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果蝇梳理行为的量化分析

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DOI：

10.3791/55231

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2017年7月19日

 ,  , 
1Department of Biology, Williams College

本文内容

摘要

本方案描述了一种可扩展的个体梳理行为检测技术 果蝇 可产生可靠且定量的数据，用于测量理毛行为。该方法基于比较在设定时间段内未理毛动物与已理毛动物体表染料累积量的差异。

摘要

果蝇 梳理行为是一种复杂的多步骤运动程序，需要前肢和后肢的协调运动。本文介绍了一种梳理行为检测实验方案及新型实验舱设计，该设计成本低廉且可扩展，适用于小规模或大规模研究 果蝇 梳理行为。将亮黄色染料均匀地涂抹在果蝇全身，随后将其放入实验腔室，使其有时间通过自身梳理行为清除体表染料。之后将果蝇转移至定量体积的乙醇中，以溶解残留染料。测定并记录梳理组与非梳理组果蝇染料-乙醇样品的相对光谱吸光度。该方案可获得单只果蝇染料累积量的定量数据，便于在样本间进行平均值计算与比较，从而支持针对突变体动物研究或神经回路操控实验中梳理能力的高效评估。该方法操作高效，兼具灵活性与可扩展性。本文展示了该实验流程，以及野生型与突变体果蝇之间的比较数据。 果蝇 1型多巴胺受体（DopR).

引言

梳理行为在 黑腹果蝇 (D. melanogaster ) 是一种涉及多个独立运动程序协调的稳健先天行为1果蝇会清理其身体上的灰尘、微生物及其他病原体，这些物质可能抑制其正常生理功能（如视觉和飞行），或引发显著的免疫挑战。在感知和响应机械刺激时2 和免疫激活3，果蝇会反复地将它们的腿相互摩擦，或在身体特定区域上摩擦，直至该区域被充分清洁，随后 grooming 行为转移至身体的其他部位。果蝇的 grooming 动作以明显的动作序列进行，且大多遵循刻板的模式。1,4一种行为层级在梳理信号的优先排序中显现出来。已鉴定出相关的神经回路和活动模式，支持这样一种模型：位于层级顶端的梳理程序首先发生，并抑制来自后续被梳理身体区域的并行信号5优先级最高的是头部，其次是腹部、翅膀，最后是胸部5.

grooming 程序在 D. melanogaster 是研究神经回路、调节性分子信号和神经递质的理想系统。例如，神经纤维瘤蛋白功能的受损6，缺失 黑腹果蝇 脆性X智力低下蛋白（dfmr1)7，以及双酚A（BPA）的暴露8 所有这些都会导致过度理毛及其他行为，这些行为分别类似于人类神经纤维瘤病、脆性X综合征、自闭症谱系障碍以及注意缺陷多动障碍（ADHD）的特定症状。理毛行为在不同突变品系间也可表现出差异性的习惯化。2，使该运动程序可用于行为可塑性的研究。可通过该模型模拟的神经学现象范围广泛 果蝇 需要一种新的比较方法来测量果蝇自我清洁的能力。

研究表明，囊泡单胺转运蛋白的协同作用以及多巴胺和其他生物源性胺类在体内的相对丰度共同介导了果蝇的理毛行为9,10。在去头果蝇中，章胺和多巴胺可刺激产生相似程度的后腿理毛活动，而章胺的前体物质酪胺也能引发一定程度的理毛行为，但强度较弱7。在D. melanogaster中已鉴定出四种多巴胺受体11,12,13,14。通过使用本实验方案中所述的理毛行为检测方法，我们确定了I型多巴胺受体DopR（DopR, dDA1, dumb）在后腿理毛行为中发挥重要作用15。

通过观察动物在全身涂抹示踪染料或荧光粉尘后清洁自身的程度，可间接量化其理毛行为5,16。残留在体表的粉尘可作为整体行为的相对指标。在给予充分理毛时间后仍残留粉尘的果蝇，可能表现出特定的理毛行为缺陷。随着理毛行为研究的不断深入，实验方案已逐步纳入多种技术手段，例如通过断头后对颈部连接神经施加药理学处理10、机械刺激刚毛以诱发理毛反应2，以及对行为进行视频记录15。通过直接视觉观察并手动记录特定理毛行为的发生频率和持续时间，可简便地开展对理毛行为的直接研究4。

我们设计了一种包含十五个孔的梳理行为实验舱，可通过3D打印机或激光切割机制作，其设计蓝图可供复制15。该设计采用两块连接的中央平板，其上的孔洞对齐，并由网状结构分隔；另配有可滑动的顶部和底部平板，分别用于装载果蝇和/或染料。在允许沾有粉末的果蝇进行一段时间的梳理后，将其放入乙醇中以溶解染料，并在染料的吸收波长下测定该溶液的吸光度。可使用酶标仪对多个样本进行平行检测，或使用单通道分光光度计检测单个样本。该方法最大限度地减少了操作过程中引入的误差，并使得梳理行为检测能够在更小规模、更具成本效益的条件下进行。本方法源自Julie Simpson和Andrew Seeds开创的技术，并进行了改进；原始方法使用带有加热元件的较大尺寸梳理舱，用于温度敏感神经回路的操作5。以下实验方案展示了对果蝇全身梳理行为的定量分析，同时也介绍了对个体身体部位染料积累量进行定量的替代方法。我们还提供了野生型（WT）与DopR突变体之间的示例比较数据，以及用于计算梳理行为简单性能指数的方法。

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方案

1. 准备

  1. 准备一个移液器，用于将活体 Drosophila 从培养管转移到清洁行为室。使用移液器可将清醒的果蝇转移至行为观察室，以确保麻醉不会影响后续的行为观察。
    1. 使用剪刀剪取一段长1.5英尺、内径⅛英寸、外径¼英寸的Tygon管。将一个1 mL一次性移液枪头的尖端剪去至少1英寸。取一块1 cm²的网筛（孔径0.196英寸），覆盖在剪过的枪头尖端。
      注：大多数1 mL枪头在包装盒中均有刻度线指示枪头插入位置，通常可沿该刻度线剪切。
    2. 将一个新的1 mL移液枪头紧密套在网筛/已剪枪头之上，观察网筛在两个枪头之间形成紧密屏障。新枪头内部构成果蝇的暂存腔室。
    3. 将新移液枪头的最尖端剪除，以扩大开口，使其足以允许单只果蝇通过。孔径应大致与清洁行为室的孔径匹配（直径约1.5–2 mm）。
    4. 将嵌套好的双层枪头紧密安装到Tygon管的一端，将枪头推入管中，确保连接紧密，以便产生负压。
    5. 在管子的另一端，剪去一个200 μL移液枪头的尖端，并将其较窄的一端插入Tygon管中。此端为移液器的“口吸”端。
  2. 准备染料分装管。在已去重的称量纸上称取约5 mg的亮黄色染料（Brilliant Yellow dye），将粉末倒入0.6 mL微量离心管中，并拧紧管盖。
    注：建议在分装过程中佩戴丁腈手套，因为某些乳胶手套对染料具有渗透性。
  3. 对实验中所有样品重复步骤1.2）（每个行为室中的每只果蝇各需一管）。
  4. 准备乙醇（EtOH）管：用移液器向1.5 mL微量离心管中加入 1 mL 100% EtOH。根据基因型或实验条件标记各管。
  5. 对实验中所有样品重复步骤1.4）（每个行为室中的每只果蝇各需一管）。盖好EtOH管并保存，用于清洁行为实验的后续步骤。同时至少准备一个“空白”样品，仅含1 mL EtOH而不放入果蝇，作为阴性对照。
  6. 通过旋紧滑动顶板（带较小孔）来组装每个清洁行为室，但暂不安装底板（带较大孔），以便后续加入染料。
  7. 将每个所需的清洁行为室平放在桌面上，顶板朝下放置。果蝇进入侧朝下。
  8. 通过轻敲装有5 mg亮黄色染料的分装管，将染料加入每个行为室中，使染料落在目标孔位上方的室体表面。轻敲行为室，确保所有染料颗粒穿过网筛并落至顶板上。
  9. 将底板旋紧到每个行为室上，确保锥形孔的较宽端朝外，且孔位不覆盖在孔井上方。牢固旋紧底板，防止其滑动或释放染料。
  10. 将行为室翻转过来，并在桌面上轻敲数次，使染料穿过网筛并沉积在底板上。
  11. 将行为室的顶板滑动至“开启位置”，使小孔与十五个孔井对齐，从而允许将果蝇分别引入各个独立孔井中。

2. 果蝇染色与梳理行为

  1. 通过轻轻吸吮吸虫器的一端（如同使用吸管）将一只果蝇吸入吸虫器口中。通过轻轻吹气，并将开口对准目标位置，将果蝇释放到指定位置。
  2. 将每只果蝇分别吸入实验所用的各个孔中。加载完一个孔后，滑动顶板使果蝇被困在腔室内，并在加载整个装置期间用胶带封住该孔的开口，以防止在加载其他孔时果蝇逃逸。若多个果蝇被吸入同一孔中，请保持该开口敞开，直至仅剩一只果蝇。
  3. 当所有需要的孔均装入果蝇后，翻转装置，使底板朝上，以便染料颗粒可通过网孔下落并覆盖果蝇体表。
  4. 拧紧螺丝以牢固固定顶板和底板，并将装置置于涡旋振荡器上振荡4秒，使果蝇均匀沾染染料。
  5. 将装置（顶板朝下）轻击桌面两次，使染料穿过网孔落至另一侧。随后翻转装置（顶板朝上），再轻击两次，确保染料沉降到底部腔室的底部表面，远离被限制在顶部腔室中的果蝇。
  6. 对于不允许进行清洁行为的对照组果蝇，立即进入本方案的第3步。对于将完成检测的果蝇，请继续执行步骤2.7。
  7. 将装置平放在桌面或台面上，顶板朝上，静置30分钟，使果蝇有足够时间进行清洁行为。将装置置于无噪音和振动干扰的环境中，以确保所有清洁实验的环境条件恒定（包括光照强度、湿度和温度）。使用室温或25 °C、具备湿度控制功能的台式培养箱为最佳选择。

3. 样品制备与吸光度分析

  1. 保持染色室水平，顶部盖板朝上，轻轻拧开底部盖板并将其从染色室上取下，注意不要丢失染料。
  2. 将染色室放置在气流较低的果蝇 CO2 麻醉垫上，直至果蝇完全麻醉。
  3. 拧开染色室的顶部盖板。小心使用镊子夹住果蝇腿部，将每个染色室中的一只染色果蝇转移至含有乙醇（EtOH）的 1.5 mL 微离心管中。转移 15 个染色室（每个含一只果蝇）所需时间约为 3–5 分钟。若实验中需分批进行多个染色室的操作，实验人员应将转移时间纳入考虑，以确保实验流程的高效安排。
  4. 当每个 1.5 mL 微离心管中均含有 1 只果蝇后，盖紧管盖，并上下颠倒混匀 3 次，使染料与乙醇充分混合。
  5. 在室温下孵育含有乙醇和果蝇的离心管 5 小时，以确保染料完全从果蝇体表溶入溶液中。5 小时后，短暂涡旋每根离心管（2 秒），以确保果蝇体表染料彻底清除。
  6. 如有条件，取 50 µL 实验用 1.5 mL 离心管中的溶液加入 96 孔板的孔中，并记录各样品在孔板中的位置。随后向每孔加入 200 µL 乙醇，使样品稀释 5 倍。该稀释步骤可避免因果蝇染料过多或存在严重梳理缺陷而导致的吸光度饱和效应。
  7. 使用酶标仪在 397 nm 波长下分析各样品。若无酶标仪，也可使用常规分光光度计在可见光范围内分别测定各样品及空白对照的吸光度。
  8. 通过酶标仪读取并记录各样品的吸光值，并保存包含孔板样品信息的电子表格。

4. 结果的定量分析

  1. 汇总所有样本的结果，并计算每种基因型或条件下的方差。
    注意：在统计分析中，0 分钟和 30 分钟时的染料累积量被视为不同条件，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Bonferroni 校正或其他多重平行比较校正方法进行分析。
  2. 使用以下公式计算每种基因型/条件的清洁行为百分比差异：[(0' 时染料累积均值 - 30' 时染料累积均值) / 0' 时染料累积均值] × 100。
  3. 以柱状图表示每种基因型和条件的百分比，并在不同基因型和条件之间进行比较。

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结果

梳理行为实验可提供定量数据，用于评估果蝇在设定的梳理时间（30分钟）后体表残留染料的相对量，从而反映其行为表现。图1展示了滑动式梳理实验装置的设计及实验主要步骤的示例图像。果蝇在染料存在下通过涡旋染尘后，会立即在体表聚集大量染料（图2d, 2e）。染尘后的果蝇在实验结束后体表染料的残留量存在一定范围的变化（图2f, 2g）。因此，将残留染料溶于乙醇（EtOH）并测定各样本的吸光度，可对果蝇的梳理能力进行可重复且高度定量的评估。

在本项关于 DopR 调控后足梳理行为的研究中，我们将强低效等位突变体（图3a, 3b）和 DopR 基因缺失突变体的梳理行为表现与野生型品系进行了比较（图3c, 3d）。DopR 突变体保留的染料显著多于野...

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讨论

梳理实验相对简单直接，但需提醒实验人员特别注意以下问题。在加入果蝇和染料后，通过拧紧上下板的螺丝以确保装置密封严密，这是获得可重复结果的关键。亮黄色染料颗粒极为细小，若连接处不严密，染料会从检测室边缘逸出。每个孔中染料含量的不一致会显著影响梳理行为的定量结果，因为不均匀的染料附着将增加数据变异性和梳理事件的假阳性率。此外，我们建议实验人员注意在30分钟梳理期间放置梳理检测室的环境条件。温度、光照、一天中的时段以及湿度等环境因素的稳定性，对实验结果的一致性至关重要。 果蝇 行为学实验。将梳理行为实验箱置于小型培养箱内，以尽量减少干扰性或可变的实验室环境，有利于实验结果的最佳可重复性，但其他空间布局也可取得成功。

关于染料积累的测量，我们观察到该染料可穿透乳胶手套，因此在处理和称量粉尘时，建议使用腈类手套。注意不要将粉尘广泛扩散到实验台表面，因为它容易污染衣物，并可能污染实验台面或设备。建议将实验限定在特定区域和特定的果蝇操作台/CO2 垫上，以控制染料暴露。我们还建议实验人员务必使用对紫外光透明的96孔板。亮黄染料在397 nm处的吸收峰接近紫...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon 和 Rose Hedreen 在测试和建立本方法及腔室设计初期所做出的工作。感谢 Kelly Tellez 和 Graham Buchan 对稿件的阅读与编辑。感谢 Andrew Seeds 和 Julie Simpson 的开创性工作，以及他们关于使用 Brilliant Yellow 染料（Sigma）的建议与支持。 本研究部分由 Mary E. Groff 外科与医学研究及教育慈善信托基金、Bronfman 科学中心以及 Hellman 学者项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高弹性Tygon PVC透明管McMaster-Carr5229K541/8"，OD 1/4"，与微量移液器吸头和筛网一起用于构建口吸式移液装置
微量移液器吸头（1 mL 和 200 μL） μLGenesee Scientific24-165, 24-150R
尼龙网筛，2 x 2.6"McMaster-Carr9318T44用于构建梳理室和口吸管
Dumont #5 镊子Roboz 外科手术器械RS-5050
亮黄色染料Sigma-Aldrich201375-25G处理本产品时，建议佩戴腈类手套
涡旋振荡器Fisher Scientific12-812设定为 "触碰"
乙醇卡罗来纳生物供应公司86-1282
1.5 mL 微量离心管VWR International10025-726
0.65 mL 微型离心管VWR International20170-293试管可在连续的检测中重复使用
紫外96孔板康宁26014017
BioTek Synergy HTX 酶标仪BioTek需要下载目录以获取产品编号http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 微孔板读板仪与成像软件BioTek
Microsoft Excel微软https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
果蝇培养箱TritechDT2-CIRC-TK
1/4" 丙烯酸塑料McMaster-Carr8473K341
8 - 32 颗坚果McMaster-Carr90257A009
8 - 32 × 1" 六角头螺钉McMaster-Carr92185A199底板需要用这种尺寸的螺丝进行敲击固定
8 - 32 x 1/2" 六角头螺钉McMaster-Carr92185A194顶部第二块板需要轻敲
2 - 56 3/8" 平头十字槽机螺钉McMaster-Carr91500A088这些将两块中间板固定在一起
0.175" 编号，1/4" OD，0.34" 铝管McMaster-Carr92510A044自行生产；所列产品尺寸大致相同，适用于8号螺丝。  这些结构作为1的鞘状物" 螺丝并将六角帽从顶板表面略微抬高

参考文献

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