利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

摘要

此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA 相互作用组。

摘要

了解RNA如何与自身及其他RNA相互作用，是理解细胞中基于RNA的基因调控的关键。尽管已有研究表明RNA-RNA相互作用（如miRNA与mRNA的相互作用）可调控基因表达，但RNA在细胞内相互作用的广泛程度仍不清楚。以往研究RNA相互作用的方法主要集中于与特定蛋白质或特定RNA分子结合的RNA子集。本文详细介绍了一种名为 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用的全基因组捕获）技术，可实现RNA相互作用的全基因组范围捕获 体内 以无偏倚的方式。SPLASH 利用 体内 交联、邻近连接和高通量测序，以全局性鉴定RNA分子内和分子间的碱基配对伙伴。SPLASH技术可应用于多种生物体，包括细菌、酵母和人类细胞，以及不同的细胞状态，有助于深入理解多种细胞背景下RNA结构的动态特征。完整的SPLASH实验流程约需5天完成，计算分析流程约需7天完成。

引言

研究大分子如何折叠以及如何相互作用是理解细胞内基因调控的关键。尽管过去十年中，大量研究集中在DNA和蛋白质如何参与基因调控方面，但关于基因表达的转录后调控，目前了解仍相对较少。RNA的信息不仅存在于其线性序列中，也存在于其二级和三级结构中¹。RNA在体内能够与自身或其他RNA发生碱基配对，这种能力对其功能至关重要。in vivo。近年来，高通量RNA二级结构探测技术的进步为转录组中双链和单链区域的位置提供了宝贵的见解^{2,3,4,5,6,7,8}，然而关于配对相互作用伙伴的信息仍然严重缺乏。要确定转录组中哪些RNA序列正在与另一RNA区域发生相互作用，我们需要全局性的成对信息。

以全局性、无偏倚的方式绘制RNA成对相互作用图谱一直是重大挑战。尽管此前已有CLASH等方法⁹, hiCLIP

方案

1. 用生物素标记的补骨脂素处理 HeLa 细胞及 RNA 提取

1. 在10 cm培养皿中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养HeLa细胞。
2. 用5 mL 1× PBS洗涤HeLa细胞两次。将培养皿垂直放置1分钟，彻底去除多余的PBS。
3. 向细胞中均匀加入1 mL含有200 µM生物素化补骨脂素和0.01% w/v皂苷（digitonin）的PBS，于37 °C孵育5分钟。生物素化补骨脂素本身可进入细胞，但在0.01%皂苷中处理5分钟可显著提高其细胞通透性。
4. 取下含处理后HeLa细胞的10 cm培养皿盖，将培养皿平放于冰上。使用紫外交联仪，在距紫外灯管3 cm处，以365 nm紫外光在冰上照射20分钟。
5. 按照试剂盒说明书，采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取HeLa细胞总RNA。加入等体积异丙醇，在室温下沉淀RNA 30分钟。
   暂停点：RNA可在异丙醇中于-20 °C长期保存。此步骤可进行点杂交（dot blot）检测，以确认生物素化补骨脂素已成功进入细胞并在体内（in vivo）实现RNA交联（图2）。
6. 在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，收集沉淀的RNA。弃去上清液，加入1 mL 70%冷乙醇洗涤RNA沉淀。
7. 在4 °C下以20,....

结果

图1展示了SPLASH实验流程的示意图。在加入生物素标记的补骨脂素并添加0.01%的皂苷（digitonin）后进行紫外交联，随后从细胞中提取总RNA，并进行点杂交以确认生物素已高效交联至RNA上（图2）。我们使用生物素标记的20碱基寡核苷酸作为阳性对照，以滴定加入细胞的生物素化补骨脂素的用量，使大约每150个碱基中有一个发生交联。

由于PCR扩增循环次数增加时更容易发生PCR重复事件，我们使用不同PCR循环次数进行小规模PCR扩增，以确定能够提供足够深度测序材料的最低扩增循环数。在高效的文库构建过程中，我们能够在少于15个PCR扩增循环内，从1.5 µg经片段大小筛选的RNA起始量中扩增出cDNA测序文库（图3）。随后，使用高通量测序仪进行2×150 bp双端测序，并根据<.......

讨论

本文详细描述了 SPLASH 方法的实验与计算工作流程，该方法能够以全基因组范围的方式鉴定 RNA 分子间的成对相互作用。我们已成功在细菌、酵母和人类细胞培养物中应用 SPLASH，并预期该策略可广泛适用于不同细胞状态下多种生物体。本实验方案中的一个关键步骤是起始材料需至少含有 20 µg 的交联 RNA，以确保后续步骤有足够的起始量。随后将 RNA 片段化至约 100 个碱基，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行片段大小筛选。这些步骤对于在文库构建过程中优先富集连接形成的嵌合 RNA 分子而非单体分子至关重要。通常在完成片段化及首次大小筛选后，可回收约 1.5 µg 的 RNA，随后根据 SPLASH 工作流程将其转化为 cDNA 文库。我们发现，使用该量级的起始 RNA 可在少于 15 个 PCR 扩增循环的条件下获得足够用于高通量测序的文库材料。由于 PCR 扩增循环次数增加会导致扩增重复序列数量急剧上升，因此保持较低的扩增循环数对于在后续分析中有效识别出有意义且唯一的嵌合序列至关重要。

与其它基于补骨脂素的全基因组策略不同，SPLASH 利用生物素标记的补骨脂素将碱基配.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS 溶液	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M 醋酸钠溶液	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	核酸沉淀所需
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，19:1	Bio-Rad	1610145	TBE 尿素凝胶组分
Ambion 缓冲液试剂盒	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
过硫酸铵，分子生物学级	Promega	V3131	TBE 尿素凝胶组分
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126-25G
氯仿	Merck	1.02445.1000	RNA 提取
单链 DNA 连接酶	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA 连接酶
离心管滤器	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X 离心管滤器
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	用于细胞处理
Dark Reader 透射仪	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X 透射仪	蓝光透射仪
DNA 凝胶上样染料 (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	琼脂糖凝胶电泳所需
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Pan BioTech	P04-03500	用于 HeLa 细胞培养
链霉亲和素磁珠	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1
适用于 15 mL 管的磁力架	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
适用于 15 mL 管的磁力架	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
生物素标记的补骨脂素	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm 紫外灯泡
胎牛血清	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	HeLa 培养基组分
甲酰胺	Promega	H5052	杂交缓冲液组分
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm 紫外灯泡
糖原	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	核酸沉淀所需
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	核酸定量用分光光度计
无核酸酶水	First BASE	BUF-1180-500ml
青霉素-链霉素	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	HeLa 培养基组分
高保真 DNA 聚合酶 (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液，2x）
引物组 1	New England Biolabs	E7335L	PCR 引物
DNA 凝胶回收试剂盒	QIAgen	28106	QIAquick 凝胶回收试剂盒
荧光定量试剂盒	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS 检测试剂盒
RNA 纯化试剂盒	Qiagen	74106	RNeasy Mini 试剂盒 硅胶膜柱
RNase 抑制剂	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
逆转录酶	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III 第一链合成预混液
核酸凝胶染料	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD 核酸染料 500 µL
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201L	末端修复酶
T4 RNA 连接酶 1	New England Biolabs	M0204L	邻近连接用酶
T4 RNA 连接酶 2，截短型 KQ	New England Biolabs	M0373L	接头连接用酶
TEMED	Bio-Rad	1610801	TBE 尿素凝胶组分
硫氰酸胍-苯酚-氯仿	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® 试剂，用于 RNA 提取
尿素	First BASE	BIO-2070-5kg
紫外交联仪	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
紫外透射仪	UVP	95-0417-01	用于条带可视化
二甲苯青 FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA 纯化试剂盒	Zymo Research	D4004	Zymo DNA 浓缩柱-5
所需软件列表
FastQC 软件	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep 软件	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA 软件	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS 软件	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ 软件	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR 软件	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON 脚本	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON 脚本	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK 脚本	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
缓冲液组成
洗脱缓冲液
0.3 M 醋酸钠
裂解缓冲液
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
除洗涤磁珠外，使用前均需新鲜加入 Superase-in
蛋白酶 K 缓冲液
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
杂交缓冲液
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% 甲酰胺（避光保存于 4 °C）
使用前需新鲜加入 Superase-in
2x SSC 洗涤缓冲液
2x 氯化钠-柠檬酸钠（SSC）（由 20x SSC Invitrogen 储液稀释）
0.5% SDS
2x RNA 断裂缓冲液
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA 上样染料
95% 甲酰胺
0.02% SDS
0.02% 溴酚蓝
0.01% 二甲苯青
1 mM EDTA
3' RNA 接头序列： 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT 引物序列： AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG