肺组织驻留的免疫细胞，包括人类的树突状细胞（DCs），在防御吸入性病原体和过敏原方面至关重要。然而，由于人类肺组织来源稀少，相关研究受到限制。本研究提供了处理人类黏膜支气管内活检样本的实验方案，可用于通过免疫组织化学和流式细胞术研究肺部树突状细胞。
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本文内容
摘要
摘要
肺部持续暴露于外部环境中，该环境除了含有无害颗粒外，还包含病原体、过敏原和毒素。为了维持免疫耐受或在必要时诱导免疫应答，免疫系统必须恰当地处理吸入的抗原。肺树突状细胞（DCs）在维持精细平衡方面至关重要，即在需要时启动免疫反应，同时避免因过度炎症反应对肺组织造成附带损伤。尽管目前对人血液中免疫细胞（如DCs）的表型和功能已有较为深入的理解，但对于这些细胞在肺等较难获取组织中的认知仍十分有限，原因是人体肺组织样本的研究，尤其是来自健康个体的样本，极为稀少。本研究提出一种策略，用于对接受支气管镜检查并获取支气管内活检样本的健康人肺组织驻留DCs进行详细的时空分布和表型特征分析。每个个体可采集多个微小活检样本，随后可用于超薄切片包埋或酶消化，以进行高阶流式细胞术分析。所述方案已优化，旨在从小份组织样本中获取最大信息量，而在稳态条件下，这些样本中DCs的频率本就较低。尽管本研究聚焦于DCs，但所描述的方法可直接拓展至肺黏膜组织中其他感兴趣的（免疫）细胞。此外，这些方案也可直接应用于患有肺部疾病患者的样本，例如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、结节病或肺癌患者，其诊断过程中通常包含支气管镜检查。
引言
肺部持续与外部环境接触，极易暴露于无害颗粒和具有致病能力的微生物。因此，免疫系统必须对入侵的病原体产生强有力的免疫应答，但同样重要的是，需对不会引发疾病的吸入性抗原维持免疫耐受。为了实现有效的免疫监视，呼吸系统内分布着由多种免疫细胞构成的网络，其中包括树突状细胞（DCs）。DCs 是专业的抗原呈递细胞，具有激活初始T细胞的独特能力。在人体肺部，定居的DCs遇到抗原后，会对其进行加工处理，并将其转运至肺引流淋巴结，以呈递给T细胞并激活T细胞1,2,3。
在人类免疫系统中，树突状细胞（DCs）可分为多个亚群，其功能各不相同但存在重叠：包括CD1c+和CD141+髓系树突状细胞（MDCs）以及CD123+浆细胞样树突状细胞（PDCs）4,5。尽管目前关于人类DCs的大部分详细知识来源于血液研究，但现已明确人类肺脏中也存在稀有的DC亚群，具有刺激T细胞的能力6,7,
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方案
注意：本研究已获得乌默奥地区伦理审查委员会的批准å瑞典
1. 对人体进行支气管镜检查以采集支气管内活检样本
- 向所有参与者获取知情同意书。
- 支气管镜检查前30分钟，给予受试者口服咪达唑仑（4–8 mg）和静脉注射格隆溴铵（0.2–0.4 mg）。使用利多卡因对喉部和支气管进行局部麻醉。让受试者用约3 ml的4%利多卡因含漱，并通过喉部注射器将3 ml利多卡因喷洒于舌根和喉部。再使用8–10次利多卡因喷雾进一步优化局部麻醉效果。此步骤应在受试者坐位时进行。
- 让受试者取仰卧位，通过塑料咬口器经口插入纤维支气管镜。经支气管镜使用专用喷雾导管对远端气管和支气管完成局部麻醉，此处使用约5–10 ml的2%利多卡因。
- 使用带窗活检钳从主隆突及主支气管分叉处采集6–9份支气管黏膜活检样本（图1）。支气管镜检查结束后、离院前，让受试者休息2–4小时，并提供清淡饮食。
2. 将活检组织包埋于甲基丙烯酸羟乙酯（GMA）树脂中
注意：GMA 免疫染色方案最初由南安普顿大学组织化学研究组开发17。
- 固定：进行免疫组织化学染色时，将活检组织从镊子上取下，直接放入含有 3 ml 冰冷无....
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结果
目前针对人类呼吸道组织驻留免疫细胞（包括树突状细胞）的研究较为有限，主要原因是手术切除或完整的肺组织样本来源稀少。本文概述了一种通过健康志愿者的支气管内活检（EBB）获取肺组织的微创方法，并介绍了利用免疫组织化学或流式细胞术分析组织中免疫细胞的实验方案。
健康志愿者接受了支气管镜检查，方法如前所述19,20。使用带孔活检钳（图 1A）从每位受试者的主隆突及主支气管分支部位采集6至9块1–2 mm3的支气管黏膜活检组织。其中两块活检组织包埋于GMA中，随后用于免疫组织化学分析，以提供空间分布信息。其余活检组织经酶消化处理，获得单细胞悬液，并通过多色流式细胞术进行分析，从而实现对稀有细胞亚群的精细表征（图 1B）。
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讨论
本文介绍了如何利用支气管镜检查期间采集的支气管黏膜活检样本，通过免疫组织化学和流式细胞术对健康人体肺组织驻留型树突状细胞（DCs）进行详细的定位及表型特征分析。下文将详细讨论该实验方案中的关键步骤。
本实验方案的关键步骤
切片与免疫组织化学：不使用活检组织块时，必须将其保存在 -20 °C（步骤 2.5）。组织块若温度过高可能会变软，导致切片质量下降。此外，将组织块保存在 -20 °C 有助于保护抗原位点，从而在免疫组织化学染色中获得更佳的染色效果。
切片与免疫组织化学：在对GMA包埋的活检组织进行切片时，准备3-4个盛有氨水的容器以用于漂浮切片较为方便。当取走一张切片后，务必立即用一张新切片替换（步骤3.4），以确保该切片再次被处理时已在氨水中漂浮了适当的时间（约45-90秒），这有助于抗原暴露及后续的免疫组织化学染色。以这种方式切割2 µm厚的切片还可实现连续切片，意味着同一个细胞有可能被不同的细胞表面或细胞内标志物染色。切片过程中切勿触碰玻璃刀刃口，因其极易受损。若刀面有.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨向为本研究提供临床样本的志愿者表示感谢。同时，我们感谢乌meå大学医院（Norrlands universitetssjukhus）公共卫生与临床医学系内科/呼吸内科的工作人员，他们负责收集了所有临床样本。
本研究得到了瑞典研究理事会、瑞典心脏-肺基金会、瑞典战略研究基金会以及卡罗林斯卡学院向 AS-S 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>支气管镜检查 | |||
| 支气管镜 BF1T160 | 奥林巴斯 | BF1T160 | |
| 光源 | Olympus | Exera CV-160 | |
| 带窗镊子 | Olympus | FB21C | 用于获取活检样本 |
| 咬合垫 | Conmed | 1429 | 20 mm × 27 mm |
| 葡萄糖 25% | 500 ml 静脉注射 | ||
| 格隆溴铵 0.2 mg/ml | 静脉注射。防止黏液/唾液分泌 | ||
| 口服咪达唑仑混合液 1 mg/ml | 可用于额外放松 | ||
| 利多卡因，40 mg/ml | 口腔与咽喉给药 / 含漱法 | ||
| 利多卡因 100 mg/ml 喷雾 | 咽后壁给药 | ||
| 利多卡因 20 mg/ml 喷雾 | 通过支气管镜给药至气道 | ||
| <强>GMA 处理与包埋 | |||
| 玻璃瓶 | 5 ml | ||
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| 4 型分子筛 Å | Alfa Aesar | 88120 | 直径3-4毫米的颗粒 |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml 丙酮 |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml 丙酮 |
| 聚乙烯平膜 TAAB 包埋胶囊 | TAAB 实验室 | C094 | 500个 8毫米直径 聚乙烯 平底胶囊 |
| 胶囊固定器 | TAAB 实验室 | C054 | 可容纳25个8毫米胶囊 |
| JB-4 GMA 包埋试剂盒 | Polysciences | 00226 | 包含 JB-4 溶液 A（0026A-800）、JB-4 溶液 B（0026B-3.8）、过氧化苯甲酰（02618-12） |
| 苯甲酸甲酯 | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| 含湿度指示剂的硅胶 | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 毫米 |
| <强>GMA切片 | |||
| 载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 10143562CEF | 切边，磨砂端 |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 工作溶液按1:10稀释 |
| 用于超薄切片的载玻片条 | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 洗涤液（0.1% Tween20） |
| LKB 7800B 制刀机 | LKB | ||
| 胶囊分离器 | TAAB 实验室 | C065 | |
| 碳钢单刃刀片 | TAAB 实验室 | B054 | |
| 副 | |||
| 氨水，25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml 加入 1 L 中，1:500（0.05%） |
| 切片机 | Leica | Leica RM 2165 | |
| 光源 | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| 带摆臂支架的显微镜 | Leica | Leica MZ6 | |
| <强>GMA免疫组织化学 | |||
| 金刚石笔 | Histolab | 5218 | |
| 30%过氧化氢溶液 | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | 罗氏 | 10708976001 | |
| 氯化钠 | VWR 化学品 | 27810.295 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore | 82-045-2 | 诊断级前白蛋白 BSA |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| 抗人CD45抗体 | BioLegend | 304002 | 小鼠单克隆抗体，克隆号 HI30，同种型 IgG1k。工作浓度为 500 ng/ml |
| 抗人CD1a抗体 | AbD Serotec | MCA80GA | 小鼠单克隆抗体，克隆号 NA1/34-HLK，同种型 IgG2a。工作浓度为 10 µg/ml |
| 小鼠单克隆IgG1同型对照 | Abcam | ab27479 | |
| 小鼠单克隆IgG2a同型对照 | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite 标准试剂盒 | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）过氧化物酶底物试剂盒 | Vector Labs | SK-4200 | |
| 迈耶苏木精 | HistoLab | 01820 | |
| 永久性水溶性封片剂 | AbD Serotec | BUF058C | |
| 干燥箱 | |||
| DPX 永久封片液 | VWR | 360292F | |
| 光学显微镜 | Leica | Leica DMLB | |
| 显微镜相机 | Leica | Leica DFC 320 | |
| 分析软件 | Leica | Leica Qwin V3 | |
| <强>酶消化 | |||
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| 胶原酶II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 罗氏 | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 镊子 | |||
| 平台摇床 | 授款工具 | PMR-30 | |
| 50 ml 离心管 | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| <强>流式细胞术 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| LIVE/DEAD Aqua 可固定死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II 流式细胞仪 | BD | 流式细胞仪 | |
| FlowJo | FlowJo | 用于分析的软件 |
参考文献
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. ....
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