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方法文章

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

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DOI：

10.3791/55236

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2017年1月26日

 ,  , 
1Department of Microbiology, The University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从真核细胞中表达、分离和表征蛋白质复合物。该方案可用于对特定复合物进行生物化学表征，以及鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。

摘要

活性蛋白质-蛋白质复合物及蛋白质-核酸复合物的纯化对于酶活性的表征以及新亚基和翻译后修饰的从头鉴定至关重要。de novo 细菌系统可用于表达和纯化多种单一多肽和蛋白质复合物。然而，该系统无法纯化含有翻译后修饰（例如，磷酸化和乙酰化）的蛋白质亚基，也无法鉴定仅在真核系统中存在或表达的新型调控亚基。本文详细介绍了一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，该方法利用STREP标签和FLAG标签蛋白，可从真核细胞中纯化瞬时或稳定表达的表位标签蛋白所形成的蛋白质复合物。本方案可用于表征蛋白质复合物的功能、发现复合物亚基上的翻译后修饰，并通过质谱技术鉴定新型调控复合物组分。值得注意的是，该TAP方法可用于研究由真核或病原体（病毒和细菌）组分形成的蛋白质复合物，从而为下游实验提供广泛的可能性。我们建议从事蛋白质复合物研究的研究人员可多方面应用此方法。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）对于生物过程的精确调控至关重要1，对这些蛋白质相互作用的进一步研究有助于阐明其功能2已设计出多种方法用于蛋白质相互作用（PPIs）的研究与表征，以及 从头合成 鉴定新的调控蛋白组分。1989年，Stanley Fields 及其同事报道了酵母双杂交（Y2H）实验3该方法可对特定目标蛋白（诱饵）的相互作用分子（猎物）进行无偏倚且全面的鉴定 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 除了在发现蛋白质相互作用（PPIs）方面具有显著效用外，酵母双杂交（Y2H）实验还可用于在酵母细胞中表征蛋白质配对、界定最小相互作用结构域，以及鉴定破坏此类相互作用的突变。通过改进Y2H实验，也可在哺乳动物细胞中研究蛋白质相互作用。4. Y2H 实验的变体（例如酵母三杂交系统也可用于研究细胞内蛋白质-RNA以及蛋白质-小分子有机配体的相互作用。

另一种在同源系统中研究蛋白质相互作用（PPIs）的常用工具是共免疫沉淀（co-IP）实验5通过使用抗体对目标蛋白进行免疫沉淀，共免疫沉淀（co-IP）实验使研究人员能够在不同环境条件和实验情况下监测细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。利用表位标签蛋白（例如，FLAG、Myc、STREP 和 HA 等标签在亲和纯化（AP）方法中的应用，已促进从复杂的蛋白质混合物中分离蛋白质，用于多种下游检测，包括蛋白质印迹、银染及酶学分析。然而，这些既往方法均无法实现大量蛋白质复合物的分离，以用于进一步的表征分析 体外 检测、通过质谱法发现调节亚基以及翻译后修饰的鉴定。AP方法的一种改进版本称为串联亲和纯化（Tandem AP，TAP），该技术通过构建含有两个表位标签的融合蛋白，并依次进行两次亲和纯化，用于研究蛋白质相互作用。6,7在本文中，我们介绍了一种改良的TAP方法，用于纯化蛋白质复合物，该方法对两个亚基分别标记不同的表位标签，并通过两次连续的亲和纯化（先进行STREP亲和纯化，再进行FLAG免疫沉淀）完成纯化。我们首先对TAP方法进行简要概述。图1）然后详细描述所有实验步骤（图2），以便研究人员能将其应用于目标蛋白质复合物。

为了验证TAP方法的适用性，我们选择了一个特征明确的周期蛋白-CDK复合物（称为P-TEFb激酶），该复合物由调节亚基周期蛋白T1（CycT1）和激酶CDK9组成，参与RNA聚合酶II（Pol II）转录过程的调控8,9,10。P-TEFb可磷酸化Pol II的C末端结构域及其相关的负延伸因子，从而解除启动子处的转录暂停，促进转录延伸11,12,13。基于这一已知的相互作用，我们在HEK293T细胞中过表达带有STREP标签的CycT1和带有FLAG标签的CDK9。为进一步验证蛋白相互作用与所用表位标签无关，还进行了反向TAP实验，即使用带有STREP标签的CDK9和带有FLAG标签的CycT1。转染48小时后收集细胞并进行裂解。将可溶性裂解液通过TAP（先STREP亲和纯化，再FLAG免疫沉淀）进行纯化。输入样品及纯化后的蛋白通过Western印迹和银染分析（图3）。

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方案

1. 细胞铺板

  1. 转染前一天，将 3.5 × 106 个 HEK293T 细胞接种于每 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 mL 添加了 10%（v/v）胎牛血清（FBS）和 1%（v/v）青霉素/链霉素（10,000 U/mL 储存液）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。每次实验/条件需接种 3–5 个 100 mm 培养皿，以确保获得足够的蛋白产量。
    ​注意：所需培养皿数量需根据每个实验/条件的具体情况确定，取决于目标蛋白复合物的表达水平和溶解度。或者，若需要更大规模的纯化，可将细胞系适应于在旋转烧瓶中悬浮培养2，但该方法不适用于瞬时转染。

2. 转染细胞或诱导稳定细胞系 

  1. 次日，在显微镜下观察细胞。在继续操作前，细胞融合度必须达到 70 - 80%。
  2. 每 100 mm 培养皿中，使用含有 7 µg 质粒 DNA 和 21 µl 转染试剂的总混合物对细胞进行转染。使用表达 GFP 的载体（表 1）作为转染效率的对照。
    注意：若使用 HEK293-T-REx 或类似的稳定细胞系，该细胞系可在多西环素诱导下表达两个或多个复合亚基14,15，则需向细胞中加入诱导剂并孵育 48 小时。同样，为验证目的，也需要使用在加入诱导剂后可诱导表达 GFP 的稳定细胞系。然后进行步骤 2.7。
  3. 为每 100 mm 培养皿配制转染混合液。取一个 1.5 ml 微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 7 µg 总质粒 DNA（对应两个或多个质粒）混合。另取一个微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 21 µl 转染试剂混合。每个转染反应均需重复此步骤。
  4. 将转染试剂溶液加入质粒 DNA 溶液中（切勿以相反顺序混合）。通过移液至少吹打混合 4 次。
  5. 室温孵育该混合物 10 - 15 分钟，但不得超过 15 分钟。
  6. 倾斜培养皿以形成液体储区，小心地将转染混合物逐滴加至培养皿内壁，避免扰动细胞。将培养皿恢复至水平位置，轻轻摇晃以均匀分布混合液。
  7. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化细胞培养箱中孵育（此条件在下文中统称为 "tissue culture incubator"）。转染后 5 小时更换培养基（可选）。

3. 检测转染或诱导效率

  1. 转染后24小时，在荧光显微镜下观察细胞以检测转染效率（或检测表达GFP的对照HEK293T-REx稳定细胞系的诱导情况）。再孵育24小时。

4. STREP 亲和纯化（STREP AP）

  1. 收集细胞
    1. 转染后48小时，弃去培养基，加入8 ml预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。用移液器吹打数次，使细胞从培养板上脱落。
    2. 将细胞悬液收集并转移至15 mL离心管中，在4 °C、800 x g条件下离心4分钟。
    3. 移除 PBS 上清液。再次离心（800 × g，4 °C，1 分钟）以彻底去除残留的 PBS。将细胞沉淀保存于 -80 °C，以备后续使用；或按照以下步骤继续进行蛋白质纯化。
  2. 裂解细胞
    1. 使用被动裂解缓冲液（PLB：20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂）重悬细胞沉淀，缓冲液体积为细胞沉淀体积的5倍（每孔板约250 µl）。2，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物片剂，5% v/v 甘油，以及 1.0% NP-40），并将细胞悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。
    2. 短暂涡旋混匀，4 °C 条件下振荡孵育 30 分钟。
    3. 在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞悬液。
    4. 将可溶性裂解物转移至新的1.5 ml微量离心管中，弃去细胞沉淀。保留可溶性裂解物终体积的10%作为 "STREP AP 输入" 4 °C 下保存。
  3. 平衡STREP磁珠
    注意：第一步亲和纯化请使用STREP磁珠！使用STREP磁珠沉淀的复合物所回收的蛋白量显著高于使用FLAG磁珠沉淀的复合物。
    1. 取出 (n × 40 µl) + n µl 的 50% STREP 珠悬液（n = 样品数量），在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。
      注意：使用宽口吸头移取磁珠。
    2. 移除上清液，向珠子中加入500 µl PLB。在4 °C下轻轻摇动珠子混合物5分钟。在4 °C下以1,500 x g离心2分钟。
      1. 重复洗涤共3次。将珠子重悬于PLB中，终体积为n × 40 µl。
    3. 向每份细胞裂解液样品中加入40 µl 50% STREP磁珠悬液，4 °C下振荡孵育2小时。
  4. STREP AP
    1. 在 4 ˚C 下以 1,500 x g 离心 2 分钟。
    2. 去除上清液并储存 "STREP AP 流穿（FT）" 在 4 °C 条件下。
    3. 加入500 µl STREP AP Wash Buffer I（20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂）2，1 mM DTT，5% 甘油和 0.2% NP-40）加入珠子中。4 °C 下轻柔振荡孵育珠子混合物 5 分钟，然后在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。弃去上清液。
      1. 重复上述步骤，共洗涤4次。
        ​注意：在第四次洗涤前，将珠子溶液转移至新的1.5 ml微量离心管中，以降低蛋白背景。此步骤至关重要。
    4. 加入500 µl洗涤缓冲液II（100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl和1 mM EDTA），通过倒置试管使磁珠充分平衡。在4 °C下以1,500 × g离心2分钟，弃去上清液。
    5. 用50 µl STREP洗脱缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA和2.5 mM Desthiobiotin）洗脱目标蛋白。在4 °C下以800 rpm涡旋振荡15分钟。
    6. 在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。收集上清液。该组分对应于 "STREP AP 洗脱" 样品
    7. 将珠子部分保存在 4 °C，用于第二次洗脱，第二次洗脱可能获得第一次洗脱所得蛋白量一半的蛋白。取 STREP AP 洗脱液的 10% 用于银染和/或 Western 印迹分析16.
  5. 平衡 FLAG 琼脂糖珠
    1. 取出 (n × 16 µl) + n µl 的 FLAG beads 溶液（n = 样品数量），在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。
      ​注意：使用宽口吸头移取珠子。
    2. 移去上清液，向珠中加入500 µL FLAG洗涤缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% NP-40）。在4 °C下以1,500 × g离心2分钟。重复洗涤共3次。
    3. 用 FLAG 洗涤缓冲液重悬珠子，终体积为 n × 16 µl。
    4. 向剩余的STREP亲和纯化洗脱液中加入16 µl FLAG磁珠悬液，4 °C下旋转孵育过夜。

5. FLAG 免疫沉淀

  1. 在4 °C下以1,500 × g离心FLAG磁珠悬液2分钟。保留上清液并作为 "FLAG 免疫沉淀上清液" (FT) 于 4 °C 条件下
  2. 加入500 µl FLAG洗涤缓冲液至溶液中。在4 °C下振荡孵育5分钟，然后在4 °C下以1,500 x g离心2分钟。重复上述步骤，共洗涤4次，每次离心后弃去上清液。
    注意：在第四次洗涤前，将蛋白-珠粒溶液转移至新的1.5 ml微量离心管中，以降低背景信号。此步骤至关重要。
  3. 去除最后一次离心的上清液，向珠子中加入30 µL含有200 ng/µL FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液。在4 °C下以800 rpm涡旋振荡2小时。
  4. 在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 2 分钟。收集上清液，并于 4 °C 保存作为 "FLAG 免疫沉淀洗脱"
    注意：可使用标准方案通过银染和/或蛋白质印迹法对洗脱样品进行验证16，可用于后续的蛋白质检测。进行Western blot实验时，需上样以下所有样品：（1）STREP AP Input，（2）STREP AP FT，（3）STREP AP Elution，（4）FLAG IP FT，（5）FLAG IP Elution。上样体积需根据每个实验具体情况确定。所有收集的样品和磁珠可于4 °C短期保存，或于-80 °C长期保存。TAP样品可进一步通过质谱分析，以验证其组分身份、鉴定新的翻译后修饰（PTMs）和/或发现与纯化复合物发生的新蛋白相互作用。2,17为此，可在运行考马斯亮蓝染色胶或银染后，使用洁净的手术刀从凝胶中切下目标条带。此前已有多种优秀综述详细讨论了质谱分析方法18,19.

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结果

本文中，我们展示了TAP方法在已充分表征的CycT1-CDK9复合物（也称为P-TEFb激酶）中的适用性。

将编码Cyclin T1-STREP（CycT1:S）和CDK9-FLAG（CDK9:F），或CDK9-STREP（CDK9:S）和Cyclin T1-FLAG（CycT1:F）的质粒（表1）转染至HEK293T细胞中。阴性对照包括空载体以及CDK9:F或CycT1:F质粒的转染（分别见图3A和图3B）。蛋白表达48小时后收集细胞。每个实验使用多块培养板的细胞（本研究所示数据中每样本使用五块培养板，见图3），以提高蛋白产量和回收率。细胞在各自的微量离心管中裂解后，将同一样本的细胞裂解液合并至一个微量离心管中，再加入STREP磁珠。将蛋白样本与一份磁珠结合可提高最终蛋白浓度，有助于提高难表达蛋白的回收效率。初次洗脱...

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讨论

此处所述的从真核细胞中表达和分离蛋白质复合物的方案不仅限于此类分子组装体的生化表征，还可用于鉴定可能调控其功能的新型相互作用蛋白及翻译后修饰。亲和标签的使用并不局限于本方案中提及的类型；但我们的经验表明，以STREP标签作为第一步亲和纯化（AP）步骤可显著提高最终蛋白质-蛋白质复合物的得率。与其它表位标签相比，STREP磁珠的结合与洗脱步骤均具有极高的效率。例如，FLAG）。此外，理论上，TAP 方法也可应用于其他蛋白质或结构域，仅需进行一些小的优化，例如缓冲条件、每实验所用培养板数量（适用于瞬时和稳定表达系统） 等等。 此外，如果特定蛋白质复合物需要特殊系统才能发挥功能，或与独特因子相互作用，TAP 方法也可应用于其他细胞系。为便于故障排查，强烈建议同时保存输入样品和穿流样品（FT 样品）。表2）。当洗脱液中无法观察到预期的蛋白条带时，可利用流穿组分（FT样品）排查实验问题，以确定样品是否已结合和/或从磁珠上洗脱。

成功的TAP严格依赖于高水平的蛋白质表达和回收率。因此，研究人员需要根据具体情况优化起始材料的用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为 R01AI114362，以及 Welch 基金会授予 Iván D'Orso 的 I-1782 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH3002.2FS
胎牛血清GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH30071
青霉素/链霉素MP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
蛋白酶抑制剂混合物 Roche 11836153001
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag 洗脱缓冲液IBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 亲和凝胶Sigma-AldrichF2426
Corning 100 mm × 20 mm 培养皿，细胞培养处理，无热原聚苯乙烯，20/袖套Corning 430167
Protein Lo-Bind Eppendorf 管Eppendorf022431081
数字涡旋混合器Fisher Scientific 02-215-370
48 孔微量离心管泡沫架Fisher Scientific02-215-386
Labquake 摇床旋转器 Thermo 415110

参考文献

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