蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。
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摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用参与数千种细胞过程，并在特定的空间环境中发生。传统上，免疫共沉淀是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的常用技术。随后的蛋白质印迹分析则是可视化共沉淀蛋白质的最常用方法。近年来，邻近连接技术已成为可视化蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具 原位 并提供了利用该方法定量蛋白质-蛋白质相互作用的可能性。与传统的免疫细胞化学类似，邻近连接测定技术也依赖于一抗对相应抗原的可及性；但不同之处在于，邻近连接测定通过滚环扩增聚合酶链式反应这一独特技术来检测蛋白质-蛋白质相互作用，而传统免疫细胞化学仅能显示蛋白质的共定位。
核因子90（NF90）与RNA结合基序蛋白3（RBM3）此前已被证实为相互作用的蛋白伙伴。它们主要定位于细胞核，但也可迁移至细胞质，并在细胞质区室中调控信号通路。本文中，我们通过共免疫沉淀和邻近连接实验，比较了NF90与RBM3在细胞核和细胞质中的相互作用。此外，我们还讨论了这两种技术在可视化蛋白质-蛋白质相互作用时的优势与局限性，特别是在空间分布以及蛋白质-蛋白质相互作用特性方面的应用。
引言
核因子90（NF90）是一种具有多种亚型的蛋白质，具有多种功能，包括参与抗病毒反应、调控白细胞介素-2的转录后表达以及调控miRNA的生成1-3。RBM3是一种RNA结合蛋白，参与翻译过程和miRNA的生成，可由低温和缺氧等多种应激因素诱导表达4-6。近期，我们发现NF90与RBM3存在于同一蛋白复合物中7。NF90与RBM3之间的相互作用对于调控未折叠蛋白反应中蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）的活性至关重要7。NF90和RBM3主要定位于细胞核，但有少量NF90和RBM3可在细胞质中穿梭，并在细胞质中相互结合以执行特定功能，例如调控PERK活性。因此，可视化NF90与RBM3在亚细胞结构中的相互作用分布具有重要意义，这可能揭示二者在不同亚细胞区域中的多样化功能。
几十年前，酵母双杂交（Y2H）技术被开发用于检测两种蛋白质之间的相互作用8。然而，由于融合蛋白的人工构建，该方法容易产生假阳性结果，限制了其应用。长期以来，免疫共沉淀一直是分析蛋白质-蛋白质相互作用的主要技术，尤其是在内源性条件下9。对于免疫共沉淀所得的蛋白复合物，最便捷的分析方法是蛋白质印迹（Western blot），而在需要超高灵敏度和精确度时则采用质谱分析。近年来，邻近连接实验（proximity ligation assay）作为一种新方法被开发出来，可用于在细胞和组织中原位检测蛋白质-蛋白质相互作用in situ 10,11。
本文比较了最常用的免疫共沉淀方法与较新颖的邻近连接实验方法在捕获亚细胞组分中NF90-RBM3相互作用方面的效果，并讨论了这两种技术各自的优点与局限性。
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方案
1. 免疫共沉淀
- 将HEK293细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中5 每孔接种细胞至一个6孔板中，每孔2 ml，培养基于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素（Pen-Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞48小时2.
- 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。在4 °C下以500 × g离心5分钟收集细胞。
- 使用商业化的核与胞质提取试剂制备核组分和胞质组分，按照生产商说明书进行操作，并作部分修改。
- 使用 3 × 106 一次免疫共沉淀实验所需的细胞（约3个6孔板孔中90%融合度的细胞）。加入300 µl冷的胞质提取液（CER I），在最高速度下涡旋振荡15秒。
- 冰上孵育30分钟。孵育期间，每10分钟涡旋振荡5秒。
- 加入16.5 µl冰冷的胞质提取液II（CER II），涡旋振荡5秒，冰上孵育5分钟。
- 涡旋5秒，4 °C下以16,000 × g离心5分钟。
- 将上清液（胞质提取物）转移至新的预冷离心管中，冰上保存备用。
- 用1 ml冷PBS重悬不溶性沉淀物（含细胞核），吹打混匀5次，洗涤3次。每次洗涤后弃去PBS。
- 加入150 µl冷核提取液（NER），涡旋振荡15秒，冰上孵育1小时。孵育期间，每10分钟涡旋振荡15秒，并用200 µl吸头吹打10次。
- 涡旋15秒，4 °C下以16,000 × g离心10分钟。
- 将上清液（核提取物）转移至新的预冷离心管中，冰上保存备用。
- 分别取核提取物和细胞质提取物总体积的10%作为输入样本。
- 向剩余的提取物中加入冷PBS，定容至1 ml。置于冰上保存，直至使用。
注意：使用蛋白G偶联的磁珠时，预清除并非必需步骤。但如果背景较高，可在4 °C下将40 µl蛋白G偶联磁珠（50%悬液）与1 ml本步骤所得稀释裂解液在旋转仪上孵育30分钟进行预清除。用磁力架分离上清液（预清除裂解液）与磁珠，弃去磁珠。 - 将40 µl Protein G偶联磁珠（50%悬液）与4 µg兔多克隆抗RBM3抗体或兔IgG（阴性对照）在200 µl含0.02% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）中混合，于室温在旋转仪上孵育40分钟，以实现一抗与Protein G偶联磁珠的偶联。
- 使用磁力架分离抗体偶联的磁珠与上清液，弃去上清液。用200 µl PBST（0.02%）洗涤磁珠一次。
- 加入1 ml稀释的裂解液（或必要时使用预清除的裂解液）至珠粒中，4 °C条件下在旋转仪上孵育过夜。
- 第二天，将磁珠与上清液通过磁力架分离，并弃去上清液。每管加入0.5 ml PBST（0.02%），在4 °C下以20 rpm的固定转速于旋转仪上洗涤3次，每次10分钟。
- 通过加入40 µl上样缓冲液（1x商用上样缓冲液和50 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT））从磁珠中洗脱蛋白质。在70 °C加热10分钟。离心后将液体转移至新的1.5 ml离心管中。
- 将输入裂解物用上样缓冲液稀释（终浓度：1x 商业上样缓冲液和 50 mM DTT），于 70 °C 加热 10 分钟。将上一步获得的输入样品和免疫沉淀蛋白上样至预制的 4–12% Bis-Tris 凝胶中。每孔上样体积不应超过 20 µl。在冰上使用 1x 商业电泳缓冲液进行电泳，运行 35 分钟。
注意：核提取物与胞质提取物的上样体积比为1:2（V/V），以保证上样细胞初始数量相同。 - 将蛋白质在4 °C条件下，以30 V电压在1×商用转膜缓冲液中转至PVDF膜上，持续2小时。
- 在摇床上，室温下用含0.1% Tween 20的PBST缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭膜，持续40分钟。
- 在4 °C下，用PBST（0.1%）将膜与一抗（均按1:1,000稀释）孵育过夜。
- 在摇床上用 PBST (0.1%) 室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 在室温下，用 PBST（0.1%）将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或抗兔二抗（均按 1:5,000 稀释）孵育 1 小时。
- 在摇床上于室温用 PBST（0.1%）洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 每平方厘米使用0.2 ml增强型化学发光（ECL）底物混合液2 膜，室温孵育5分钟。从这一步开始避免所有光照，仅允许红光。
- 弃去液体，将膜放入暗盒中并压片。使用自动洗片机显影胶片。
2. 免疫细胞化学与邻近连接实验
- 将HEK293细胞以1.5 × 10⁵接种4 每腔室接种于0.4 ml含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，使用8腔聚-D-赖氨酸包被载玻片，每腔细胞数为
- 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞48小时2.
- 吸弃培养基，于室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟。
- 吸除PFA，每孔加入0.5 ml PBS，洗涤3次，每次10分钟。
- 用含0.5% Triton X-100和5%正常山羊血清（NGS）的PBS在室温下孵育细胞1小时，以实现透化和封闭。
- 在含0.1% Triton X-100和5% NGS的PBS中，4 °C条件下于摇床上与一抗孵育过夜。双染色时，将小鼠单克隆抗NF90抗体和兔多克隆抗RBM3抗体用PBS按1:100稀释。阴性对照组分别单独省去其中一种一抗，并设置第三组同时省去两种一抗作为对照。
注意：请勿使用商用封闭和稀释试剂。 - 每孔用 0.5 ml PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 适用于免疫细胞化学或邻近连接实验方案
- 免疫细胞化学
- 室温下用1:500稀释的绿色荧光染料标记的山羊抗小鼠二抗和红色荧光染料标记的山羊抗兔二抗孵育1小时。自此步骤开始避免光照。
- 用 PBS 将 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）按 1:5,000 稀释，室温避光孵育 10 分钟，对细胞核进行复染。
- 每孔用 0.5 ml PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 从玻片上取下腔室并干燥。每张玻片加入250 µL封片介质进行封片。
- 邻近连接实验
- 制备邻位连接探针。将两种邻位连接探针（分别连接不同寡核苷酸的抗小鼠和抗兔二抗，可在连接溶液中通过添加另外两种寡核苷酸进行连接）用含0.1% Triton X-100和5% NGS的PBS缓冲液按1:5比例混合并稀释，总体积为320 µl，用于一张8孔载片（每平方厘米约40 µl）2室温孵育20分钟。
- 从玻片上移除腔室，加入稀释后的探针。在37 °C湿化孵育箱中孵育1小时。
- 配制连接反应液。将 8 µl 连接酶、64 µl 5 倍连接缓冲液和 248 µl H₂O 混合。2O.
- 轻敲载玻片以去除液体，用1×洗涤缓冲液A（随试剂盒提供）洗涤2次，每次5分钟。
- 加入连接反应液，在37 °C的湿化培养箱中孵育30分钟。
- 配制扩增溶液。将 4 µl 聚合酶、64 µl 5x 扩增缓冲液和 252 µl H₂O 混合。2O. 从这一步开始避免光照。
- 轻敲载玻片去除液体，用1×洗涤缓冲液A洗涤2次，每次2分钟。
- 加入扩增溶液，在37 °C的避光湿化培养箱中孵育100分钟。
- 轻拍载玻片以去除液体，用1×洗涤缓冲液B（试剂盒提供）洗涤2次，每次10分钟。再用0.01×洗涤缓冲液B洗涤1分钟。
- 将载玻片干燥，每张载玻片加入250 µl商品化封片剂（含DAPI）进行封片。
- 免疫细胞化学
- 使用10倍目镜和20倍物镜在显微镜下观察荧光信号，通过CCD相机采集图像。
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结果
图1表明，NF90和RBM3均为核蛋白，仅有少量存在于细胞质中。值得注意的是，RBM3呈现三条不同的阳性条带。其中最小的一条略低于20 kDa，对应RBM3的正确大小（RBM3预测的分子量为17 kDa）。另外两条带的来源仍有待研究。以RBM3为诱饵蛋白进行的共免疫沉淀实验显示，NF90与RBM3的相互作用主要存在于细胞核中，少数存在于细胞质中。共免疫沉淀结果支持了每种单个蛋白的定位。
如图2A所示，NF90和RBM3主要位于细胞核内，但也存在于细胞质中in situ。这两种蛋白在两个区室中均表现出完全共定位。邻近连接实验揭示了NF90与RBM3相互作用的分布模式，该模式与传统免疫细胞化学结果非常相似，在大多数细胞中，相互作用主要发生在细胞核内。仅有少数细胞显示出NF90-RBM3相互作用以细胞质分布为主。
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讨论
两种方法均存在各自的优点与局限性。作为一种相对较新的技术，邻近连接检测法的一个明显优势在于能够揭示单细胞水平的蛋白质-蛋白质相互作用，而非针对一群异质性细胞进行检测。所获得的图像具有高倍数和高分辨率（例如 通过共聚焦显微镜）提供了通过计数单个荧光点进行定量分析的可能性。相比之下，传统的免疫共沉淀技术与蛋白质印迹相结合的方法只能对蛋白条带进行半定量分析，主要原因是难以为免疫沉淀样品确定合适的上样对照。此外，当蛋白质-蛋白质相互作用较弱或瞬时存在时，需要大量生物材料， 例如，细胞或组织，进行共免疫沉淀，或采用带有融合标签的人工过表达系统，以提高检测相互作用的几率。此外，也可使用高灵敏度的检测技术，如质谱分析，以提升实验质量。然而，在起始材料用量方面，邻近连接检测技术具有明显优势。只要抗体质量较高，仅需少量细胞即可完成实验。此外，在组织样本中， 原位 通过邻近连接实验可实现不同组织结构和细胞类型中蛋白质-蛋白质相互作用的可视化，其模式与常规免疫组织化学相似。相比之下，免疫共沉淀技术本身不适合展示蛋白质-蛋白质相互作用的空间分布。
在细...
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（SNSF, 31003A_163305）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma | D6429 | 高葡萄糖’ 4,500 mg/L |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76（NF90/NF110）抗体 | BD Transduction Laboratories | 612154 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000，用于 ICC/PLA 时为 1:100 |
| RBM3 抗体 | ProteinTech | 14363-1-AP | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000，用于 ICC/PLA 时为 1:100 |
| Lamin A/C 抗体 | Cell Signaling Technology | #2032 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Abcam | ab8245 | 用于 WB 时稀释比例为 1:1,000 |
| 正常兔 IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记二抗 | Cell Signaling Technology | #7074 | 用于 WB 时稀释比例为 1:5,000 |
| 抗小鼠 HRP 二抗 | Carl Roth | 4759.1 | 用于 WB 时稀释比例为 1:5,000 |
| Clarity 西部印迹 ECL 显色底物 | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液（4x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE 转膜缓冲液（20x） | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hybond P 0.2 PVDF 膜 | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 孔培养载玻片 | Corning BioCoat | 354632 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| 正常山羊血清（NGS） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L 抗体），Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L 抗体），Alexa Fluor 568 标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA 探针 Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA 探针 Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink 检测试剂 Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink 洗涤缓冲液 荧光 | Sigma | DUO82049 | |
| 含 DAPI 的 Duolink 封片剂 | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| 显微镜 | Olympus | AX-70 | |
| CCD 相机 | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X 光胶片 | Fujifilm | Super RX | |
| 胶片处理机 | Fujifilm | FPM-100A |
参考文献
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
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