本方案描述了一种可扩展的个体梳理行为检测技术 果蝇 可产生可靠且定量的数据，用于测量理毛行为。该方法基于比较在设定时间段内未理毛动物与已理毛动物体表染料累积量的差异。
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本文内容
摘要
摘要
果蝇 梳理行为是一种复杂的多步骤运动程序，需要前肢和后肢的协调运动。本文介绍了一种梳理行为检测实验方案及新型实验舱设计，该设计成本低廉且可扩展，适用于小规模或大规模研究 果蝇 梳理行为。将亮黄色染料均匀地涂抹在果蝇全身，随后将其放入实验腔室，使其有时间通过自身梳理行为清除体表染料。之后将果蝇转移至定量体积的乙醇中，以溶解残留染料。测定并记录梳理组与非梳理组果蝇染料-乙醇样品的相对光谱吸光度。该方案可获得单只果蝇染料累积量的定量数据，便于在样本间进行平均值计算与比较，从而支持针对突变体动物研究或神经回路操控实验中梳理能力的高效评估。该方法操作高效，兼具灵活性与可扩展性。本文展示了该实验流程，以及野生型与突变体果蝇之间的比较数据。 果蝇 1型多巴胺受体（DopR).
引言
梳理行为在 黑腹果蝇 (D. melanogaster ) 是一种涉及多个独立运动程序协调的稳健先天行为1果蝇会清理其身体上的灰尘、微生物及其他病原体，这些物质可能抑制其正常生理功能（如视觉和飞行），或引发显著的免疫挑战。在感知和响应机械刺激时2 和免疫激活3，果蝇会反复地将它们的腿相互摩擦，或在身体特定区域上摩擦，直至该区域被充分清洁，随后 grooming 行为转移至身体的其他部位。果蝇的 grooming 动作以明显的动作序列进行，且大多遵循刻板的模式。1,4一种行为层级在梳理信号的优先排序中显现出来。已鉴定出相关的神经回路和活动模式，支持这样一种模型：位于层级顶端的梳理程序首先发生，并抑制来自后续被梳理身体区域的并行信号5优先级最高的是头部，其次是腹部、翅膀，最后是胸部5.
grooming 程序在 D. melanogaster 是研究神经回路、调节性分子信号和神经递质的理想系统。例如，神经纤维瘤蛋白功能的受损
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方案
1. 准备
- 准备一个移液器，用于将活体 Drosophila 从培养管转移到清洁行为室。使用移液器可将清醒的果蝇转移至行为观察室，以确保麻醉不会影响后续的行为观察。
- 使用剪刀剪取一段长1.5英尺、内径⅛英寸、外径¼英寸的Tygon管。将一个1 mL一次性移液枪头的尖端剪去至少1英寸。取一块1 cm²的网筛（孔径0.196英寸），覆盖在剪过的枪头尖端。
注：大多数1 mL枪头在包装盒中均有刻度线指示枪头插入位置，通常可沿该刻度线剪切。 - 将一个新的1 mL移液枪头紧密套在网筛/已剪枪头之上，观察网筛在两个枪头之间形成紧密屏障。新枪头内部构成果蝇的暂存腔室。
- 将新移液枪头的最尖端剪除，以扩大开口，使其足以允许单只果蝇通过。孔径应大致与清洁行为室的孔径匹配（直径约1.5–2 mm）。
- 将嵌套好的双层枪头紧密安装到Tygon管的一端，将枪头推入管中，确保连接紧密，以便产生负压。
- 在管子的另一端，剪去一个200 μL移液枪头的尖端，并将其较窄的一端插入Tygon管中。此端为移液器的“口吸”端。
- 使用剪刀剪取一段长1.5英尺、内径⅛英寸、外径¼英寸的Tygon管。将一个1 mL一次性移液枪头的尖端剪去至少1英寸。取一块1 cm²的网筛（孔径0.196英寸），覆盖在剪过的枪头尖端。
- 准备染料分装管。在已去重的称量纸上称取约5 mg的亮黄色染料（Brilliant Yellow dye），将粉末倒入0.6 mL微量离心管中，并拧紧管盖。
注：建议在分装过程中佩戴丁腈手套，....
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结果
梳理行为实验可提供定量数据，用于评估果蝇在设定的梳理时间（30分钟）后体表残留染料的相对量，从而反映其行为表现。图1展示了滑动式梳理实验装置的设计及实验主要步骤的示例图像。果蝇在染料存在下通过涡旋染尘后，会立即在体表聚集大量染料（图2d, 2e）。染尘后的果蝇在实验结束后体表染料的残留量存在一定范围的变化（图2f, 2g）。因此，将残留染料溶于乙醇（EtOH）并测定各样本的吸光度，可对果蝇的梳理能力进行可重复且高度定量的评估。
在本项关于 DopR 调控后足梳理行为的研究中，我们将强低效等位突变体（图3a, 3b）和 DopR 基因缺失突变体的梳理行为表现与野生型品系进行了比较（图3c, 3d）。DopR 突变体保留的染料显著多于野.......
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讨论
梳理实验相对简单直接，但需提醒实验人员特别注意以下问题。在加入果蝇和染料后，通过拧紧上下板的螺丝以确保装置密封严密，这是获得可重复结果的关键。亮黄色染料颗粒极为细小，若连接处不严密，染料会从检测室边缘逸出。每个孔中染料含量的不一致会显著影响梳理行为的定量结果，因为不均匀的染料附着将增加数据变异性和梳理事件的假阳性率。此外，我们建议实验人员注意在30分钟梳理期间放置梳理检测室的环境条件。温度、光照、一天中的时段以及湿度等环境因素的稳定性，对实验结果的一致性至关重要。 果蝇 行为学实验。将梳理行为实验箱置于小型培养箱内，以尽量减少干扰性或可变的实验室环境，有利于实验结果的最佳可重复性，但其他空间布局也可取得成功。
关于染料积累的测量，我们观察到该染料可穿透乳胶手套，因此在处理和称量粉尘时，建议使用腈类手套。注意不要将粉尘广泛扩散到实验台表面，因为它容易污染衣物，并可能污染实验台面或设备。建议将实验限定在特定区域和特定的果蝇操作台/CO2 垫上，以控制染料暴露。我们还建议实验人员务必使用对紫外光透明的96孔板。亮黄染料在397 nm处的吸收峰接近紫.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon 和 Rose Hedreen 在测试和建立本方法及腔室设计初期所做出的工作。感谢 Kelly Tellez 和 Graham Buchan 对稿件的阅读与编辑。感谢 Andrew Seeds 和 Julie Simpson 的开创性工作，以及他们关于使用 Brilliant Yellow 染料（Sigma）的建议与支持。 本研究部分由 Mary E. Groff 外科与医学研究及教育慈善信托基金、Bronfman 科学中心以及 Hellman 学者项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高弹性Tygon PVC透明管 | McMaster-Carr | 5229K54 | 1/8"，OD 1/4"，与微量移液器吸头和筛网一起用于构建口吸式移液装置 |
| 微量移液器吸头（1 mL 和 200 μL） μL | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| 尼龙网筛，2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | 用于构建梳理室和口吸管 |
| Dumont #5 镊子 | Roboz 外科手术器械 | RS-5050 | |
| 亮黄色染料 | Sigma-Aldrich | 201375-25G | 处理本产品时，建议佩戴腈类手套 |
| 涡旋振荡器 | Fisher Scientific | 12-812 | 设定为 "触碰" |
| 乙醇 | 卡罗来纳生物供应公司 | 86-1282 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL 微型离心管 | VWR International | 20170-293 | 试管可在连续的检测中重复使用 |
| 紫外96孔板 | 康宁 | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX 酶标仪 | BioTek | 需要下载目录以获取产品编号 | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 微孔板读板仪与成像软件 | BioTek | ||
| Microsoft Excel | 微软 | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| 果蝇培养箱 | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" 丙烯酸塑料 | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 颗坚果 | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 × 1" 六角头螺钉 | McMaster-Carr | 92185A199 | 底板需要用这种尺寸的螺丝进行敲击固定 |
| 8 - 32 x 1/2" 六角头螺钉 | McMaster-Carr | 92185A194 | 顶部第二块板需要轻敲 |
| 2 - 56 3/8" 平头十字槽机螺钉 | McMaster-Carr | 91500A088 | 这些将两块中间板固定在一起 |
| 0.175" 编号，1/4" OD，0.34" 铝管 | McMaster-Carr | 92510A044 | 自行生产；所列产品尺寸大致相同，适用于8号螺丝。 这些结构作为1的鞘状物" 螺丝并将六角帽从顶板表面略微抬高 |
参考文献
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
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重印与许可
