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方法文章

宽吻海豚（Tursiops truncatus精子：采集、冷冻保存与异源授精 体外 受精

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DOI：

10.3791/55237

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2017年8月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Reproduction, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), 2Department of Animal Medicine and Surgery, School of Veterinary Medicine, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Physiology, Faculty of Veterinary Science, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, 4Mundomar, Benidorm, 5Veterinary Services, L'Oceanográfic, Ciudad de las Artes y las Ciencias, Junta de Murs i Vals, s/n, 46013

本文内容

摘要

本文介绍了已成功用于海豚精子采集、冷冻保存以及利用牛卵母细胞进行异源体外受精（IVF）操作的实验方案。

摘要

使用冷冻保存的海豚精子有助于在水族馆之间交换遗传物质，并使实验室能够获取精子样本，以进一步研究海洋哺乳动物的繁殖机制。异源体外受精（heterologous IVF）可作为同源体外受精的替代方法，为评估精子受精潜力、研究配子生理学及早期胚胎发育提供途径，同时避免使用难以获取的珍贵海豚卵母细胞。本文介绍了已成功用于采集和冷冻保存海豚精子的操作方案。精液采集通过对手术训练过的海豚进行手动刺激完成。冷冻保存采用以TRIS-卵黄为基础、含甘油的稀释液进行。此外，本文还介绍了一种利用海豚精子与牛卵母细胞进行异源体外受精的实验方案，并通过PCR技术验证所形成胚胎的杂交特性。异源受精现象引发了关于受精机制的科学问题，同时可作为研究配子生理学和早期胚胎发育的工具。此外，异源体外受精的成功也表明该技术在评估海豚精子受精能力方面具有应用潜力，值得进一步深入研究。

引言

包括海洋哺乳动物在内的野生动物辅助生殖技术发展较为滞后。缺乏评估精子受精能力的灵敏方法，是导致海豚等物种生殖技术进展缓慢的原因之一。直到最近，人们才首次报道了宽吻海豚（Tursiops truncatus）的基本精液参数1,2。然而，尽管精子活力和形态等指标被广泛使用，但其对生殖效率的评估信息十分有限。精子质量的最佳指标是对受精潜能的评估。

最近，我们的研究团队采用了一种方法，通过利用带完整透明带的牛卵母细胞进行异源体外受精（IVF），评估雄性原核形成和/或杂交胚胎形成，以检测海豚精子的受精潜能3使用海豚-牛异源体外受精（IVF）相较于同源体外受精具有重要优势，因其克服了获取海豚卵母细胞的困难，并有助于利用经过充分验证的 体外 牛卵母细胞成熟系统。为了避免物种特异性，异源受精通常在无透明带（ZP）的情况下进行。尽管该方法可用于评估已发生顶体反应的精子与卵黄膜融合的能力，但会妨碍对其他与受精相关特征的评估。本文所述方法采用保留透明带的卵母细胞，可对以下参数进行评估：精子与透明带的结合与附着、穿透能力、多精入卵、原核形成以及杂交胚胎的卵裂。

本文介绍了多种精子采集、基本精子分析、精子冷冻保存以及通过异源体外受精（使用完整透明带的牛卵母细胞）后评估雄性原核和/或杂交胚胎的形成来评价 海豚精子功能 性的 方法。

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方案

伦理声明：所有实验程序均经国家农业与食品技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria，INIA）动物护理与使用机构委员会审查并批准。所有实验均依照《实验动物护理与使用指南》（由生殖研究学会采纳）以及《海洋哺乳动物护理动物福利法》的规定进行。

1. 海豚精子采集与冷冻保存

  1. 准备
    1. 制备FERT培养基（不含肝素和低牛磺酸）。配制FERT-TALP培养基，添加25 mM碳酸氢盐、22 mM乳酸钠、1 mM丙酮酸钠、6 mg/mL无脂肪酸BSA和10 mg/mL肝素（pH 7.4）。
      注意：该培养基需在使用当天配制，并在使用前于38.5 °C、5% CO2、高湿度空气中至少平衡2小时。
    2. 制备基于TRIS的卵黄缓冲液。将30.28 g/L Tris、16.75 g/L柠檬酸、12.5 g/L果糖和0.5 g/L链霉素溶于超纯水中（pH 7.3，渗透压 = 310 mOsm/kg）。加入20%（v/v）卵黄。
  2. 训练一只已知具有繁殖能力的雄性宽吻海豚，使其在池边自愿配合，呈仰卧姿势，以便采集精液。
    注意：应通过正向强化法对雄性海豚进行为期6个月的训练，具体方法如先前文献所述4。
  3. 通过轻柔按压海豚生殖沟前部区域，实施多种触觉刺激，诱导阴茎从生殖沟中自然伸出。
  4. 在阴茎完全勃起后，将阴茎尖端引导至无菌容器中，以收集射出的精液。
  5. 将精子样本 保持在37 °C直至分析。重复步骤1.3和1.4以连续收集多次射精样本，每次使用新的丙烯玻璃容器。
  6. 采集后立即使用预先加热至37 °C的刻度玻璃量筒测定精液体积。评估精液的颜色、pH值和渗透压（使用微渗透压计）。
  7. 为评估精液中精子浓度，取10 µL精子悬液加入含有90 µL蒸馏水的离心管中。使用精子计数板测定精子浓度。
    注意：评估过程中，将剩余精液保持在37 °C。
  8. 评估精子运动参数。
    1. 取10 µL精子样本，置于预热的精子检测室中。
    2. 使用先前已针对宽吻海豚验证过的计算机辅助精子分析系统，客观评估精子运动能力2。
      注意：如有必要，可用不含肝素和低牛磺酸的FERT培养基稀释精子样本，以获得清晰的运动观察效果。评估过程中，将样本置于加热显微镜载物台上，维持37 °C。
  9. 取20 µL精子样本，按照先前描述的方法5评估精子活力和形态。
  10. 将精子样本转移至离心管中。在250 × g条件下离心5分钟。使用计数板测定精子浓度后，将精子浓度调整为400 × 106 精子/mL。
    注意：如有需要，可通过离心（250 × g，10分钟）获得过量精液中的分离精浆，并用其稀释浓缩精液的沉淀物。
    1. 在5分钟内，缓慢按1:1（v/v）比例用含1.5%甘油的TRIS卵黄缓冲液稀释精子悬液。将含有精子悬液的离心管置于5 °C环境中静置1小时30分钟。
    2. 用含甘油的TRIS卵黄缓冲液对精子悬液进行第二次稀释，使终浓度为3%甘油和200 × 106 精子/mL。将精子悬液在5 °C下维持10分钟。
  11. 将精子悬液装入0.25 mL细管中，热封细管。将细管置于距液氮表面4.5 cm高的架子上，静置10分钟。随后将细管浸入液氮中，保存至后续评估使用。

2. 异源的 体外 使用透明带完整的牛卵母细胞进行受精

  1. 准备
    1. 配制染色液和封片介质。
      1. 将1 mg Hoechst溶于1 mL蒸馏水中，配制Hoechst储存液。分装为30 µL每份，避光保存于-20 °C，待用。取25 µL Hoechst储存液加入5 mL含1 g/L PVA的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制染色液。充分混匀后，避光保存于4 °C，待用。
      2. 将6.25 mL PBS与6.25 mL甘油及6.25 µL Hoechst储存液混合，充分混匀，避光保存于4 °C，待用。
    2. 准备卵母细胞采集用培养基 体外 受精
      1. 将0.5 mL的庆大霉素加入0.9%氯化钠蒸馏水中，配制生理盐水溶液。
      2. 通过向10 mL TCM-199培养基中添加10 ng/mL表皮生长因子（EGF）和10%胎牛血清（FCS），配制储备成熟培养基。将两种培养基均置于5% CO₂气氛中，于38.5 °C条件下保存2，然后在最大湿度的空气中至少放置2小时后再使用。
  2. 在屠宰场用33–35 °C的生理盐水中收集卵巢，并在采集后4小时内运送至实验室。
  3. 将卵巢移至实验室后，使用预先加热至37 °C的生理盐水清洗三次，以去除碎片和血液。操作过程中，将卵巢保存在37 °C的生理盐水中。
  4. 用18G针头和10 mL注射器抽吸2至8 mm的卵泡。将抽吸出的卵泡液收集至50 mL离心管中。
  5. 让含有卵母细胞的卵泡液在37 °C下静置约15分钟，直至细胞沉淀。用巴斯德吸管移除试管中的上清液，并将沉淀物重悬于PBS中。
  6. 在体视显微镜下将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）回收至90 mm培养皿中。
  7. 将COCs在PBS中洗涤三次，再在成熟培养基中洗涤一次。
  8. 将形态正常的COCs转移至4孔培养板中，每孔加入500 mL成熟培养液，每孔放置50个COCs。
    注意：此处使用了三个孔，分别用于异源体外受精（heterologous IVF）、同源体外受精对照（homologous IVF control），以及仅含成熟COCs的孤雌生殖对照孔。
  9. 将COCs在38.5 °C、5% CO₂的气体环境中孵育24 h2 以及在湿度最大的空气中。
  10. 准备培养基和密度梯度。
    1. 准备受精培养基（FERT）时，在FERT-TALP培养基中添加25 mM碳酸氢盐、22 mM乳酸钠、1 mM丙酮酸钠、6 mg/mL无脂肪酸BSA和10 mg/mL肝素。在5% CO₂气氛下，于38.5 °C条件下保存2，并在使用前于最大湿度空气中至少平衡2 h。
    2. 通过向15 mL离心管中加入1 mL密度梯度介质，另取一支15 mL离心管加入3 mL洗涤液来制备密度梯度。将两管均在38.5 °C下预热至少1小时。
  11. 洗涤 体外 在FERT培养基中使成熟卵母细胞受精两次。
  12. 将卵母细胞转移至4孔培养皿中，每孔含50个COCs和250 mL受精液（FERT）。将4孔培养皿置于38.5 °C、5% CO₂的气体环境中培养。2，以及在准备精子进行受精时置于湿度最大的空气中。
  13. 将含有海豚精子的冷冻麦管在37 °C水浴中解冻50秒。
    注意：用于同源体外受精的牛精子必须按照同源牛体外受精的标准操作流程进行平行处理。
  14. 取10 µL精子样本，置于预热的精子计数板中。使用经该物种验证的计算机辅助精子分析系统评估精子活力，以客观测定精子运动能力。在此期间，将精子样本维持在38.5 °C。
  15. 将精液样本加入密度梯度管（步骤 2.10.2）。在 250 × g 条件下离心 10 分钟。
  16. 使用巴斯德移液管小心吸去上清液。向含有沉淀物的离心管中加入3 mL洗涤液。轻轻混匀以重新悬浮沉淀物。
  17. 离心5分钟，250 × g。用巴斯德吸管吸除上清液，保留300 µL精子体积。
  18. 将5 µL精子悬液加入含有95 µL蒸馏水的微量离心管中。将精子悬液保持在38.5 °C。取10 µL 1:20稀释的精子悬液填充细胞计数室，测定精子浓度。计算为100 µL精子悬液添加FERT培养基的体积，以获得2 × 10⁶ 个精子/mL的终浓度。6 精子/mL
  19. 将计算好的 FERT 和精液体积加入 15 mL 离心管中，用巴斯德吸管轻轻混匀。
  20. 向含有成熟卵母细胞和FERT培养基的4孔板的每个孔中加入250 µL精子-FERT悬浮液，使终浓度为1 x 106 spermatozoa/mL
  21. 将配子在38.5 °C、5% CO₂气体环境条件下共同孵育18小时2，以及在湿度最大的空气中。
  22. 根据添加了5% FCS的合成输卵管液配制培养基。在35 mm培养皿中制备25 µL合成输卵管液培养液滴，并覆盖3 mL矿物油。在5% CO₂气氛下，于38.5 °C恒温培养2，然后在湿度最大的空气中放置至少2小时后再使用。
  23. 共孵育2.5小时后，从培养皿中取出20枚卵母细胞；将剩余的卵母细胞在相同条件下继续置于培养箱中培养。
    1. 去除松散附着的 通过窄口巴斯德移液管剧烈吹打半数卵母细胞10次，使精子进入卵子。
    2. 将20个卵母细胞置于50 µL的0.5%戊二醛中固定30分钟。用PBS洗涤卵母细胞5分钟。将卵母细胞转移至50 µL Hoechst染色液中染色15分钟，再用PBS洗涤5分钟。
    3. 将卵母细胞逐个转移至载玻片上2 µL封片液滴中，每张载玻片放置10个卵母细胞。轻轻加盖盖玻片，并用指甲油密封。
    4. 使用配备落射荧光光学系统和361 nm激发滤光片的相差显微镜，在40倍放大倍数下计数附着在牛卵母细胞上的精子数量。
  24. 共孵育12小时后，从4孔培养皿中取出10个假定的受精卵；将剩余的假定受精卵在相同条件下继续置于培养箱中培养。
    1. 将10个疑似受精卵转移至含有2 mL PBS的15 mL离心管中，轻轻涡旋振荡2分钟以去除卵丘细胞。用PBS洗涤两次，随后固定并染色，步骤同前（步骤2.23.2）。
  25. 在共孵育18、20、22和24小时后，从4孔培养皿中取出10个假定的受精卵，涡旋、固定并按照前述方法染色（步骤2.23.2）。其余假定的受精卵在相同条件下继续置于培养箱中培养。
    1. 在同源和异源体外受精组中，使用Hoechst染色后，通过相差/落射荧光显微镜评估原核形成和多精受精现象。
    2. 每份样本随机选取10个假定的杂交受精卵，评估原核形成情况。使用共聚焦激光扫描显微镜，在488 nm氩激光激发、515至530 nm检测波长下确认原核的形成。
    3. 依次对假定的合子进行光学切片（2 mm），并使用成像软件收集图像。使用三维分析软件包进行可视化。
    4. 共孵育24小时后，将50个假定的受精卵在PBS中洗涤4次，再在培养基中洗涤2次。
  26. 以每组25个为单位，转移至预先配制并平衡的微滴培养基中。
  27. 在5% O₂气氛下，保持38.5 °C2/5% CO₂2 以及在湿度最大的空气中。
  28. 在共孵育26小时和28小时后，从培养皿中取出10个假定的受精卵，涡旋、固定并染色，操作步骤如前所述（步骤2.23.2）。
  29. 培养48小时后，在体视显微镜下观察卵裂情况。
  30. 将胚胎转移至5 mg/mL的蛋白酶溶液中以去除透明带（ZP）。
  31. 将每个胚胎分别用 PBS 洗涤三次。将胚胎置于 0.2 mL 微量离心管中，液氮速冻。于 -80 °C 保存，直至分析。

3. PCR

  1. 材料与试剂
    注意：进行PCR实验所用的试剂、材料和设备详见材料表，包括PCR管架、一套移液器（P2、P20、P200、P1000）、1.5 mL微量离心管、PCR管及管盖、PCR仪、紫外透射仪、琼脂糖凝胶和缓冲液（Tris硼酸EDTA（TBE））。
    1. 在冰上轻柔地融化所有试剂，并在实验过程中始终保持在冰上。使用脱氧核苷酸（dNTPs；dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP）、针对海豚18S核糖体蛋白编码基因（DQ404537.1）的靶向引物（R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG 和 F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA）、DNA聚合酶、5× DNA聚合酶缓冲液、DNA模板、无菌水以及氯化镁（MgCl₂）2 终浓度为 5.0 mM。
    2. 琼脂糖凝胶及样品制备
      1. 制备海豚和牛精子DNA样本。
        1. 将每种物种的冻存管在37 °C水浴中解冻50秒。加入3 mL洗涤液。在250 × g下离心10分钟。弃去上清液。加入30 µL STES裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8；20 mM NaCl；1 mM 0.1% SDS），2 µL蛋白酶K（20 mg/mL）和5 µL二硫苏糖醇（DTT）；终浓度为150 mM。在55 °C下孵育过夜。加入200 µL超纯水。在250 × g下离心5分钟。保留上清液。使用分光光度计测定DNA浓度。
      2. 对海豚精子的DNA进行连续稀释（即， 40、4 和 0.4 ng/mL）的超纯水配制，以验证PCR条件是否能够检测到微量的海豚DNA。
      3. 对牛精子DNA进行系列稀释（即， 4,000、400、40 和 4 ng/mL）的超纯水稀释液，以验证PCR条件是否能够检测到微量的牛DNA。
      4. 准备海豚和牛胚胎。将胚胎在冰上解冻。加入8 µL 100 µg/mL蛋白酶K，55 °C孵育过夜。为终止反应，将样品置于96 °C加热5分钟。
      5. 使用标准技术配制2%琼脂糖凝胶TBE缓冲液，并加入20 µL核酸染料。
    3. PCR 准备
      1. 标记PCR管：海豚系列稀释液（40、4和0.4 ng/mL）、牛系列稀释液（4,000、400、40和4 ng/mL）、同源牛二细胞胚胎、异源二细胞胚胎（假定）、阴性对照
      2. 在无菌的1.5 mL微量离心管中配制主混合液，每反应体系终体积为25 µL。
        1. 加入 5 µL 5X DNA 聚合酶 flexi 缓冲液、0.5 µL dNTPs（10 mM）和 1.5 µL MgCl₂2 （25 mM）、0.5 µL 正向引物和反向引物（10 µM）、1.5 µL DNA 模板（精子）或 8 µL DNA 模板（二细胞胚胎）、0.07 µL Taq DNA 聚合酶，加无菌蒸馏水至终体积为 25 µL。充分混匀。
  2. 扩增方案
    1. 将试管放入热循环仪中。选择以下程序：94 °C 预变性 3 min；40 个循环：94 °C 变性 15 s，59 °C 退火 25 s，72 °C 延伸 20 s；最后 72 °C 终延伸 5 min。启动程序。
    2. 将试管置于 4 °C 保存。在 4 °C 条件下，向每份 PCR 产物中加入 2.5 µL 上样缓冲液，取 15 µL 混合物加入 2% 琼脂糖凝胶的加样孔中。使用 DNA ladder 标记物以准确估算 PCR 片段的大小。
    3. 电泳15分钟以使DNA迁移。使用紫外灯观察条带。

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结果

本文展示的所有结果、表格以及图1和图2均已获得许可并予以复制3。

海豚精子在冻融后具有较高的运动能力

解冻后的海豚精液中，总活力精子百分比（% ± SD）为 84.5 ± 5.3，前向运动精子百分比为 69.1 ± 5.1。从运动能力来看，这些数值代表了高质量的冷冻保存精子。

海豚精子能够穿透完整的牛卵母细胞透明带并产生杂交胚胎

图1A 和 表1 显示，经过2.5小时共孵育后，海豚精子附着在...

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讨论

对于多种不同的哺乳动物而言，使用冻融精子具有诸多优势，包括能够转移珍贵的遗传物质、实现全球范围内的分布、降低污染风险，以及能够将雄性配子保存数十年。对于宽吻海豚而言，使用冷冻保存的精子尤为重要，因为该物种受到《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II的保护，限制了不同水族馆之间动物的运输与交换。海豚的运输不仅会带来后勤上的难题，还存在严重的安全风险。然而，避免运输同样会带来后果，例如可能导致圈养动物种群中近亲繁殖风险的增加。一个可行的解决方案是精子的冷冻保存。一些研究人员已成功对海豚精子进行冷冻保存5,7,8,9，并取得了非常令人鼓舞的结果。此外，2005年首次报道了利用冷冻保存精子通过人工授精成功诞下海豚幼崽的案例10。数年之后，研究人员还利用性别分选的精子实现了这一目标11...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由西班牙经济与竞争力部（项目编号：AGL2015-70140-R，授予 D. Rizos；项目编号：AGL2015-66145R，授予 A. Gutierrez-Adan 和 J. F. Pérez-Gutiérrez）以及穆尔西亚塞内卡基金会（项目编号：20040/GERM/16，授予 F. García-Vázquez）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FERT-TALP 培养基Merck
TCM-199SigmaM-4530
Hoechst 33342SigmaB-2261
4 孔培养皿Nunc176740
密度梯度 BoviPureNidacon InternationalBP-100
洗涤液 BoviwashNidacon InternationalBW-100
氯化镁PromegaA35 1H
无菌水Mili Q sintesis A10 MilliporeA35 1H
Tris 硼酸 EDTA 缓冲液SigmaT4415
MB 琼脂糖Biotools20.012
5X GoTaq flexi 缓冲液Mili Q sintesis A10 MilliporeM 890 A
MB 琼脂糖Biotools20.012
Taq 聚合酶Promega
SafeViewNBS Biologicals Ltd.M 890 A
Makler 计数室Sefi Medical
Thoma 计数板Hecht-Assistant
pH 计 MicropH 2000Crison Instruments
Advanced micro osmometer 3300 渗透压仪Norwood
计算机辅助精子分析系统Projectes y Serveis R+D
体视显微镜 MZ 95Leica
落射荧光光学系统 Eclipse Te300Nikon
Confocal assistant 4.02 软件Bio-Rad3D 分析软件
共聚焦激光扫描显微镜Bio-Rad
微量移液器（P2、P20、P200、P1000）Gilson
微量离心管VWR
紫外透射仪Bio-Rad
PCR 扩增仪 Primus 96 PlusMWG AG Biotech

参考文献

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