展示了用于人类甲型流感病毒的全身性及局部感染斑马鱼模型。利用全身性感染模型，可将斑马鱼用于抗病毒药物的筛选；利用局部感染模型，可将斑马鱼用于宿主免疫细胞反应的表征。
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本文内容
摘要
摘要
每年，季节性流感暴发都会对全球社会造成深远影响。尽管全球已付出诸多努力，流感仍然是难以解决的医疗负担。防控感染的主要策略是每年接种疫苗。对于已感染流感的个体，抗病毒药物可缓解症状。显然，目前仍迫切需要开发应对流感的替代性策略。已有多种动物模型被用于模拟宿主与流感病毒的相互作用。本文描述了建立斑马鱼模型以研究全身性和局部性人甲型流感病毒（IAV）感染的实验方案。利用全身性IAV感染模型，可对具有潜在抗病毒活性的小分子进行筛选。作为原理验证，文中介绍了一项展示抗病毒药物扎那米韦在IAV感染斑马鱼中疗效的实验方案，说明如何量化疾病表型，以评估潜在抗病毒药物在IAV感染斑马鱼中的相对疗效。近年来，人们日益认识到中性粒细胞在人体对流感病毒感染的免疫应答中发挥着关键作用。斑马鱼已被证实是研究中性粒细胞生物学不可或缺的模型，对人类医学具有直接推动意义。本文描述了一项在 Tg(mpx:mCherry) 斑马鱼品系中建立局部IAV感染的实验方案，用于在局部病毒感染背景下研究中性粒细胞生物学。中性粒细胞向局部感染部位的募集为评估可能具有治疗应用价值的实验干预提供了另一项可量化的表型指标。文中所述的两种斑马鱼模型均真实再现了人IAV感染的多个方面。斑马鱼模型具有多种内在优势，包括繁殖力高、组织光学通透性好、适用于药物筛选，以及拥有多种转基因品系（例如，可用荧光蛋白标记中性粒细胞等免疫细胞）。本文详述的实验方案充分利用了这些优势，有望揭示宿主与IAV相互作用的关键机制，最终推动临床转化。
引言
根据世界卫生组织（WHO）的数据，流感病毒每年感染5%至10%的成年人和20%至30%的儿童，导致全球范围内出现300万至500万例重症病例，最多造成50万人死亡1。每年接种流感疫苗仍是预防该疾病的最佳手段。诸如WHO全球行动计划等举措已提高了季节性疫苗的使用率、疫苗生产能力，并推动了更高效疫苗策略的研发，以降低季节性流感暴发所致的发病率与死亡率2。在部分国家，已有神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物（例如扎那米韦和奥司他韦）可供使用，若在症状出现后的前48小时内给药，已被证实可有效缓解症状3,4,5。尽管全球已付出诸多努力，但目前控制季节性流感暴发仍面临巨大挑战，因为流感病毒的抗原漂移速度往往超过当前应对病毒基因组变化的能力6。针对新病毒株的疫苗策略必须提前开发，有时由于流感季节中最终占主导地位的病毒株类型发生不可预见的变化，导致疫苗效果未能达到最佳。基于上述原因，显然有必要开发用于控制感染并降低死亡率的替代性治疗策略。通过更深入地理解宿主与病毒之间的相互作用，有望研发出新型抗流感药物及辅助治疗手段7,
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方案
所有操作均应按照美国疾病控制与预防中心（CDC）规定的生物安全二级（或BSL2）标准进行，并遵守机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的相关规定。请咨询相关主管部门，以确保操作安全并符合规范。
1. 斑马鱼的饲养与维护
- 繁殖斑马鱼并收集实验所需数量的胚胎。必要时，可采用Adatto et al.32所述的大规模繁殖装置，以获取大量发育阶段一致的胚胎。
- 将胚胎置于深型培养皿中，在28 °C条件下，于含60 µg/ml海盐（例如，Instant Ocean）的无菌卵水中低密度（<100个胚胎/皿）培养，直至达到目标发育阶段（全身性IAV感染实验[第3节]为受精后48小时，局部性鳔感染实验[第4节]为受精后5天）。
- 使用塑料移液管清除死亡胚胎，并每日更换卵水，以确保胚胎健康和正常发育。
2. 材料与试剂的准备
- 配制4 mg/ml的Tricaine-S储备液（用蒸馏水溶解并调节pH至7.0–7.4），经高压灭菌后，于4 °C保存。
- 使用拉针仪将带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成针例如 微量移液器拉制仪设置如下：压力 = 100，加热温度 = 550，拉制 = [无数值....
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结果
本文提供了数据，说明如何利用斑马鱼的系统性流感病毒（IAV）感染模型来测试药物疗效（图1A）。在受精后48小时的胚胎通过库维叶管注射APR8（图1C、1F）、X-31（图1D、1G）或NS1-GFP（图1H-1I）以建立病毒感染。另一组在受精后48小时的胚胎被注射作为病毒感染的对照组（图1B、1E）。感染后48小时，注射了IAV的斑马鱼表现出心包水肿（图1C、1D）和循环停止（图1F）的迹象，红细胞分布于整个心包腔（图1G）。使用NS1-GFP病毒时，通过荧光显微镜观察到感染后3小时即可检测到GFP的初始表达。此时，将斑马鱼暴露于33.3 ng/ml剂量的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦（Zanamivir）。该剂量大致相当于给予人类患者的200 mg剂量。未接受扎那米韦处理的感染对照组鱼类（图1.......
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讨论
为了最大限度地利用小型动物模型研究人类宿主与病原体相互作用的优势，重要的是提出并检验能够充分利用该模型系统内在优势的研究问题和假设。作为人类甲型流感病毒（IAV）感染的模型，斑马鱼具有多个优势，包括繁殖力高、组织透明、适合药物筛选，以及存在多种可标记中性粒细胞等免疫细胞的转基因品系。斑马鱼已发展成为研究炎症和先天免疫日益有力的小鼠模型替代系统。由于斑马鱼在发育的前4至6周内缺乏功能性适应性免疫应答，因此其抵御损伤和感染依赖于先天免疫应答37。在此发育早期阶段，可以分离并研究仅来源于先天免疫应答的抗病毒反应机制。这一研究得益于诸如Tg(mpx:mCherry)等转基因斑马鱼品系的建立，该品系利用红色荧光蛋白标记中性粒细胞。
近期已有研究描述了类似于人类疾病的甲型流感病毒（IAV）感染斑马鱼模型19。研究表明，斑马鱼细胞表面具有α-2,6连接的唾液酸残基，使IAV病毒能够识别、结合并侵入细胞。在本论文以及Gabor et al.
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Mark Nilan在斑马鱼饲养与维护方面提供的帮助，以及Meghan Breitbach和Deborah Bouchard在NS1-GFP扩增和IAV滴度测定方面的工作。本研究得到了NIGMS资助项目NIH P20GM103534以及缅因州农业与林业实验站（出版物编号3493）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm 无菌一次性培养皿 | VWR | 89107-632 | |
| 移液管 | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 三卡因-S（MS-222） | Western Chemical | ||
| 带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown 微量移液管拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 琼脂糖 | Lonza | 50004 | |
| 扎那米韦 | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 镊子 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 微量加样器吸头 | Eppendorf | 930001007 | |
| 显微镜浸油 | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 显微镜载物台校准载玻片 | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 压力注射仪 | Applied Scientific Instrumentation | ||
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| 背压装置 | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| 微量移液管固定器套件 | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| 脚踏开关 | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| 显微操作器 | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| 磁力底座 | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| 低温培养箱 | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| 照明器 | Zeiss | HXP 200C | |
| 冷光源 | Zeiss | CL6000 LED | |
| 玻璃底多孔板，24 孔 | Mattek | P24G-0-13-F | |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | IX-81 配备 FV-1000 激光扫描共聚焦系统 | |
| Fluoview 软件 | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| 流感病毒 A/PR/8/34 (H1N1) | Charles River | 490710 | |
| 流感病毒 A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| 流感 NS1-GFP | 参见 Manicassamy 等，2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | 参见 Lam 等，2013 |
参考文献
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov
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