本文介绍了已成功用于海豚精子采集、冷冻保存以及利用牛卵母细胞进行异源体外受精（IVF）操作的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
使用冷冻保存的海豚精子有助于在水族馆之间交换遗传物质，并使实验室能够获取精子样本，以进一步研究海洋哺乳动物的繁殖机制。异源体外受精（heterologous IVF）可作为同源体外受精的替代方法，为评估精子受精潜力、研究配子生理学及早期胚胎发育提供途径，同时避免使用难以获取的珍贵海豚卵母细胞。本文介绍了已成功用于采集和冷冻保存海豚精子的操作方案。精液采集通过对手术训练过的海豚进行手动刺激完成。冷冻保存采用以TRIS-卵黄为基础、含甘油的稀释液进行。此外，本文还介绍了一种利用海豚精子与牛卵母细胞进行异源体外受精的实验方案，并通过PCR技术验证所形成胚胎的杂交特性。异源受精现象引发了关于受精机制的科学问题，同时可作为研究配子生理学和早期胚胎发育的工具。此外，异源体外受精的成功也表明该技术在评估海豚精子受精能力方面具有应用潜力，值得进一步深入研究。
引言
包括海洋哺乳动物在内的野生动物辅助生殖技术发展较为滞后。缺乏评估精子受精能力的灵敏方法，是导致海豚等物种生殖技术进展缓慢的原因之一。直到最近，人们才首次报道了宽吻海豚（Tursiops truncatus）的基本精液参数1,2。然而，尽管精子活力和形态等指标被广泛使用，但其对生殖效率的评估信息十分有限。精子质量的最佳指标是对受精潜能的评估。
最近，我们的研究团队采用了一种方法，通过利用带完整透明带的牛卵母细胞进行异源体外受精（IVF），评估雄性原核形成和/或杂交胚胎形成，以检测海豚精子的受精潜能3使用海豚-牛异源体外受精（IVF）相较于同源体外受精具有重要优势，因其克服了获取海豚卵母细胞的困难，并有助于利用经过充分验证的 体外 牛卵母细胞成熟系统。为了避免物种特异性，异源受精通常在无透明带（ZP）的情况下进行。尽管该方法可用于评估已发生顶体反应的精子与卵黄膜融合的能力，但会妨碍对其他与受精相关特征的评估。本文所述方法采用保留透明带的卵母细胞，可对以下参数进行评估：精子与透明带的结合与附着、穿透能力、多精入卵、原核形成以及杂交胚胎的卵裂。
本文介绍了多种精子采集、基本精子分析、精子冷冻保存以及通过异源体外受精（使用完整透明带....
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方案
伦理声明：所有实验程序均经国家农业与食品技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria，INIA）动物护理与使用机构委员会审查并批准。所有实验均依照《实验动物护理与使用指南》（由生殖研究学会采纳）以及《海洋哺乳动物护理动物福利法》的规定进行。
1. 海豚精子采集与冷冻保存
- 准备
- 制备FERT培养基（不含肝素和低牛磺酸）。配制FERT-TALP培养基，添加25 mM碳酸氢盐、22 mM乳酸钠、1 mM丙酮酸钠、6 mg/mL无脂肪酸BSA和10 mg/mL肝素（pH 7.4）。
注意：该培养基需在使用当天配制，并在使用前于38.5 °C、5% CO2、高湿度空气中至少平衡2小时。 - 制备基于TRIS的卵黄缓冲液。将30.28 g/L Tris、16.75 g/L柠檬酸、12.5 g/L果糖和0.5 g/L链霉素溶于超纯水中（pH 7.3，渗透压 = 310 mOsm/kg）。加入20%（v/v）卵黄。
- 制备FERT培养基（不含肝素和低牛磺酸）。配制FERT-TALP培养基，添加25 mM碳酸氢盐、22 mM乳酸钠、1 mM丙酮酸钠、6 mg/mL无脂肪酸BSA和10 mg/mL肝素（pH 7.4）。
- 训练一只已知具有繁殖能力的雄性宽吻海豚，使其在池边自愿配合，呈仰卧姿势，以便采集精液。
注意：应通过正向强化法对雄性海豚进行为期6个月的训练，具体方法如先前文献所述
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结果
本文展示的所有结果、表格以及图1和图2均已获得许可并予以复制3。
海豚精子在冻融后具有较高的运动能力
解冻后的海豚精液中，总活力精子百分比（% ± SD）为 84.5 ± 5.3，前向运动精子百分比为 69.1 ± 5.1。从运动能力来看，这些数值代表了高质量的冷冻保存精子。
海豚精子能够穿透完整的牛卵母细胞透明带并产生杂交胚胎
图1A 和 表1 显示，经过2.5小时共孵育后，海豚精子附着在.......
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讨论
对于多种不同的哺乳动物而言，使用冻融精子具有诸多优势，包括能够转移珍贵的遗传物质、实现全球范围内的分布、降低污染风险，以及能够将雄性配子保存数十年。对于宽吻海豚而言，使用冷冻保存的精子尤为重要，因为该物种受到《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II的保护，限制了不同水族馆之间动物的运输与交换。海豚的运输不仅会带来后勤上的难题，还存在严重的安全风险。然而，避免运输同样会带来后果，例如可能导致圈养动物种群中近亲繁殖风险的增加。一个可行的解决方案是精子的冷冻保存。一些研究人员已成功对海豚精子进行冷冻保存5,7,8,9，并取得了非常令人鼓舞的结果。此外，2005年首次报道了利用冷冻保存精子通过人工授精成功诞下海豚幼崽的案例10。数年之后，研究人员还利用性别分选的精子实现了这一目标11.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由西班牙经济与竞争力部（项目编号：AGL2015-70140-R，授予 D. Rizos；项目编号：AGL2015-66145R，授予 A. Gutierrez-Adan 和 J. F. Pérez-Gutiérrez）以及穆尔西亚塞内卡基金会（项目编号：20040/GERM/16，授予 F. García-Vázquez）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FERT-TALP 培养基 | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4 孔培养皿 | Nunc | 176740 | |
| 密度梯度 BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| 洗涤液 Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| 氯化镁 | Promega | A35 1H | |
| 无菌水 | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Tris 硼酸 EDTA 缓冲液 | Sigma | T4415 | |
| MB 琼脂糖 | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi 缓冲液 | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB 琼脂糖 | Biotools | 20.012 | |
| Taq 聚合酶 | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler 计数室 | Sefi Medical | ||
| Thoma 计数板 | Hecht-Assistant | ||
| pH 计 MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Advanced micro osmometer 3300 渗透压仪 | Norwood | ||
| 计算机辅助精子分析系统 | Projectes y Serveis R+D | ||
| 体视显微镜 MZ 95 | Leica | ||
| 落射荧光光学系统 Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 软件 | Bio-Rad | 3D 分析软件 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Bio-Rad | ||
| 微量移液器（P2、P20、P200、P1000） | Gilson | ||
| 微量离心管 | VWR | ||
| 紫外透射仪 | Bio-Rad | ||
| PCR 扩增仪 Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
参考文献
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al.
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重印与许可
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