方法文章

MitoCeption：将分离的人源MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

DOI：

10.3791/55245

⸱

2017年2月22日

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1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种名为MitoCeption的技术方案，用于将人源间充质干细胞（MSC）中分离出的线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞（GSC），旨在研究线粒体对GSC代谢及功能的生物学影响。该方案可经适当调整后应用于其他类型细胞间的线粒体转移。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体在细胞代谢、能量生成以及凋亡调控中发挥核心作用。线粒体功能异常已被证实与多种疾病相关，范围涵盖神经系统疾病到癌症。有趣的是，最近研究发现线粒体具有在不同类型细胞之间转移的能力，尤其是在共培养条件下，可从人源间充质干细胞（MSC）转移至癌细胞，对接受线粒体的细胞产生代谢和功能上的影响，这进一步提升了人们对这些细胞器生物学特性的关注。

评估从间充质干细胞（MSC）转移至靶细胞的线粒体对靶细胞的影响，对于理解此类细胞间相互作用的生物学效应至关重要。本文所述的MitoCeption技术，可将预先从供体细胞中分离的线粒体转移至靶细胞，本方案以MSC来源的线粒体与胶质母细胞瘤干细胞（GSC）作为模型系统。此前，该技术已成功用于将从MSC中分离的线粒体转移至贴壁生长的MDA-MB-231癌细胞。本研究对该线粒体转移方案进行了优化，以适应具有神经球样生长特性的GSC。 体外可通过荧光激活细胞分选（FACS）和共聚焦成像结合线粒体活体染料来追踪分离线粒体的转移情况。利用具有不同单倍型（SNPs）的线粒体供体细胞和靶细胞，还可根据转移线粒体的环状线粒体DNA（mtDNA）在靶细胞中的浓度来检测线粒体的转移。在通过上述标准验证该实验方案后，可进一步分析携带转移线粒体的细胞，以确定外源性线粒体对细胞代谢、可塑性、增殖能力及治疗反应等生物学特性的影响。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体是存在于真核细胞中的细胞器，在营养物质摄取以及能量和代谢物生成中发挥核心作用。这些细胞器含有环状的线粒体DNA（mtDNA），长度为16.6 kb，编码电子传递链复合物的蛋白质、tRNA和rRNA1。这些细胞器的功能对细胞稳态至关重要，多种病理状态已被证实与线粒体功能障碍相关1,2,3。例如，线粒体状态已被证实与炎症、感染性疾病和癌症相关，在癌症中尤其影响转移及治疗耐药性4,5,6,7。

线粒体具有在"供体"与"靶细胞"之间转移的显著能力。这种转移会导致靶细胞的能量代谢发生变化，以及其他功能改变，例如组织修复能力及对化疗药物的耐受性增强，这一点已被多个实验室近期的研究证实8,9,10,11,12,13,14,15,16。人类间充质干细胞（MSCs）具备将线粒体转移至多种靶细胞的能力，这些靶细胞包括心肌细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞以及肿瘤细胞，从而引起这些细胞功能特性的改变8,9,10,12,17,18。

线粒体交换现已被认为是一种广泛存在的机制，可使多种不同类型的细胞相互交流并改变其生物学特性。这种线粒体交换可通过形成隧道纳米管（TNT）实现，该过程涉及含连接蛋白43（connexin 43）的缝隙连接8，或由M-Sec/TNFaip2与外泌复合体（exocyst complex）介导19。此外，研究也发现线粒体转移可由含抑制蛋白结构域蛋白1（arrestin domain-containing protein 1）介导的微囊泡（ARMMs）所介导20。有趣的是，线粒体转移的效率与Rho GTP酶1 MIRO1的表达水平相关21，这一关键因子可用于解释iPSC-MSCs与成体BM-MSCs之间线粒体转移效率差异的原因22。

尽管已有大量关于细胞间线粒体交换的数据，但对这种线粒体转移的代谢和生物学效应仍知之甚少。因此，建立适当的工具以全面评估该转移的生物学效应具有充分的必要性。多年来，已提出多种将线粒体从供体细胞转移至受体细胞的技术方法，包括将线粒体直接注射到卵母细胞中23,24,25、通过细胞融合生成线粒体杂交细胞（transmitochondrial cybrids）26,27 ，以及近年来利用光热纳米刀（photothermal nanoblades）转移分离的线粒体28。

我们及其他研究者此前已证实，分离的线粒体可被活细胞摄取，这一点已在体外和体内观察到 体外 和 体内 29,30,31，据推测该过程涉及巨胞饮作用 32我们进一步开发了一种名为MitoCeption的方法，可将分离的线粒体（来自MSCs）定量转移至靶细胞，以贴壁生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞系为例进行了验证 31本方案在此针对分离的人源MSC线粒体向胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的转移进行了优化。

胶质母细胞瘤是一种侵袭性极强的脑部恶性肿瘤，由于肿瘤内存在胶质母细胞瘤干细胞（GSC），会迅速产生治疗耐药性 33这些GSC以神经球形式生长 体外 在异种移植模型中形成肿瘤。胶质母细胞瘤中的癌细胞具有细胞间连接的能力，这一点最近在星形细胞脑肿瘤细胞中得到证实：这些细胞通过延伸的微管相互连接，线粒体（以及钙离子和细胞核）可通过这些微管迁移，从而形成对放射治疗具有抵抗性的星形细胞瘤网络 34胶质母细胞瘤能够募集肿瘤微环境中的多种不同细胞，包括间充质干细胞（MSCs） 35,36我们发现，间充质干细胞（MSCs）在共培养条件下能够与胶质瘤干细胞（GSCs）形成细胞间连接，并向其转移线粒体（数据未显示），这有望改变GSC的功能特性。本实验方案描述了如何利用MitoCeption技术，将预先从人源MSCs中分离的线粒体转移至人源GSCs中，以评估其功能性的生物学效应。多能性高且具有强致瘤性的Gb4 GSC细胞系 37 在本研究中使用。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

第1天

1. 间充质干细胞（MSC）线粒体的标记（可选）

  1. 在线粒体制备前两天，将人源MSCs接种于100 mm培养皿中，加入10 ml含10% FBS的αMEM培养基，使第1天培养的MSCs数量达到4 × 105个。
  2. 用4 ml PBS清洗MSCs，然后加入4 ml预热至37 °C的含1% FBS的αMEM培养基。
  3. 加入适量的线粒体活体染料，将细胞置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
  4. 移除线粒体染料溶液，用4 ml预热（37 °C）的含1% FBS的αMEM培养基清洗细胞两次，再加入4 ml含10% FBS的αMEM培养基，于37 °C继续孵育细胞。
  5. 在30分钟后更换培养基（10 ml含10% FBS的αMEM），之后再于2小时后更换一次。

第1天

2. 胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的标记（可选，参见讨论部分）

细胞培养基成分
GSC 基础培养基 DMEM/F-12，添加 
胰岛素 20 mg/ml
N2 添加剂 1x
葡萄糖 3 g/L
L-谷氨酰胺 2 mM
GSC 增殖培养基在基础培养基中添加： 
B27 添加剂 1x
EGF 10 ng/ml
bFGF 10 ng/ml
Fungine 10 mg/ml
Fungizone 0.25 mg/ml
肝素 2 mg/ml
环丙沙星 2 μg/ml
庆大霉素 2 μg/ml
MSC 增殖培养基 αMEM，添加
L-谷氨酰胺 2 mM
10% FBS
bFGF 2 ng/ml

表1：培养基。

  1. 解离在聚HEMA包被的细胞培养瓶中生长的GSCs（Gb4细胞系32，10 × 106个细胞），培养形式为神经球（参见步骤3.1至3.12）。
  2. 将GSCs以每孔105个细胞的密度接种于48孔板中，每孔加入500 µl GSC增殖培养基（参见表1）。
  3. 在20 °C下以270 × g离心5分钟。
  4. 加入所需量的细胞活体染料，并在37 °C下孵育30分钟。
  5. 向48孔板的每孔中加入500 µl GSC基础培养基（表1）。
  6. 在20 °C下以270 × g离心5分钟，吸除上清液。
  7. 重复步骤2.5至2.6。
  8. 每孔加入500 µl GSC基础培养基，并在37 °C下孵育30分钟。
  9. 在20 °C下以270 × g离心5分钟，吸除上清液。
  10. 向48孔板的每孔中加入500 µl GSC增殖培养基，并置于37 °C培养箱中孵育。
    注：所指示的GSCs数量（10 × 106个细胞）足以进行不同的剂量-反应实验和FACS对照。一旦实验条件进一步明确，可减少该细胞用量。

第2天

3. 胶质母细胞瘤干细胞的接种

  1. 在50 ml离心管中，以270 × g离心10 × 106个GSC神经球，离心5分钟，温度为20 °C。
  2. 用5 ml HBSS洗涤细胞，并在20 °C下以270 × g离心5分钟。
  3. 吸除上清液。
  4. 将GSC沉淀物轻轻重悬于100 µl胰蛋白酶-EDTA（0.25%）中（每10 × 106个细胞）。
  5. 在37 °C孵育3分钟。
  6. 加入10 µl CaCl2（20 mM）和2 µl DNase I（10 mg/ml）。
  7. 使用P200移液器轻轻吹打30–50次以解离神经球。避免产生气泡。在显微镜下检查确认所有GSC均已解离。
  8. 加入10 µl胰蛋白酶抑制剂（5%）和10 ml HBSS。
  9. 在20 °C下以270 × g离心GSC 7分钟。
  10. 弃去上清液，并加入10 ml GSC基础培养基（表1）。
  11. 使用Thoma计数板对GSC进行计数，然后在20 °C下以270 × g离心7分钟。
  12. 加入适量的GSC增殖培养基（表1），使细胞浓度达到106个GSC/ml。
  13. 每孔96孔板接种105个GSC（即100 µl细胞悬液）。
  14. 将96孔板在20 °C下以270 × g离心7分钟，使GSC沉降至孔底。
  15. 将96孔板在37 °C孵育，直至进行第5节操作。

第2天

4. 间充质干细胞线粒体的分离

  1. 将微量离心管离心机的温度调节至 4 °C。
  2. 准备两个 1.5 ml 离心管，分别标记为"A"和"C"，其中分别加入线粒体提取试剂（200 µl 试剂 A 和 400 µl 试剂 C，均含有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。另准备两个离心管，分别标记为"MSC"和"Mito"。将所有离心管置于冰上。同时准备用于线粒体系列稀释的离心管。
  3. 用 10 ml 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤 MSCs。
  4. 用 2 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶洗涤 MSCs 10 秒，然后加入 1 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育细胞 5–10 分钟。
  5. 加入 10 ml αMEM/FBS 10% 收集细胞，并转移至 50 ml 离心管中。
  6. 在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。
  7. 弃去上清液，并向细胞沉淀中加入 10 ml αMEM/FBS 10%。
  8. 使用 Malassez 计数板对 MSCs 进行计数。
  9. 将 MSCs（4–5 × 105）在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。
  10. 弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 ml 冰冷的 αMEM/FBS 10%，并将细胞转移至步骤 4.2 中准备的标记为"MSC"的离心管中。将离心管置于冰上。
  11. 将含有 MSCs 的离心管在 4 °C 下以 900 × g 离心 5 分钟。
  12. 彻底去除管中残留的培养基。
  13. 加入 200 µl 线粒体分离试剂 A（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。中等速度涡旋振荡 5 秒，然后将离心管准确置于冰上静置 2 分钟。
  14. 加入 2.5 µl 线粒体分离试剂 B。以最高速度涡旋振荡 10 秒，然后将离心管放回冰上。每 30 秒重复一次，持续 5 分钟。
  15. 加入 200 µl 线粒体分离试剂 C（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。通过倾斜离心管混合溶液（约 30 次，切勿涡旋振荡）。在 4 °C 下以 700 × g 离心 10 分钟。
  16. 将上清液（含 MSC 线粒体）转移至步骤 4.2 中准备的标记为"Mito"的离心管中。
  17. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 15 分钟，以获得线粒体沉淀。弃去上清液。沉淀即为分离的线粒体。
  18. 用 200 µl 试剂 C 冲洗线粒体沉淀。然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，以获得线粒体沉淀。

5. 分离的间充质干细胞线粒体向胶质瘤干细胞的转移（MitoCeption）

  1. 向从MSCs（4 × 105）中分离得到的线粒体沉淀中加入200 µl预冷（0 °C）的GSC增殖培养基。
  2. 将线粒体制备物（溶于GSC增殖培养基中）进行稀释，以确保向GSCs中恒定加入20 µl线粒体悬液。
  3. 将分离得到的线粒体按所需浓度（0.1 至 10 µg）加入含有GSCs（来自步骤3.15）的96孔板孔中。缓慢加入线粒体悬液，靠近孔底，并至少覆盖整个孔底表面一次。
  4. 为控制MSC线粒体活力染料的泄漏，将相同量的线粒体制备物（0.1 至 10 µg）加入仅含有GSC增殖培养基（无GSCs）的96孔板孔中（活力染料泄漏检测见第6.2部分）。
  5. 将含有接受线粒体的GSCs及MSC线粒体的96孔板（步骤5.3）以及对照板（步骤5.4）在4 °C下以1,500 × g离心15分钟。
  6. 离心后立即将培养板放入37 °C细胞培养箱中。
    注意：线粒体转移方案依赖于在线粒体供体/受体细胞系统中，以适当的离心力将线粒体悬液离心至培养细胞上，离心次数可根据具体细胞系统进行调整。

第3天

6. 通过流式细胞术和共聚焦成像分析线粒体转移

  1. 用于FACS分析的GSC样本制备
    注意：如果MSC线粒体在之前已用活体染料标记（第1节），则可在线粒体转移后24小时通过FACS监测其效率。
    1. 将含有MitoCepted GSC的96孔板在20 °C下以270 × g离心5分钟。
    2. 弃去上清液。
    3. 每孔加入100 µl胰蛋白酶（不含EDTA），在37 °C孵育3分钟。用移液器吹打数次，以解离24小时内形成的神经球。
    4. 加入100 µl GSC基础培养基。
    5. 将96孔板在20 °C下以270 × g离心5分钟，并弃去上清液。
    6. 将GSC重悬于300 µl GSC基础培养基中，并转移至适用于FACS的试管中。
    7. 进行FACS分析。
  2. 线粒体活体染料从分离线粒体中泄漏的对照实验（FACS）
    注意：此步骤的目的是确定FACS背景信号，该信号并不代表真实的MSC线粒体转移，而仅仅是由于用于MitoCeption的标记MSC线粒体（步骤5.3）中活体染料的泄漏所致。
    1. 按照步骤3.1至3.15所述方法接种GSC细胞。
    2. 在37 °C孵育细胞1小时。
    3. 将仅含线粒体的96孔板（来自步骤5.4至5.6）在20 °C下以1,500 × g离心5分钟。
    4. 吸去GSC 96孔板（步骤6.2.2）中的培养基，并替换为仅与线粒体孵育过的培养基（来自步骤6.2.3的上清液）。
    5. 将含有GSC的96孔板在37 °C孵育2小时。
    6. 按照步骤6.1.1至6.1.7进行FACS分析。
  3. 用于共聚焦成像的GSC样本制备
    注意：如果需通过荧光成像分析MSC线粒体向GSC的转移，则需事先分别用线粒体（步骤1）和细胞（步骤2）活体染料对MSC和GSC进行标记。
    1. 按照步骤6.1.1至6.1.5的方法制备GSC。
    2. 将GSC重悬于2 ml含2% FBS的GSC增殖培养基中，并接种至35 mm培养皿（玻璃底）中。
    3. 在24小时后对含有转移荧光MSC线粒体的GSC进行共聚焦成像。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过MitoCeption技术分离间充质干细胞（MSC）的线粒体并将其转移至靶向胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的操作步骤如图1所示。GSC是具有干细胞特性的肿瘤干细胞，以神经球形式培养以维持其干细胞特性。在本实验方案中，为提高线粒体转移效率（参见流式细胞术数据图3B），在进行线粒体转移（步骤3）前数小时，需将GSC以单细胞形式接种。在第5节操作后（第3天），这些细胞再次呈现为形成神经球的状态（图1）。

Gb4 GSCs 经荧光标记的 MSC 线粒体进行 MitoCeption 处理 72 小时后成像显示，MSC 来源的线粒体已定位于 Gb4 GSCs 内部，共聚焦显微镜获取的正交视图证实了这一点（图 2B）。转移的 MSC 线粒体在 GSCs 内呈广泛分布，这与内源性 GSC 线粒体的分布模式一致（图 2...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

越来越多的研究表明，细胞之间可以交换线粒体，而这些线粒体对受体细胞的代谢和功能具有深远影响。因此，掌握将线粒体从供体细胞定量转移至受体细胞的技术至关重要，这有助于准确研究其生物学效应。

本方案最初设计用于将人骨髓间充质干细胞中分离的线粒体转移至贴壁生长的癌细胞系 MDA-MB-231 33如图所示，该方法可适用于以神经球形式生长的肿瘤干细胞 体外尽管当间充质干细胞的线粒体被添加到胶质瘤干细胞神经球时确实会发生线粒体转移，但如本方案所述，该过程在单细胞状态的胶质瘤干细胞中效率更高。本方案也可推广至其他非贴壁细胞，例如T细胞，但需根据MitoCeption步骤调整接种细胞浓度。

线粒体的制备应在冰上进行，以保持其完整性。为了获得细胞质化合物污染较少的线粒体制备物，采用3,000 × g离心15分钟以回收线粒体。为了监测用于向GSCs转移的MSC线粒体用量，需测定线粒体的蛋白含量。为此，使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液制备线粒体蛋白提取物。按照制造商说明书，采用...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J. 和 M-L.V. 所属的法国国家健康与医学研究院（INSERM）已就 MitoCeption 技术提交了专利申请（EP14306154.7）。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We thank Andrea Parmeggiani (L2C and DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) as well as members of the laboratory for helpful discussions, Christophe Duperray for help with the FACS analysis, the Montpellier RIO imaging facility (MRI) for providing the adequate environment for FACS and confocal microscopy. B.N.M was supported by a graduate fellowship from the LabEx Numev (convention ANR-10-LABX-20). A.B. was supported by an undergraduate fellowship from the University of Warsaw and European Union (n° POKL.04.01.02-00-221/12). M.L.V is a staff scientist from the National Center for scientific research (CNRS).

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织线粒体分离试剂盒 Fisher Scientific 10579663
N-2 补充剂（100 倍浓缩）Fisher Scientific11520536
B-27 补充剂（不含维生素 A）（50 倍浓缩）Fisher Scientific 11500446
无钙 HBSS2+ 无镁2+ SigmaH4385
多聚血红素 Sigma P3932
不含谷氨酰胺的aMEMOzymeBE12-169F
不含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基Fisher Scientific 11540566
L-谷氨酰胺 Invitrogen 25030-024 
葡萄糖 Sigma G7021
胰岛素 Sigma I 1882 
人类 bFGF R&D Systems233-FB-025
人表皮生长因子 Peprotech AF-100-15 
肝素SigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
胰蛋白酶抑制剂Sigma T9003
DNase ISIGMA 10104159001
0.25% 胰蛋白酶 / EDTA 1 mMInvitrogen 25200056
胰蛋白酶Gibco 15090-046
不含EDTA的蛋白酶抑制剂Sigma4693159001
环丙沙星 Sigma17850-5G-F
真菌素 Invivogenant-fn-1
两性霉素B 赛默飞世尔科技15290018
庆大霉素EuromedexEU0410
MitoTracker Green FM分子探针M7514
MitoTracker Red CMXRos分子探针 M7512
MitoTracker Deep Red FM分子探针 M22426 
CellTracker Green CMFDA分子探针C7025
CellTracker Blue CMF2HC分子探针C12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish 无菌培养皿世界精密仪器公司FD35-100
血细胞计数板Fisher Scientific267110
FACS 管贝克曼库尔特2,523,749
FACS 仪器Gallios  3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS 罗氏3515885001

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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