Notch 信号通路是一种依赖细胞间直接接触的细胞通讯形式。要有效诱导 Notch 信号通路 体外，Notch 配体必须以固定化状态呈递给细胞。本方案描述了相关方法 体外 小鼠破骨细胞前体中 Notch 信号通路的激活
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摘要
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Notch 信号通路是多种生理和病理过程的关键组成部分。然而，Notch 信号通路的特性使得 体外 其作用的多变性及有时出现的矛盾性使得研究面临挑战。作为一种细胞间直接通讯的组成部分，Notch信号通路的受体和配体均结合在质膜上，因此无法被激活 体外 通过将配体简单地添加到培养基中即可激活许多其他信号通路，但Notch配体必须以固定化状态呈递给细胞。
Notch信号激活方法的差异可导致培养细胞中产生不同的结果。尤其是在破骨细胞前体中，Notch刺激方法以及破骨细胞前体的培养与分化条件的差异，导致了关于Notch信号通路对破骨细胞分化起促进还是抑制作用的争议。尽管在不同Notch刺激条件下对破骨细胞分化进行更深入的比较 体外 并且，遗传学模型已基本解决了关于Notch信号通路与破骨细胞之间关系的争议，而建立培养细胞中Notch信号通路持续性与暂时性刺激的标准化方法，有望在未来避免此类分歧。
本方案描述了两种特异性刺激培养的小鼠破骨细胞前体中Notch信号通路的方法，尽管经过微小调整后，这些方法也应适用于任何贴壁细胞类型。第一种方法可实现Notch信号通路的持续刺激，其原理是在细胞接种前将Notch配体固定于组织培养表面。第二种方法利用与琼脂糖珠结合的Notch配体，可在细胞已贴附于培养表面后实现对Notch信号通路的短暂刺激。本方案还包括检测破骨细胞前体中Notch激活状态的方法，以及Notch信号通路激活的代表性转录标志物。
引言
哺乳动物的 Notch 信号通路与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的同源通路相似，包含四种跨膜 Notch 受体（Notch1-4）以及五种膜结合配体，分别属于 Jagged（JAG1 & JAG2）和 Delta样（DLL1、3、& 4）家族1。当信号接收细胞上的 Notch 受体与信号发送细胞上的配体结合时，Notch 信号通路被激活2。在此跨细胞激活过程中，膜结合的 Notch 配体会对膜结合的 Notch 受体施加拉伸力3,4。配体结合所产生的拉伸力诱导 Notch 受体发生构象变化，从而促进其被肿瘤坏死因子α转换酶（TACE）在胞外区切割，随后由含早老素的 γ-分泌酶复合物（γ-secretase）介导进行胞内切割。γ-分泌酶释放 Notch 胞内结构域（NICD），后者转入细胞核，与 CBF-1-Su(H)-Lag-1（CSL）、mastermind样蛋白（MAML）及细胞类型特异性因子形成转录激活复合物，驱动靶基因的表达5。
Notch 信号通路激活的力学机制导致在体外需要采用特殊的方法来激活 Notch 通路。in vitro
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方案
所有涉及脊椎动物的研究均按照宾夕法尼亚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 培养基制备
- 通过将最低必需培养基（MEM）粉末和1.9 g碳酸氢钠溶解于900 ml H2O中来配制α-MEM，并添加2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和100 ml热灭活胎牛血清。使用0.22 µm聚醚砜（PES）滤器进行除菌。
- 通过在α-MEM中添加35 ng/ml重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）来配制巨噬细胞培养基
- 通过在巨噬细胞培养基中添加100 ng/ml RANKL来配制破骨细胞培养基
2. 骨髓细胞分离
- 每只小鼠使用一支装有10 ml α-MEM的10 ml注射器，配25⅝号针头。
- 以1.3 L/min的流速暴露于CO2环境中10分钟，处死小鼠。在进行解剖前，CO2暴露后须通过颈椎脱位确认动物死亡。
- 采用无菌操作技术，分离并取出胫骨和股骨。在沿后肢腹侧面做切口暴露胫骨和股骨前，先用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒。
- 切断膝关节以游离股骨远端，并尽可能靠近骨盆处切断股骨。取出股骨后，尽可能清除所有软组....
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结果
本方法旨在培养并激活破骨细胞前体中的Notch信号通路。在适当培养条件下，破骨细胞前体主要呈现细长的梭形形态，胞质光滑（图1A）。应避免破骨细胞前体发生免疫活化。一旦活化，前体细胞会铺展并变扁平，胞质呈泡沫状（图1B）。这些“煎蛋样”细胞对RANK信号具有抵抗性，无法有效分化为成熟的破骨细胞。在正确的培养与分化条件下，富集的破骨细胞前体将在三天内分化并融合形成大型TRAP阳性多核破骨细胞（图1C）。
将破骨细胞前体接种于Jagged1-Fc包被的表面后，24小时内可上调Notch信号通路靶基因的表达（图2）。Notch信号通路上调的特定基因因细胞类型而异。对于破骨细胞前体而言，Jagged1最显著上调的基因为Hes1，Hey2和Myc也有中等程度的上调，而其他Notch靶基因（如Hey1和p21）在Jagged1刺激破.......
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讨论
方案中的关键步骤
培养与 体外 破骨细胞前体的分化为研究破骨细胞生成的分子机制以及发现促进骨再生和维持骨量的治疗靶点提供了有效的平台。在培养小鼠破骨细胞前体时，最关键的环节是维持前体细胞处于未致敏状态。作为类巨噬细胞，破骨细胞前体易于对细菌成分和促炎性细胞因子产生反应。一旦被激活，破骨细胞前体将无法高效地分化为成熟的破骨细胞。前体细胞激活的主要原因是存在炎症细胞因子（如TNFα）或胎牛血清中灭活不充分的补体成分。因此，在实验使用前必须对每批血清支持破骨细胞生成的能力进行测试。此外，所有用于破骨细胞前体培养的血清都必须经过热灭活处理，以使可能激活前体细胞的补体成分变性。
修改与故障排除
在本方法中，使用 Jagged1-Fc 刺激破骨细胞前体中的 Notch 信号通路。Jagged1 与 Fc 的融合蛋白可便于通过抗 Fc 抗体将其固定在培养表面，也可与蛋白 G 琼脂糖珠偶联。其他与 Fc 融合的 Notch 配体（如 Delta-like1-Fc）也可采用类似方式使.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由宾夕法尼亚大学肌肉骨骼疾病中心（5 P30 AR050950-09）、AO基金会资助项目（S-16-12A）、费城退伍军人事务医疗中心转化肌肉骨骼研究中心以及骨科手术科内部研究发展基金资助。JWA 受美国国家普通医学科学研究所机构研究与职业发展奖（IRACDA；5 K12 GM081259-08）资助的宾夕法尼亚大学研究与教学博士后机会（PENN-PORT）奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重组小鼠 M-CSF | Biolegend | 576402 | 可从多家供应商获取，实验前需检测活性 |
| 重组小鼠 RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | 可从多家供应商获取，实验前需检测活性 |
| 重组人 Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | 可从多家供应商获取，实验前需检测活性 |
| Protein G 琼脂糖微珠 | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| 山羊抗人 IgG Fc 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| 最低必需培养基粉末 | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase 细胞解离试剂 | ThermoFisher | A1110501 | 用于分离破骨细胞前体细胞 |
| 酸性磷酸酶（白细胞，TRAP）检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | 用于染色已分化的破骨细胞 |
参考文献
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3....
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