使用流式细胞分选与含内参标准品的qPCR进行单细胞基因表达谱分析

摘要

我们介绍一种用于分选单个哺乳动物细胞并量化每个细胞中多达96个目标基因表达水平的方法。该方法包括使用内部qPCR标准品，以实现对转录本绝对拷贝数的估算。

摘要

从细胞群体中进行的基因表达测量可能会掩盖群体内单个细胞之间显著的转录组异质性。单细胞基因表达测量有助于评估基因表达中的噪声作用，识别成对基因表达之间的相关性，并揭示对刺激产生不同反应的细胞亚群。本文描述了一种从组织培养中生长的群体中分离出的单个哺乳动物细胞内检测多达96个基因表达水平的实验流程。通过荧光激活细胞分选（FACS）将细胞分选至裂解缓冲液中，随后对目标mRNA进行逆转录和扩增。然后使用微流控实时PCR仪检测基因表达，该仪器可同时对多达96个样本中的每个样本进行多达96个qPCR检测。我们还介绍了PCR扩增产物标准品的制备与使用方法，以实现对每种转录本绝对数量的估算。与其他单细胞基因表达检测方法相比，该方法能够比RNA FISH检测更多种类的转录本，且成本低于RNA-Seq。

引言

同一细胞群体中的单个细胞对一致的生理刺激可能表现出显著不同的反应^1,2,3,4。细胞群体中遗传差异是导致反应多样性的机制之一，但即使在克隆性细胞群体中，也存在多种非遗传因素可增加反应的变异性。例如，单个蛋白质及其他重要信号分子的水平可在单细胞间存在差异，从而导致下游基因表达谱的差异。此外，基因激活可能以短时间的转录脉冲形式发生^5,6，每次脉冲可能仅产生相对少量的转录本^7,8,9。这种基因激活的随机性可显著促进生物反应的变异性，并在微生物¹⁰以及对生理刺激作出响应的哺乳动物细胞^1,2中提供选择优势。由于遗传和非遗传因素共同导致的变异，单个细胞在刺激下的基因表达谱可能与通过群体反应测量获得的平均基因表达谱显著不同。要确....

方案

1. 预先准备

1. 选择最多 96 个目标基因用于检测其表达水平。
   注意：这些基因中至少应包含一个“看家基因”（如 ACTB 或 GAPDH），该基因在实验所用条件下已知具有相对较高且稳定的表达水平。此基因将用于鉴定分选阳性的孔（步骤 8.1）和扩增的样品（步骤 10.1）。
   注意：在示例实验中，选用已被充分表征的 p53 直接靶基因，这些基因具有多种已知功能^11,14 并选择GAPDH作为内参对照。有关本研究中使用的靶基因和引物序列的完整列表，请参见参考文献11。
2. 鉴定针对目标基因的潜在引物对例如， 使用科学文献或引物设计工具（如 Primer-BLAST）¹⁵. 合成引物并将其保存在储备浓度为 100 μM 在无核酸酶的水中。
   注意：引物长度应为15-25个碱基；扩增产物长度应为90-130个碱基对（bp）；若存在外显子连接区，应跨外显子连接区设计，以降低扩增基因组DNA的可能性；引物的熔解温度应为60 ± 1 °C；且具有极小的二级结构¹⁶这些引物将用于启动逆转录，扩增目标转录本的cDNA，并在基于DNA结合染料的qPCR中检测基因表达。
3. 验证引物。
   1. ....

结果

本方案的总体概述见图1，包括细胞处理、通过FACS分离单个细胞、从单细胞裂解液中构建并进行cDNA文库的预扩增、在分选后的孔中确认单细胞cDNA文库，以及通过qPCR检测基因表达水平。

在进行单细胞分离和基因表达分析之前，必须首先为每个目标基因确定有效的寡核苷酸引物对。图2展示了两种引物质量控制方法的示例。在使用待测引物对进行qPCR后，生成熔解曲线。有效引物产生的熔解曲线应为单一峰（图2A，绿色曲线）。若出现多个峰（图2A，蓝色曲线）或具有明显肩峰的曲线（图2A，红色曲线），则表明存在多个PCR产物，此时应重新设计引物。作为第二种质量控制方法，可通过琼脂糖凝胶电泳直观验证每个测试引物对是否产生唯一且大小正确的条带（图2B）。若出现多个条带或大小不符的.......

讨论

我们介绍了一种从培养的贴壁细胞群体中分离单个哺乳动物细胞，并对每个细胞中约96个基因的表达进行检测的方法。充分的前期准备对该方法的成功实施至关重要。特别是，针对目标转录本设计并验证特异性引物对（步骤1.2–1.3）虽然耗时，但极为关键，因为引物质量直接决定单细胞检测结果的可靠性。一旦获得可靠的引物对，即可用于扩增目标转录本的cDNA；随后将扩增产物等摩尔混合，制备成标准品（步骤1.4）。此步骤至关重要，因为标准品用于估算转录本的绝对拷贝数；标准品应一次性制备，分装保存，并用于后续所有细胞分选和基因表达检测实验。同样，在细胞分选当天，使用低吸附性移液器吸头和微量离心管精确稀释标准品，以制备含有9 µl裂解缓冲液的PCR板（步骤3.7和3.11），尤为关键。校准细胞分选仪（步骤4.2）是另一个关键步骤；必须仔细操作，以确保细胞能够准确落入PCR板中含9 µl裂解缓冲液的指定孔位。

该实验方案可根据多种研究需求进行若干修改。本文重点介绍基于DNA结合染料的qPCR方法，该方法为基因表达定量提供了一种相对经济的手段。然而，这种方法可能产生较高的背景信号，因为任何扩增出的DNA（包括非靶序列.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
高容量cDNA反转录试剂盒（含RNase抑制剂）	赛默飞世尔科技	4374966
Phusion高保真DNA聚合酶	New England BioLabs	M0530S
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Quant-iT 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q33120
2.0 ml 低吸附微量离心管	USA Scientific	1420-2600
DNA悬浮缓冲液	Teknova	T0221
Axygen 0.2 ml 最大回收薄壁 PCR 管	康宁	PCR-02-L-C
GE 96.96 动态阵列 DNA 结合染料样本 & 检测上样试剂盒	Fluidigm	100-3415
HyClone RPMI 1640 培养基	GE Healthcare Life Sciences	SH30027.01
胎牛血清，经认证（美国）	赛默飞世尔科技	16000-044
抗生素-抗真菌素溶液	康宁	30-004-CI
Neocarzinostatin	Sigma	N9162
ELIMINase	Decon Labs	1101
SUPERase-In	赛默飞世尔科技	AM2696
CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒	ThermoFisher	11753500
E. coli DNA	Affymetrix	14380 10 MG
ThermalSeal 封口膜，无菌	Excel Scientific	STR-THER-PLT
BD FACSAria IIu	BD 生物科学
HyClone 胰蛋白酶 0.05%	GE Healthcare Life Sciences	SH30236.01
PBS，1×	康宁	21-040-CV
Falcon 40 µm细胞筛	康宁	352340
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293S
SsoFast EvaGreen Supermix（含低ROX）	伯乐（Bio-Rad）	172-5210
96.96 动态阵列 IFC 基因表达芯片（微流控 qPCR 芯片）	Fluidigm	BMK-M-96.96
IFC 控制器 HX（上样仪）	Fluidigm
BioMark 或 BioMark HD（微流控 qPCR 仪器）	Fluidigm
实时荧光定量 PCR 分析软件	Fluidigm
MATLAB 软件	MathWorks