为未螯合的 Gd³⁺ 具有毒性，已被证实与部分肾功能不全或肾衰竭患者发生肾源性系统性纤维化有关²。因此，检测水溶液中游离离子的存在对于确保 GBCA 的安全性至关重要。GBCA 溶液中出现未螯合的 Gd³⁺ 通常是由于配体与离子之间的反应不完全、配合物解离，或被其他生物金属阳离子取代所致³。

在目前用于检测 Gd³⁺ 存在的多种技术中，基于色谱法和/或光谱法的技术在通用性和适用性方面居于领先地位⁴。这些方法的优势包括高灵敏度和高准确性、能够分析多种样品基质（包括人血清⁵、尿液和毛发⁶、废水⁷以及造影剂制剂⁸），并可同时定量多种 Gd³⁺ 配合物（2013 年之前的相关研究综述详见 Telgmann et al 的全面评述）⁴。其唯一缺点是其中若干方法需要特定仪器设备（如电感耦合等离子体质谱法）⁴，而部分实验室可能无法获得。在新型钆基造影剂（GBCA）研发及概念验证阶段，一种相对更便捷、快速且成本较低的基于光谱学的方法（如紫外-可见吸收或荧光法）可能成为有价值的替代方案。基于上述应用需求，已开发出一种用于水溶液中 Gd³⁺ 的荧光适配体传感器⁹。

适配体（Gd-适配体）是一种由44个碱基组成的单链DNA分子，其特定的碱基序列通过配体系统性进化指数富集技术（SELEX）筛选获得⁹。为了将该适配体改造为荧光传感器，将一个荧光基团连接在DNA链的5'端，随后通过13个互补碱基与一条淬灭链（QS）杂交（图1）。QS的3'端标记有一个无荧光淬灭分子。在无Gd³⁺存在时，传感器（Gd-传感器）由Gd-适配体与QS以1:2的摩尔比组成，由于荧光基团与淬灭剂之间的能量转移，其荧光发射极弱。当加入水溶性Gd³⁺后，QS将从Gd-适配体上被置换下来，导致荧光发射显著增强。

图1. 该传感器（Gd传感器）由一条44个碱基长的适体（Gd-aptamer）和一条13个碱基长的淬灭链（QS）组成，其中适体标记了荧光素（一种荧光基团），淬灭链标记了Dabcyl（一种非荧光淬灭剂）。 在无游离Gd³⁺时，传感器的荧光信号极低；当加入Gd³⁺后，淬灭链被置换，荧光发射显著增强。 请点击此处查看此图的放大版本。

目前，有一种常用的基于光谱学的方法用于检测水溶液中的钆³⁺该检测方法利用了二甲酚橙分子，该分子在与离子螯合后，其最大吸收波长会从433 nm转变为573 nm。¹⁰这两个吸收峰最大值的比值可用于定量未螯合钆（Gd）的含量³⁺适体传感器是二甲酚橙检测法的一种替代方法（也可作为补充），因为这两种方法在反应条件（如所用缓冲溶液的pH值和组成）、靶标选择性、定量线性范围以及检测模式方面均存在差异。⁹.

方案

注意：所有缓冲液和溶液的配制均使用分子生物学级水。所有一次性离心管（微量离心管和PCR管）及移液器吸头均应无DNase和RNase。使用任何化学品前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。强烈建议使用适当个人防护装备（PPE）。

1. 适配体储备液的制备

1. 从商业渠道购买两条聚脱氧核苷酸链。两条链均需通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。
   链 1（Gd-适配体）：
   5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   链 2（QS）：
   5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'
2. 将每条链分别溶于水中，配制成浓度为 100 μM 的 Gd-适配体和 QS 单独储备液。
3. 将这些溶液储存于 -20 °C。目前这些溶液在 3 年内保持稳定。
4. 为尽量减少冻融循环，将储备液以 10 μL 分装储存。

2. 2倍Gd传感器溶液的制备

1. 配制检测缓冲液（20 mM HEPES，2 mM MgCl₂，150 mM NaCl，5 mM KCl）。使用 NaOH 和 HCl 将 pH 调整至约 7.4，并通过带有 0.2 μm PES 膜的无菌一次性瓶顶过滤器过滤。将缓冲液储存于无菌瓶中。若经过滤并妥善储存（室温），该缓冲液至今已证实可稳定保存长达 2 年。
2. 取 1 μL Gd-适配体储备液（来自步骤 1.2）和 2 μL QS 储备液（来自步骤 1.2），加入 497 μL 检测缓冲液中进行稀释。使用涡旋振荡器充分混匀。此时，Gd-传感器溶液（2×）中两者的浓度分别为 200 nM 和 400 nM。
   注意：本步骤制备的 2× Gd-传感器溶液体积为 500 μL，足以用于检测 6–7 个不同浓度的 Gd³⁺ 溶液以绘制校准曲线及对比剂溶液（步骤 3）。每个样品将在 384 孔板中设置两个复孔。
   1. 根据需检测的 Gd³⁺ 溶液数量，相应调整 2× Gd-传感器溶液的配制体积。
3. 将 2× Gd-传感器溶液分装至 9 个 PCR 管中，每管 50 μL。将 PCR 管放入热循环仪中。
4. 设置热循环仪程序：将管内溶液加热至 95 °C，保持 5 分钟，随后在约 15 分钟内缓慢冷却至 25 °C（降温速率约为 0.05–0.1 °C/s）。此加热-冷却循环旨在确保 Gd-适配体与 QS 之间实现最佳杂交。若杂交不完全，会导致淬灭不充分，从而增加传感器的背景荧光。若无热循环仪，可改用热水浴完成该过程。
5. 当溶液冷却至 25 °C 后，应立即使用，或保留在热循环仪中（最多约 2 小时）待用。若使用水浴加热，则在水温自然缓慢冷却至室温的过程中，将 PCR 管保留在水浴内。

3. 构建荧光校准曲线并检测钆对比剂溶液中未螯合 Gd³⁺ 的存在

1. 溶解 GdCl₃ 在测定缓冲液（与步骤2.1中相同的缓冲液）中溶解固体。
2. 通过连续稀释法，分别配制 100 μL 的 6 种不同浓度的 Gd³⁺ 在微量离心管中配制用于标准曲线的溶液，浓度为最终所需浓度的两倍（2x 溶液）。
   1. 例如，为了建立一个0（仅缓冲液，不含GdCl）的校准₃）、50、100、200、400 和 800 nM 的 Gd³⁺，配制含有 0、100、200、400、800 和 1,600 nM 离子的溶液。务必始终包含含 0 nM Gd 的“空白”样本³⁺ 作为阴性对照。
3. 将待测对比剂溶解于检测缓冲液中。通过连续稀释制备2至3种不同浓度的对比剂溶液。
   注意：建议测试3种不同浓度的对比剂溶液，以确保这些浓度处于线性范围内。如果所测试的样品未显示出线性关系，则应降低所用对比剂的浓度。
4. 从步骤2.5的PCR仪中取出含有2x Gd-传感器溶液的PCR管。
5. 加入每种 Gd 50 μL³⁺ 将3.2步骤中的溶液加入到6个含有2x Gd传感器溶液的PCR管中。通过移液器吹打混匀。每个PCR管现在均含有目标浓度的Gd³⁺ 待测样本、100 nM Gd-适配体和 200 nM QS。
6. 向含有2倍Gd传感器溶液的其余PCR管中，加入50 μL步骤3.3中的对比剂溶液。用移液器上下吹打数次，充分混匀。
7. 将PCR管中的溶液在室温下孵育约5分钟，可静置长达30分钟。
8. 将每个管中的45 μL转移至384孔板中。每个PCR管对应两个复孔。
9. 在酶标仪上记录每孔的荧光值。Gd传感器设计中使用的荧光基团（FAM）的激发和发射最大波长分别为495 nm和520 nm，具体数值可参见供应商网站。根据酶标仪类型（单色器型或滤光片型），选择合适的激发和发射波长或滤光片。
10. 以钆浓度为横坐标，荧光强度（任意荧光单位，AFU）为纵坐标绘制曲线图³⁺.
11. 以荧光倍数变化为纵坐标、Gd 浓度为横坐标绘制曲线图³⁺. 通过将各浓度的相对荧光单位（AFU）除以“空白”溶液（含0 nM Gd）的AFU，计算荧光倍数变化³⁺）。荧光变化倍数可用于结果的标准化，以防AFU存在周期性差异（不同天数， 等等。）变异。
12. 比较含有对比剂的溶液与“空白”溶液的荧光发射，其中“空白”溶液为含有 0 nM GdCl 的溶液₃ （仅缓冲液）
    注意：GBCA 溶液的荧光强度越高，表明存在更多的未螯合钆³⁺，这可能需要对造影剂进行进一步纯化。未螯合钆（Gd）的含量³⁺ 可使用步骤3.10或3.11中构建的标准曲线估算其存在量。

结果

在存在未螯合的 Gd³⁺ 时，Gd 传感器溶液典型的荧光变化如图 2所示。发射信号可表示为荧光倍数变化（图 2A）或以任意荧光单位（AFU）表示的原始荧光读数（图 2B）。两种作图方法均得到非常相似的校准曲线，在 Gd³⁺ 浓度低于 1 μM 时呈线性范围，当浓度达到> 3 μM 时信号趋于饱和。检测限约为 100 nM，信噪比为 3。

在含有目标钆基对比剂（GBCA）的溶液中，与“空白”溶液相比，游离Gd³⁺的存在将导致传感器的荧光信号增强。两种不同批次的Gd-DOTA复合物溶液的荧光变化结果如图所示，其中一个批次纯度较高，另一个较低，用以展示代表性实验结果（图3）。Gd-DOTA（钆特酸）是一种由Gd³⁺与有机配体DOTA...

讨论

使用基于适配体的钆传感器，可观察到荧光发射强度的增加，其与未螯合的 Gd³⁺ 浓度成正比。为了最大限度减少样品用量，该检测可在384孔微孔板中进行，每孔总样品体积为45 μL。在此设计中，选择荧光素（FAM）和二甲基偶氮苯（dabcyl，Dab）主要基于试剂成本；若需调整发射波长，可选用其他荧光基团与淬灭基团的组合¹¹。

需要注意的是，为了获得传感器的最佳检测效果，一个关键步骤是在检测缓冲液中加热至 95 °C 并缓慢冷却（步骤 2.4），以实现 Gd-适配体与 QS 链之间的最佳杂交。如实验方案中先前所述，若无热循环仪，可在水浴中完成 95 °C 的孵育。另一个需要控制的关键参数是缓冲液的组成；建议使用步骤 2.1 中列出的检测缓冲液来溶解对比剂，也可使用去离子水。然而，应避免使用可能含有干扰物质的溶液。例如，含有磷酸根阴离子的缓冲液会与未螯合的 Gd³⁺ 配位，形成不溶性的磷酸钆沉淀¹²。该沉淀物不会与传感器发生反应，从而导致假阴性结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gd-适配体	IDTDNA	在订单表中输入序列及荧光标记信息	可使用发射波长不同的荧光染料。该适配体也可从其他公司订购。
淬灭链	IDTDNA	在订单表中输入序列及淬灭基团修饰信息	可选用不同淬灭基团以实现从荧光染料到淬灭基团的最佳能量转移。该适配体也可从其他公司订购。
分子生物学级水			无特定生产厂家要求，DEPC处理或未处理的水均可使用
无水氯化钆(III)	Strem	936416	有毒
HEPES	赛默飞世尔科技	BP310-500
无水氯化镁	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
氯化钠	Acros Organics	327300025
氯化钾	赛默飞世尔科技	P333-500
氢氧化钠颗粒	赛默飞世尔科技	BP359	腐蚀性
盐酸	赛默飞世尔科技	SA49	有毒且具腐蚀性
384孔低裙边黑色平底聚苯乙烯NBS板	Corning	3575	需使用适用于荧光检测的微孔板。
Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌瓶顶过滤器	Thermo Scientific	5680020	瓶顶配备0.2微米PES膜
一次性无菌250 mL离心瓶	Corning	430281	可使用更大或更小容量的瓶子
1.5 mL微量离心管			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
0.2 mL PCR管			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
移液器			无特定生产厂家要求
适当规格的无滤芯移液器吸头			无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可
仪器
酶标仪	Biotek Synergy H1		其他厂家的酶标仪同样适用