MitoCeption：将分离的人源MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

摘要

本文介绍了一种线粒体转移方案（MitoCeption），旨在将从人源间充质干细胞（MSC）中分离的线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞（GSC），以研究其对GSC代谢和功能的生物学影响。该方案可经适当调整后用于其他细胞类型间的线粒体转移。

摘要

线粒体在细胞代谢、能量生成以及凋亡调控中发挥核心作用。线粒体功能异常已被证实与多种疾病相关，范围涵盖神经系统疾病到癌症。有趣的是，最近研究发现线粒体具有在不同类型细胞之间转移的能力，尤其是在共培养条件下，可从人源间充质干细胞（MSC）转移至癌细胞，从而对接受线粒体的细胞产生代谢和功能上的影响，这进一步提升了人们对这些细胞器生物学特性的关注。

评估从间充质干细胞（MSC）转移至靶细胞的线粒体对靶细胞的影响，对于理解此类细胞间相互作用的生物学效应至关重要。本文所述的MitoCeption技术，可将预先从供体细胞中分离的线粒体转移至靶细胞，本方案以MSC来源的线粒体与胶质母细胞瘤干细胞（GSC）作为模型系统。此前，该技术已成功用于将从MSC中分离的线粒体转移至贴壁生长的MDA-MB-231癌细胞。本研究对该线粒体转移方案进行了优化，以适用于具有神经球样生长特性的GSC。 体外可通过荧光激活细胞分选（FACS）和共聚焦成像结合线粒体活体染料来追踪分离线粒体的转移。利用具有不同单倍型（SNPs）的线粒体供体细胞和靶细胞，还可根据转移线粒体的环状线粒体DNA（mtDNA）在靶细胞中的浓度来检测其转移情况。在通过上述标准验证该实验方案后，可进一步分析携带转移线粒体的细胞，以确定外源性线粒体对细胞代谢、可塑性、增殖能力及治疗反应等生物学特性的影响。

引言

线粒体是存在于真核细胞中的细胞器，在营养摄取以及能量和代谢物生成中发挥核心作用。这些细胞器含有环状的线粒体DNA（mtDNA），长度为16.6 kb，编码电子传递链复合物的蛋白质、tRNA和rRNA¹。这些细胞器的功能对细胞稳态至关重要，多种病理状况已被证实与线粒体功能障碍相关^1,2,3。例如，线粒体状态已被证实与炎症、感染性疾病和癌症相关，在癌症中尤其影响转移及治疗耐药性^4,5,6,7。

线粒体具有在"供体"与"靶细胞"之间转移的显著能力。这种转移会导致靶细胞的能量代谢发生变化，以及其他功能改变，例如组织修复能力及对化疗药物的耐受性增强，这一点已被多个实验室近期的研究证实^8,9,10<....

方案

第1天

1. 间充质干细胞（MSC）线粒体的标记（可选）

1. 在线粒体制备前两天，将人源MSCs接种于100 mm培养皿中，加入10 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基，使第1天培养的MSCs数量达到4 × 10⁵个。
2. 用4 ml PBS洗涤MSCs，然后加入4 ml预热至37 °C的含1%胎牛血清的αMEM培养基。
3. 加入适量的线粒体活体染料，将细胞置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
4. 移除线粒体染料溶液，用4 ml预热（37 °C）的含1%胎牛血清的αMEM培养基洗涤细胞两次，再加入4 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基，于37 °C继续孵育细胞。
5. 在30分钟后更换培养基（10 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基），并在2小时后再次更换一次。

第1天

2. 胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的标记（可选，参见讨论部分）

细胞培养基

成分

结果

通过MitoCeption技术分离间充质干细胞（MSC）中的线粒体并将其转移至靶向的胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的操作步骤如图1所示。GSC是维持干细胞特性的肿瘤干细胞，以神经球形式培养。在本实验方案中，为提高线粒体转移效率（参见流式细胞术数据图3B），在进行线粒体转移（步骤3）前数小时将GSC以单细胞形式接种。在第5节操作后（第3天），这些细胞再次呈现神经球形态（图1）。

Gb4 GSCs 在接受荧光标记的 MSC 线粒体进行 MitoCeption 处理 72 小时后成像显示，MSC 来源的线粒体已定位于 Gb4 GSCs 细胞内，共聚焦显微镜获取的正交视图证实了这一点（图 2B）。转移的 MSC 线粒体在 GSCs 内呈广泛分布，这与内源性 GSC 线粒体的分布模式一致（图 2A.......

讨论

越来越多的研究表明，细胞之间可以交换线粒体，而这些线粒体对受体细胞的代谢和功能具有深远影响。因此，掌握将线粒体从供体细胞定量转移至受体细胞的技术至关重要，这有助于准确研究其生物学效应。

本方案最初设计用于将人源间充质干细胞中分离的线粒体转移至贴壁生长的癌细胞系 MDA-MB-231 ³³如图所示，该方法可适用于以神经球形式生长的肿瘤干细胞 体外尽管当间充质干细胞的线粒体被添加至胶质瘤干细胞神经球时确实会发生线粒体转移，但如本方案所述，该过程在单细胞状态的胶质瘤干细胞中效率更高。本方案也可推广至其他非贴壁细胞（如T细胞），但需针对MitoCeption步骤调整接种细胞浓度。

线粒体的制备应在冰上进行，以保持其完整性。为了获得细胞质化合物污染较少的线粒体制剂，采用3,000 × g离心15分钟以回收线粒体。为了监测用于向GSCs转移的MSC线粒体用量，需测定线粒体的蛋白含量。为此，使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液制备线粒体蛋白提取物。按照制造商的说明，采用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织线粒体分离试剂盒	Fisher Scientific	10579663
N-2 补充剂（100 倍浓缩）	Fisher Scientific	11520536
B-27 补充剂（不含维生素 A，50 倍浓缩）	Fisher Scientific	11500446
不含钙的HBSS2+ 不含 Mg2+	Sigma	H4385
多聚血红素	Sigma	P3932
不含谷氨酰胺的aMEM	Ozyme	BE12-169F
不含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基	Fisher Scientific	11540566
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
葡萄糖	Sigma	G7021
胰岛素	Sigma	I 1882
人类 bFGF	R&D Systems	233-FB-025
人表皮生长因子	Peprotech	AF-100-15
肝素	Sigma	H3149
CaCl2	默克	2382
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
0.25% 胰蛋白酶 / EDTA 1 mM	Invitrogen	25200056
胰蛋白酶	Gibco	15090-046
不含EDTA的蛋白酶抑制剂	Sigma	4693159001
环丙沙星	Sigma	17850-5G-F
真菌素	Invivogen	ant-fn-1
两性霉素B	赛默飞世尔科技	15290018
庆大霉素	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	分子探针	M7514
MitoTracker Red CMXRos	分子探针	M7512
MitoTracker Deep Red FM	分子探针	M22426
CellTracker Green CMFDA	分子探针	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	分子探针	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish 无菌培养皿	世界精密仪器公司	FD35-100
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
FACS 管	贝克曼库尔特	2,523,749
FACS 仪器	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	罗氏	3515885001