使用流式细胞分选与含内参标准品的qPCR进行单细胞基因表达谱分析

摘要

我们介绍一种用于分选单个哺乳动物细胞并量化每个细胞中多达96个目标基因表达水平的方法。该方法包括使用内部qPCR标准品，以实现对转录本绝对拷贝数的估算。

摘要

从细胞群体中进行的基因表达测量可能会掩盖群体内单个细胞之间显著的转录组异质性。单细胞基因表达测量有助于评估基因表达中的噪声作用，识别成对基因表达之间的相关性，并揭示对刺激产生不同反应的细胞亚群。本文描述了一种从组织培养中生长的群体中分离出的单个哺乳动物细胞内检测多达96个基因表达水平的实验流程。通过荧光激活细胞分选（FACS）将细胞分选至裂解缓冲液中，随后对目标mRNA进行逆转录和扩增。然后使用微流控实时PCR仪检测基因表达，该仪器可同时对多达96个样本中的每个样本进行多达96个qPCR检测。我们还介绍了PCR扩增产物标准品的制备与使用方法，以实现对每种转录本绝对数量的估算。与其他单细胞基因表达检测方法相比，该方法能够比RNA FISH检测更多种类的转录本，且成本低于RNA-Seq。

引言

同一细胞群体中的单个细胞对一致的生理刺激可能表现出显著不同的反应^1,2,3,4。细胞群体中遗传差异是导致反应多样性的机制之一，但即使在克隆性细胞群体中，也存在多种非遗传因素可增加反应的变异性。例如，单个蛋白质及其他重要信号分子的水平可在单细胞间存在差异，从而导致下游基因表达谱的差异。此外，基因激活可能以短时间的转录脉冲形式发生^5,6，每次脉冲可能仅产生相对少量的转录本^7,8,9。这种基因激活的随机性可显著促进生物反应的变异性，并在微生物¹⁰以及对生理刺激作出响应的哺乳动物细胞^1,2中提供选择优势。由于遗传和非遗传因素共同导致的变异，单个细胞在刺激下的基因表达谱可能与通过群体反应测量获得的平均基因表达谱显著不同。要确定单个细胞在刺激下表现出多大程度的反应变异性，需要采用单细胞分离技术、目标转录本表达水平的检测方法，以及对所得表达数据进行计算分析。

有多种方法可用于检测单细胞中的基因表达，这些方法在成本、检测的转录本数量以及定量准确性方面差异较大。例如，单细胞RNA测序（single-cell RNA-Seq）能够实现广泛的转录本覆盖深度，并可对单个细胞中高表达基因的数千种不同转录本进行定量；然而，达到如此深度测序所需的成本可能过高，尽管该成本仍在持续下降。相比之下，单分子RNA荧光原位杂交（single-molecule RNA fluorescence 原位 单分子RNA原位杂交（smRNA FISH）能够在合理控制每个目标基因检测成本的前提下，对低表达基因的转录本进行精确定量；然而，该方法在单个细胞中可检测的目标基因数量有限。本方案所述的基于定量PCR（qPCR）的检测技术，在上述方法之间提供了一种折中方案。该技术利用微流控实时PCR仪，可同时对最多96个细胞中的多达96种目标转录本进行定量。尽管上述各种方法均需配备相应的硬件设备，但单次qPCR检测的成本相对较低。本方案改编自某微流控实时PCR仪制造商建议的方案（Protocol ADP 41, Fluidigm）。为了在基于PCR的方法中实现对每种转录本绝对拷贝数的估算，我们对该方案进行了扩展，引入了预先制备的目标基因扩增子作为内参对照，可在多个实验中重复使用。

作为该技术的一个示例，本文描述了在MCF-7人乳腺癌细胞中对肿瘤抑制因子p53调控的基因表达水平进行定量分析的方法¹¹。实验中使用一种可诱导DNA双链断裂的化学试剂处理细胞。先前的研究表明，p53对DNA双链断裂的响应在单个细胞中表现出高度异质性，不仅体现在p53蛋白水平上¹²，也表现在不同靶基因的激活模式上¹¹。此外，p53调控超过100个已被充分表征的靶基因，这些基因参与多种下游通路，包括细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老^13,14。由于每个细胞中p53介导的响应既复杂又具有变异性，因此对该系统的分析受益于一种可在单细胞水平同时检测近100个靶基因的方法，如下文所述。通过稍作修改（例如采用不同的单细胞分离与裂解方法），该实验方案可轻松适用于多种哺乳动物细胞类型、转录本及细胞应答的研究。

通过适当的前期准备，按照本方案可在三天内完成一轮细胞分选及基因表达检测。建议时间安排如下：提前选择感兴趣的转录本，鉴定并验证可扩增这些转录本cDNA的引物对，并使用这些引物制备标准品和引物混合液。第1天，在细胞处理后，收集并分选细胞，进行逆转录和特异性靶标扩增，并用外切核酸酶处理样本以去除未掺入的引物。第2天，利用qPCR对分选后的细胞进行质量控制。最后，在第3天，通过微流控qPCR技术测定分选细胞中的基因表达水平。图1总结了所涉及的步骤。

方案

1. 预先准备

1. 选择最多 96 个目标基因用于检测其表达水平。
   注意：这些基因中至少应包含一个“看家基因”（如 ACTB 或 GAPDH），该基因在实验所用条件下已知具有相对较高且稳定的表达水平。该基因将用于鉴定分选阳性的孔（步骤 8.1）和扩增的样本（步骤 10.1）。
   注意：在示例实验中，选用的是已被充分表征的 p53 直接靶基因，这些基因具有多种已知功能^11,14 并选择GAPDH作为内参对照。有关本研究中使用的目标基因和引物序列的完整列表，请参见参考文献11。
2. 鉴定针对目标基因的潜在引物对例如， 利用科学文献或引物设计工具（如 Primer-BLAST）¹⁵合成引物，并以无核酸酶水配制，保持其储存浓度为100 μM。
   注意：引物长度应为15-25个碱基；扩增产物长度应为90-130个碱基对（bp）；若存在外显子连接区，应跨外显子连接区设计，以降低扩增基因组DNA的可能性；引物的熔解温度应为60 ± 1 °C；且应尽量减少二级结构的形成。¹⁶这些引物将用于启动逆转录，扩增目标转录本的cDNA，并在基于DNA结合染料的qPCR中检测基因表达。
3. 验证引物。
   1. 首先，从目标细胞中获取cDNA。根据试剂盒说明书或标准分子生物学方法，使用RNA提取试剂盒从细胞中提取RNA。¹⁷使用随机六聚体，按照逆转录试剂盒的制造商说明或标准方法将RNA逆转录为cDNA¹⁷.
   2. 针对每对引物，根据预混液生产商推荐的反应条件，使用DNA结合染料预混液、正向引物和反向引物，以及上一步获得的cDNA进行qPCR反应。在实时荧光定量PCR仪上运行反应，采用预混液生产商推荐的包含熔解曲线采集的热循环程序。
   3. qPCR反应结束后，将扩增的DNA样本在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳，并按照标准操作流程使用DNA嵌 intercalating 染料对DNA进行可视化检测¹⁷.
   4. 根据标准方案，通过将cDNA（步骤1.3.1中制备）进行系列稀释并绘制标准曲线，确定引物对的扩增效率¹⁶.
      注意：理想的引物对在熔解曲线中应呈现单一且清晰的峰，并在凝胶电泳中于预期位置出现单一条带^16,17 (图2）。如果熔解曲线出现多个峰或“肩峰”，或者凝胶电泳显示多条条带或弥散条带，则表明引物扩增了非靶序列。对于已发现扩增非靶序列的引物，应重新设计，并根据需要重复上述验证步骤。理想的引物对扩增效率应在90–110%之间，且R² 标准曲线的线性相关系数 ≥0.985¹⁶；对效率或R值不符合要求的引物重新设计² 超出这些范围。
4. 使用纯化的DNA扩增子制备标准品。
   1. 对于每一对已验证的引物：
      1. 使用高保真DNA聚合酶，根据聚合酶生产商推荐的引物和模板DNA浓度、反应条件及PCR循环条件，或采用标准PCR方案，从cDNA中扩增目标区域¹⁷.
      2. 在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳分离扩增的cDNA，并使用DNA嵌 intercalating 染料观察条带¹⁷使用洁净的剃刀切下代表扩增产物的条带，并将凝胶片段放入微量离心管中。
      3. 使用标准的凝胶回收方法（如基于琼脂糖酶的提取法）从凝胶中纯化扩增产物¹⁷ 或根据制造商说明使用离心柱型凝胶回收试剂盒。
      4. 使用基于荧光的双链DNA定量试剂盒，按照制造商说明书测定扩增产物的浓度。根据扩增产物序列已知的分子量，将测得的双链DNA浓度除以该分子量，以获得每微升中扩增产物分子的数量。
      5. 在一支2.0 ml低吸附微量离心管中，将2 µl纯化的扩增产物加入适量DNA悬浮缓冲液，使扩增产物的终浓度为5 × 10⁸ 分子/微升
   2. 当所有扩增产物纯化完成后，取每种纯化后的扩增产物各18 µl，加入一个2.0 ml低吸附微量离心管中。加入DNA悬浮缓冲液至总体积为1,800 µl；因此，浓度为 每个 扩增子为 5 x 10⁶ 分子/微升
      注意：该混合物包含已知等摩尔浓度的所有目标基因的cDNA扩增子，将作为单细胞qPCR中的标准品。
   3. 将此“5e6”标准品充分涡旋，于2,000 × g离心10秒，分装至低吸附PCR管中，每管20 µl。将分装样品于-80 °C保存。
5. 制备特异性靶标扩增（STA）引物混合物（10x）。
   1. 在15 ml锥形管中，加入每种100 µM的引物储备液各25 µl（最多192种）。用DNA悬浮缓冲液定容至总体积5,000 µl。
      注意：浓度 每个 该混合物中的引物浓度为 500 nM。每块分选细胞的反应板将使用 105.6 µl 此引物混合物进行反转录及靶标特异性扩增。此处提供的引物混合物体积足以制备 45 块反应板。建议配制足够大的引物混合物体积，以确保仅需配制一次；可根据需要按比例放大体积。
   2. 充分涡旋混匀，分装为每份110 µl，于-20 °C保存。
6. 为用于微流控芯片qPCR，针对每对引物分别配制检测反应混合液。
   1. 在96孔PCR板的每个孔中，加入3.0 µl特定基因的100 µM正向引物、3.0 µl对应的100 µM反向引物、24.0 µl DNA悬浮缓冲液和30.0 µl 2x检测加载试剂。
   2. 涡旋混匀该板，在500 × g下离心10秒，并于-20 °C保存。
7. 创建两个热循环程序：RTSTA（逆转录与特异性目标扩增； 表1）以及 EXOI（核酸外切酶 I 处理； 表2).

2. 处理

1. 根据实验研究的条件，将哺乳动物细胞接种于组织培养皿中，使其在处理时达到所需的汇合度。本研究示例中，每6 cm培养皿接种4 × 10⁵个MCF-7 p53-Venus细胞¹⁸，培养基为含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和250 ng/ml两性霉素B的RPMI培养基。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养两天，直至细胞汇合度达到50%。
2. 根据实验研究要求，对细胞进行处理以建立目标实验条件。本研究示例中，将MCF-7 p53-Venus细胞分别与400 ng/ml新制癌菌素共同孵育3小时、8.5小时、14小时或24小时。

3. 细胞分选裂解缓冲液的制备

注意：制备一块裂解缓冲液板大约需要1小时。建议制备并分装多块板，因为细胞分选效率可能较低，会产生许多未检测到细胞的孔。

1. 用DNA去污染溶液清洁实验台、移液器、试管架、PCR板冷架和手套，以准备进行PCR。
2. 将RNA酶抑制剂原液加入1.5 ml离心管中的无核酸酶水中，稀释至2.64 U/µl。
   注意：这样可将RNA酶抑制剂加入裂解缓冲液中，而无需移取小于1 µl的体积。
3. 通过混合下列所列组分来配制细胞裂解缓冲液 表3.
4. 将92.4 µl细胞裂解缓冲液转移至另一管中；此缓冲液将用于扩增子标准品。
5. 使用低吸附性移液器吸头和微量离心管，分别准备 200 µl 和 500 µl 的溶液 E. coli 用DNA悬浮缓冲液分别将DNA稀释至3.1 pg/µl和6.2 pg/µl。
6. 加入 184.8 µl 浓度为 3.1 pg/µl 的溶液 E. coli 将DNA加入细胞裂解缓冲液中。
   注意： E. coli 载体DNA的作用是扩大非特异性引物结合的可能性范围，从而降低引物二聚化产生PCR产物的可能性。
7. 制备标准品。
   1. 标记六个低吸附微量离心管，分别标注为 5e5、5e4、… 5e0。
   2. 向“5e5”管中加入90 µl DNA悬浮缓冲液。
   3. 加入 90 µl 浓度为 6.2 pg/µl 的溶液 E. coli 将DNA分别加入其余五个试管中。所有试管均需置于冰上。
      注意：在标准品中加入载体DNA可使标准品孔中的总DNA质量与单细胞孔中的总DNA质量相近，从而降低因DNA结合到离心管或移液器吸头而导致标准品浓度受影响的可能性。
   4. 取“5e6”标准品的等分试样（5 × 10⁶）⁶ 每微升分子数的各扩增子（在步骤1.4中制备），从储存中取出。短暂涡旋振荡，短暂离心（500 × g下5秒），以确保液体位于管底。
   5. 使用低吸附枪头，将10 µl浓度为5e6的标准品加入“5e5”管中。短暂涡旋振荡，离心（500 × g，5秒），然后将管子放回冰上。
   6. 从“5e5”管中移取10 µl液体至“5e4”管中。短暂涡旋振荡，离心（500 × g，5秒），然后放回冰上。
   7. 重复进行系列稀释，每支试管均从上一支试管中加入10 µl，直至所有试管中的标准品完成相应稀释。
8. 准备一排12个带盖的PCR管。向每管中加入67 µl“细胞”裂解缓冲液。盖上管盖，必要时短暂离心（500 × g，5秒）。
9. 使用12通道移液器，将PCR管排中的“细胞”裂解缓冲液每管9 µl分别加入PCR板的前7行每一列的孔中（图3).
10. 将7 µl的“标准”裂解缓冲液加入到该板最后一行的每个孔中（图3).
11. 使用低吸附性移液器吸头，根据板图将 2 µl 标准品加入底部每行的各孔中（图3).
    注意：2 µl 的 5 x 10⁰ 每微升分子数标准量相当于10个分子， 等等。
12. 加入 2 µl 浓度为 3.1 pg/µl 的溶液 E. coli 将DNA加入10细胞孔和100细胞孔中；加入2 µl浓度为6.2 pg/µl的溶液 E. coli 将DNA加入无细胞的孔中。
    注意：每个单细胞、10细胞和100细胞孔中含有6.2 pg的 E. coli DNA，约等于单个人类细胞中基因组DNA的质量。每个标准品孔和无细胞孔均含有12.4 pg的 E. coli DNA，约相当于两个人类细胞所含的量。
13. 使用无菌热封膜密封培养板，在500 × g条件下离心5秒，然后将培养板置于4 °C保存，直至细胞准备分选。

4. 细胞分选仪设置

1. 将荧光激活细胞分选仪设置为根据孔板图（图3）向96孔板中分选细胞；H1–H8 和 H11–H12 孔中不应分选任何细胞。
2. 确认细胞分选仪已准确对准，以确保可将细胞分选至PCR板中。
   1. 将分选液流的角度设置为尽可能最小；此设置可提高细胞进入孔底而非撞击孔壁的几率。
   2. 为校准仪器，密封一个空的PCR板，并根据仪器操作说明¹⁹，使用测试液流将PBS液滴“分选”至空板密封膜表面，液滴应落在各孔中心正上方位置。为获得最佳效果，应在整块板的长度和宽度方向上全面验证校准准确性。
   3. 若液滴未落在正确位置，应将密封膜表面的液滴擦拭干净，按照仪器制造商的说明重新校准细胞分选仪，并重复校准过程，直至分选液流中的液滴能够准确沉积。

5. 细胞收获与分选

1. 根据细胞系的特性进行胰蛋白酶消化。例如，对于 MCF-7 细胞，吸除细胞培养基，用 1 ml 0.05% 胰蛋白酶冲洗细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶孵育 5 分钟。
2. 向消化后的细胞中加入 8 ml 细胞培养基，将全部 10 ml 细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，在 400 × g 条件下离心 4 分钟。
3. 吸除上清液，用 PBS + 2% FBS 重悬细胞沉淀。
   注意：较小的重悬体积有助于浓缩细胞，便于细胞分选；对于汇合度为 50% 的 6 cm 培养皿中的细胞，使用 500 µl 重悬体积效果良好。
4. 将细胞悬液转移至 5 ml 流式细胞分析管中，通过 40 µm 滤膜吹打，以去除细胞团块。
5. 在细胞分选前，将含有裂解缓冲液的孔板在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 30 秒，确保液体沉降至孔底。
6. 将含有细胞悬液的管插入细胞分选仪中。打开裂解缓冲液孔板的密封膜，根据孔板图谱并依照细胞分选仪制造商的操作说明，小心地将目标细胞分选至孔板中¹⁹。为确保单细胞以最高纯度被分选，应将仪器设置为“单细胞”模式，并基于前向散射和侧向散射进行标准流式细胞术设门¹⁹。
   注意：在本示例实验中，根据 p53-Venus 荧光信号设门，以分离荧光最强的 15% 单个细胞¹¹。
7. 用新的无菌热封膜密封孔板，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 1 分钟。将孔板放入热循环仪中，运行 RTSTA 程序（见步骤 1.7）。
   注意：此步骤对分选所得细胞的 mRNA 进行逆转录，随后扩增目标转录本的 cDNA。

6. 外切酶处理

1. 通过混合表4中列出的组分配制稀释的外切酶I。准备一排12个带盖的PCR管，每管中加入30.5 µl稀释的外切酶I。盖上管盖后短暂离心（500 × g下离心5秒），确保液体位于管底。
2. 当RTSTA程序结束后，将样品板在500 × g下离心5秒。使用12通道移液器，向板中每个孔加入3.6 µl稀释的外切酶I。
3. 用无菌热封膜密封板子后短暂离心（500 × g下离心5秒）。将板子放入热循环仪中，运行EXOI程序（见步骤1.7）。
   注意：此步骤可降解特异性目标扩增后残留的引物，防止其干扰后续PCR反应。

7. 样品稀释

1. 外切核酸酶处理结束后，向样本板的每个孔中加入 32.4 µl TE 缓冲液；此步骤可作为暂停点，样本可在 -20 °C 下保存数天。

8. 使用 qPCR 进行分选质量控制

注意：由于细胞分选并非完全高效，此步骤对于确定分选板中哪些孔实际接收到细胞是必要的。随后可利用这些样品进行进一步分析。

1. 通过qPCR检测每个样本中管家基因的表达水平。
   1. 根据聚合酶生产商的说明书，使用步骤1.1中选定的管家基因之一的引物，配制900 µl用于96次反应的DNA结合染料qPCR预混液；反应缓冲液、聚合酶、引物的确切浓度 等等。 该反应所需的时间取决于所使用的特定聚合酶。
   2. 将9 µl主混合液分配至96孔PCR板的每个孔中。从样本板中取1 µl样本加入PCR板的对应孔中。
   3. 使用试剂盒制造商推荐的热循环程序，或按照标准程序，在实时荧光定量PCR仪上运行反应板²⁰.
2. 分析qPCR数据²⁰；图4展示了下文所列分选质控步骤中的qPCR数据示例。
   1. 验证无细胞孔的测量结果是否显示基因表达水平较低（背景水平）或完全无表达。
   2. 验证单细胞孔的测量结果是否明显分为两组：一组为基因表达水平较高的阳性样本，另一组为表达水平处于背景值或完全无表达的阴性样本，后者与无细胞孔的结果相似。
      注意：高基因表达的样本代表实际分选的细胞；背景表达的样本应从后续分析中排除。
   3. 验证10细胞孔和100细胞孔的检测结果是否显示比阳性1细胞孔更高的基因表达水平，同时考虑分选效率不足可能导致这些孔中的细胞数量少于预期。
   4. 验证标准孔的测量值在对数空间中呈均匀分布（即， C_t 数值呈均匀分布。
3. 在确定所有阳性单细胞样本后，制作“样本混合物”板图，将阳性单细胞样本映射至新的96孔板中。该板图中应包含八个用于标准品的孔。参见 图5 例如。

9. 使用微流控 qPCR 测量基因表达

注意：本节中每一步操作，移液时仅需按至第一档，以尽量减少试剂中气泡的产生。

1. 打开一排8个PCR管。如果有多块样品板，则再打开第二排8个PCR管，并将管子标记为1-8。此排用于汇集来自多块板的标准品。
2. 在1.5 ml离心管中，将360 µl DNA结合染料qPCR预混液与36 µl DNA结合染料上样试剂混合。短暂涡旋后，在2,000 × g下离心10秒。将该混合液（共396 µl）分装至未标记的8个PCR管中，每管加入48 µl。
3. 使用八通道移液器，将3.3 µl预混液/上样试剂混合物分配至新的96孔PCR板的每个孔中。将此板标记为“样品混合液板”。
4. 针对每一块样品PCR板：
   1. 涡旋震荡板子10秒，并在500 × g下离心10秒。移去封膜，根据板图指示，将每个阳性单细胞样品2.7 µl转移至“样品混合液板”中对应的单细胞孔。
   2. 如果仅有一块样品板，则根据板图将每个扩增后的标准品2.7 µl转移至“样品混合液板”中相应孔位。
   3. 如果有多块样品板，则根据板图将每个扩增后的标准品2.7 µl转移至已标记的PCR管排中对应位置。将当前样品板的标准品加入已存在的标准品中。操作完成后，使用封膜密封样品板。
5. 如果存在多块样品板：
   1. 将含有标准品的PCR管排涡旋10秒，并在2,000 × g下离心10秒。根据板图，从每管混合后的标准品中取2.7 µl转移至“样品混合液板”中对应的孔。
6. 根据板图指示，在NTC孔中加入2.7 µl无核酸酶水。“样品混合液板”密封后，置于4 °C保存，待后续使用。
7. 撕去新的微流控qPCR芯片底部的标签。使用带有帽盖的控制线流体注射器，依次下压每个蓄液池弹簧以松动，并向每个蓄液池注入150–200 µl控制线流体。
8. 将芯片插入加载仪中，运行“Priming”程序。此过程约需20分钟。
9. 完成引物预润后，涡旋并短暂离心震荡已准备好的检测混合液板（步骤1.6制备）和样品混合液板。
10. 使用八通道移液器，根据图6所示示意图，将每种检测混合液4.5 µl转移至微流控qPCR芯片的左侧。移液时需格外小心，避免在孔底产生气泡。完成后，密封检测混合液板并置于-20 °C保存以备后续使用。
11. 根据图6所示示意图，将每种样品混合液4.5 µl转移至微流控qPCR芯片的右侧。将芯片插入加载仪中，运行“Load Mix”程序。此过程约需90分钟。
12. 开启微流控实时PCR仪，启动数据采集软件，并打开光源进行预热。此过程约需20分钟。
13. 当“Load Mix”程序完成后，确认芯片上无横贯线条——此类线条可能提示加样异常。使用透明胶带或实验室胶带小心去除芯片表面的灰尘颗粒。将芯片插入微流控实时PCR仪中，运行数据采集程序。使用分析软件检查结果，并导出数据以供进一步分析。

10. 数据分析

1. 移除那些qPCR扩增曲线显示质量较差的测量结果（即，其扩增曲线不呈现标准的S形扩增曲线特征）²⁰.
2. 移除含有超过30个低质量或零值测量数据的样本，或看家基因表达量（见步骤1.1）明显低于大多数其他样本的样本图7).
3. 对于每个基因，将各样本熔解峰位置的中位数估计为正确的熔解峰位置。若某次测量的熔解峰位置与中位数相差超过1 °C，则将该测量结果剔除不予考虑²⁰.
4. 为每个基因创建标准曲线，以利用电子表格或脚本语言估算每个样本中的 mRNA 拷贝数²⁰.
   注意：本实验中的标准品包含对应于每种目标转录本的 10、100、1,000 或 10,000 个 dsDNA 分子。如果逆转录效率达到理想状态，这些标准品将分别对应于 20、200、2,000 和 20,000 个 mRNA 分子，因为 mRNA 和 cDNA 均为单链。然而实际情况并非如此，因此我们将测量结果表示为以“分子数 × E”为单位的估计值_RT，其中 E_RT 是逆转录的效率。
   1. 对于每个标准孔，确定 m，扩增前ssDNA的分子数（dsDNA分子数的两倍）例如， 20 个分子，200 个分子 等等。).
   2. 对于每个标准孔，确定 C_t qPCR 值²⁰.
   3. 根据以下数值 m 和 C_t，使用以下方程进行线性回归，以生成具有参数的标准曲线 a 和 b 对于每个基因，并找到 R² 拟合优度指标的数值：
      
   4. 根据标准曲线计算 PCR 扩增效率 E 每个基因：
      
      注意：一个值为 E 远大于 1.0（例如， E > 1.1）在物理上不具现实性；一个 R² 线性回归的值远小于1.0（例如， R² < 0.985）表示标准品的检测结果不可靠。这些问题通常表明最低浓度扩增子标准品低于可靠定量的阈值，因此应在进行线性回归时排除最低浓度的标准品。若无法使用至少三个独立的标准品获得满意的线性回归结果，则应舍弃该基因的表达量测定数据。
   5. 如果线性回归是合适的，则使用所得的拟合参数 a 和 b 用于估计每个基因的 mRNA 分子数量 m_est （单位：分子数 × E）_RT) 用于从所测每个单细胞样本中获取相应基因的表达值 C_t 值：
      
   6. 指定任意测量值 m_是 < 1 as m_est = 0。此外，将qPCR中无扩增信号因而无 C_t 值作为 m_est = 0.
      注意：使用 m 进行测量_est 低于回归分析中所用最低标准品或高于最高标准品的数值，可通过标准曲线外推法获得。这些估算值并非一定无效，但应谨慎对待。
5. 可视化单细胞基因表达数据。
   1. 制作蜂群图（Dorn, J. 和 Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37105），其中每个点代表特定细胞中的基因表达水平；示例如下所示 图8.
   2. 绘制小提琴图（Dorn, J., 2012，http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661），其中“小提琴”的宽度表示在分析的细胞群体中特定水平周围基因表达测量值的频率；示例如下所示 图8.
      注意：更复杂的分析可以探究成对基因之间表达关系^21,22 并能够推断基因表达网络。

结果

该实验方案的总体概述见图1，包括细胞处理、通过FACS分离单细胞、从单细胞裂解液中构建并进行cDNA文库的预扩增、在分选后的孔中确认单细胞cDNA文库，以及通过qPCR检测基因表达水平。

在进行单细胞分离和基因表达分析之前，必须首先为每个目标基因确定有效的寡核苷酸引物对。图2展示了两种引物质量控制方法的示例。在使用待测引物对进行qPCR后，生成熔解曲线。有效引物产生的熔解曲线应呈现单一峰（图2A，绿色曲线）。若出现多个峰（图2A，蓝色曲线）或具有明显肩峰的曲线（图2A，红色曲线），则表明存在多个PCR产物，此时应重新设计引物。作为第二种质量控制方法，可通过琼脂糖凝胶电泳直观验证每个测试引物对是否产生唯一且大小正确的条带（图2B）。若出现多个条带或大小不...

讨论

我们介绍了一种从培养的贴壁细胞群体中分离单个哺乳动物细胞，并对每个细胞中约96个基因的表达进行检测的方法。充分的前期准备对该方法的成功实施至关重要。特别是，针对目标转录本设计并验证特异性引物对（步骤1.2–1.3）虽然耗时，但极为关键，因为引物质量直接决定单细胞检测结果的可靠性。一旦获得可靠的引物对，即可用于扩增目标转录本的cDNA；随后将扩增产物等摩尔混合，制备成标准品（步骤1.4）。此步骤至关重要，因为标准品用于估算转录本的绝对拷贝数；标准品应一次性制备，分装保存，并用于后续所有细胞分选和基因表达检测实验。同样，在细胞分选当天，使用低吸附性移液器吸头和微量离心管精确稀释标准品，以制备含有9 µl裂解缓冲液的PCR板（步骤3.7和3.11），尤为关键。校准细胞分选仪（步骤4.2）是另一个关键步骤；必须仔细操作，以确保细胞能够准确落入PCR板中含9 µl裂解缓冲液的指定孔位。

该实验方案可根据多种研究需求进行若干修改。本文重点介绍基于DNA结合染料的qPCR方法，该方法为基因表达定量提供了一种相对经济的手段。然而，这种方法可能产生较高的背景信号，因为任何扩增出的DNA（包括非靶序列...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
高容量cDNA反转录试剂盒（含RNase抑制剂）	赛默飞世尔科技	4374966
Phusion高保真DNA聚合酶	New England BioLabs	M0530S
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Quant-iT 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q33120
2.0 ml 低吸附微量离心管	USA Scientific	1420-2600
DNA悬浮缓冲液	Teknova	T0221
Axygen 0.2 ml 最大回收薄壁 PCR 管	康宁	PCR-02-L-C
GE 96.96 动态阵列 DNA 结合染料样本 & 检测上样试剂盒	Fluidigm	100-3415
HyClone RPMI 1640 培养基	GE Healthcare Life Sciences	SH30027.01
胎牛血清，经认证（美国）	赛默飞世尔科技	16000-044
抗生素-抗真菌素溶液	康宁	30-004-CI
Neocarzinostatin	Sigma	N9162
ELIMINase	Decon Labs	1101
SUPERase-In	赛默飞世尔科技	AM2696
CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒	ThermoFisher	11753500
E. coli DNA	Affymetrix	14380 10 MG
ThermalSeal 封口膜，无菌	Excel Scientific	STR-THER-PLT
BD FACSAria IIu	BD 生物科学
HyClone 胰蛋白酶 0.05%	GE Healthcare Life Sciences	SH30236.01
PBS，1×	康宁	21-040-CV
Falcon 40 µm细胞筛	康宁	352340
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293S
SsoFast EvaGreen Supermix（含低ROX）	伯乐（Bio-Rad）	172-5210
96.96 动态阵列 IFC 基因表达芯片（微流控 qPCR 芯片）	Fluidigm	BMK-M-96.96
IFC 控制器 HX（上样仪）	Fluidigm
BioMark 或 BioMark HD（微流控 qPCR 仪器）	Fluidigm
实时荧光定量 PCR 分析软件	Fluidigm
MATLAB 软件	MathWorks