蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。
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摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用参与数千种细胞过程，并在特定的空间环境中发生。传统上，免疫共沉淀是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的常用技术。随后的蛋白质印迹分析则是可视化共沉淀蛋白质的最常用方法。近年来，邻近连接技术已成为可视化蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具 原位 并提供了利用该方法定量蛋白质-蛋白质相互作用的可能性。与传统的免疫细胞化学类似，邻近连接测定技术也依赖于一抗对相应抗原的可及性；但不同之处在于，邻近连接测定通过滚环扩增聚合酶链式反应这一独特技术来检测蛋白质-蛋白质相互作用，而传统免疫细胞化学仅能显示蛋白质的共定位。
核因子90（NF90）与RNA结合基序蛋白3（RBM3）此前已被证实为相互作用的蛋白伙伴。它们主要定位于细胞核，但也可迁移至细胞质，并在细胞质区室中调控信号通路。本文中，我们通过共免疫沉淀和邻近连接实验，比较了NF90与RBM3在细胞核和细胞质中的相互作用。此外，我们还讨论了这两种技术在可视化蛋白质-蛋白质相互作用时的优势与局限性，特别是在空间分布以及蛋白质-蛋白质相互作用特性方面的应用。
引言
核因子90（NF90）是一种具有多种亚型的蛋白质，具有多种功能，包括参与抗病毒反应、调控白细胞介素-2的转录后表达以及调控miRNA的生成1-3。RBM3是一种RNA结合蛋白，参与翻译过程和miRNA的生成，可由低温和缺氧等多种应激因素诱导表达4-6。近期，我们发现NF90与RBM3存在于同一蛋白复合物中7。NF90与RBM3之间的相互作用对于调控未折叠蛋白反应中蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）的活性至关重要7。NF90和RBM3主要定位于细胞核，但有少量NF90和RBM3可在细胞质中穿梭，并在细胞质中相互结合以执行特定功能，例如调控PERK活性。因此，可视化NF90与RBM3在亚细胞结构中的相互作用分布具有重要意义，这可能揭示二者在不同亚细胞区域中的多样化功能。
几十年前，酵母双杂交（Y2H）技术被开发用于检测两种蛋白质之间的相互作用8。然而，由于融合蛋白的人工构建，该方法容易产生假阳性结果，限制了其应用。长期以来，免疫共沉淀一直是分析蛋白质-蛋白质相互作用的主要技术，尤其是在内源性条件下9。对于免疫共沉淀所得的蛋白复合物，最便捷的分析方法是蛋白质印迹（Western blot），而在需要超高灵敏度和精确度时则采用质谱分析。近年来，邻近连接实验（proximity ligation assay）作为一种新方法被开发出来，....
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方案
1. 免疫共沉淀
- 将HEK293细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中5 每孔接种细胞至一个6孔板中，每孔2 ml，培养基于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞48小时2.
- 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。在4 °C下以500 × g离心5分钟收集细胞。
- 使用商业化的核与胞质提取试剂制备核组分和胞质组分，按照生产商说明书进行操作，并作部分修改。
- 使用 3 × 106 一次免疫共沉淀实验所需的细胞（约3个6孔板孔中90%融合度的细胞）。加入300 µl冷的胞质提取液（CER I），在最高速度下涡旋振荡15秒。
- 冰上孵育30分钟。孵育期间，每10分钟涡旋振荡5秒。
- 加入16.5 µl冰冷的胞质提取液II（CER II），涡旋振荡5秒，冰上孵育5分钟。
- 涡旋5秒，4 °C下以16,000 × g离心5分钟。
- 将上清液（胞质提取物）转移至新的预冷离心管中，冰上保存备用。
- 用1 ml冷PBS重悬不溶性沉淀物（含细胞核），吹打混匀5次，洗涤3次。每次洗涤后弃去PBS。
- 加入150 µl冷核提取液（N....
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结果
图1表明，NF90和RBM3均为核蛋白，仅有少量存在于细胞质中。值得注意的是，RBM3呈现出三条不同的阳性条带。其中最小的一条略低于20 kDa，对应RBM3的正确大小（RBM3预测的分子量为17 kDa）。另外两条带的来源仍有待研究。以RBM3为诱饵蛋白进行的共免疫沉淀实验显示，NF90与RBM3的相互作用主要存在于细胞核中，少数存在于细胞质中。共免疫沉淀结果支持了每种单个蛋白的定位。
如图2A所示，NF90和RBM3主要位于细胞核内，但也存在于细胞质中in situ。这两种蛋白质在两个区室中均表现出完全共定位。邻近连接实验揭示了NF90与RBM3相互作用的模式，该模式与传统的免疫细胞化学结果非常相似，在大多数细胞中，相互作用主要发生在细胞核内。仅有少数细胞显示出NF90-RBM3相互作用 predominantly 位于细胞质中。
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讨论
两种方法均存在各自的优点与局限性。作为一种相对较新的技术，邻近连接检测法的一个明显优势在于能够揭示单细胞水平的蛋白质-蛋白质相互作用，而非针对一群异质性细胞进行检测。所获得的图像具有高倍数和高分辨率（例如 通过共聚焦显微镜）提供了通过计数单个荧光点进行定量分析的可能性。相比之下，传统的免疫共沉淀技术与蛋白质印迹相结合的方法只能对蛋白条带进行半定量分析，主要原因是难以为免疫沉淀样品确定合适的上样对照。此外，当蛋白质-蛋白质相互作用较弱或瞬时存在时，需要大量生物材料， 例如，细胞或组织，进行共免疫沉淀，或采用带有融合标签的人工过表达系统，以提高检测相互作用的几率。此外，也可使用高灵敏度的检测技术，如质谱分析，以提升实验质量。然而，在起始材料用量方面，邻近连接检测技术具有明显优势。只要抗体质量较高，仅需少量细胞即可完成实验。此外，在组织样本中， 原位 通过邻近连接实验可实现不同组织结构和细胞类型中蛋白质-蛋白质相互作用的可视化，其模式与常规免疫组织化学相似。相比之下，免疫共沉淀技术本身不适合展示蛋白质-蛋白质相互作用的空间分布。
在细.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（SNSF, 31003A_163305）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma | D6429 | 高葡萄糖’ 4,500 mg/L |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76（NF90/NF110）抗体 | BD Transduction Laboratories | 612154 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000，用于 ICC/PLA 时为 1:100 |
| RBM3 抗体 | ProteinTech | 14363-1-AP | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000，用于 ICC/PLA 时为 1:100 |
| Lamin A/C 抗体 | Cell Signaling Technology | #2032 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Abcam | ab8245 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000 |
| 正常兔 IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记二抗 | Cell Signaling Technology | #7074 | 用于 WB 时稀释比例为 1:5,000 |
| 抗小鼠 HRP 二抗 | Carl Roth | 4759.1 | 用于 WB 时稀释比例为 1:5,000 |
| Clarity 西部印迹 ECL 显色底物 | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液（4x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE 转膜缓冲液（20x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hybond P 0.2 PVDF 膜 | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 孔培养载玻片 | Corning BioCoat | 354632 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| 正常山羊血清（NGS） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L 抗体），Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L 抗体），Alexa Fluor 568 标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA 探针 Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA 探针 Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink 检测试剂 Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink 洗涤缓冲液 荧光 | Sigma | DUO82049 | |
| 含 DAPI 的 Duolink 封片剂 | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| 显微镜 | Olympus | AX-70 | |
| CCD 相机 | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X 光胶片 | Fujifilm | Super RX | |
| 胶片处理机 | Fujifilm | FPM-100A |
参考文献
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....
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重印与许可
