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方法文章

无血清条件下小规模扩增人iPSC用于常规免疫细胞化学鉴定

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DOI：

10.3791/55260

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2017年2月18日

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

本文内容

摘要

在将诱导性多能干细胞（iPSCs）用于其他应用之前，常规鉴定这些细胞以确认其多能状态的维持情况，是一项重要的步骤。本文介绍一种专为通过免疫细胞化学方法对人iPSCs进行简便且常规鉴定而设计的小规模传代培养方法。

摘要

由于人诱导性多能干细胞（hiPSCs）具有患者特异性和典型的干性特征，其在疾病建模和细胞治疗领域受到广泛关注。然而，在将这些细胞用于上述应用之前，必须确认iPSCs的多能性，因为多能性是其功能发挥的关键。尽管需要通过多种细胞和功能检测对iPSCs进行严格的表征以确立其多能性，但通过免疫细胞化学技术可更简便、有效地实现对多能性维持情况的常规评估。本文介绍了一种系统性的hiPSCs培养方案，采用缩小规模的培养方式，特别有助于利用免疫细胞化学方法验证其多能状态。更具体而言，该方法包含在无血清条件下高效且经济地培养iPSCs，并将其接种于适合免疫细胞化学分析的小型腔室载玻片或玻璃盖玻片上的完整流程。

引言

将人类成体体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），为获取可用于疾病研究的患者特异性细胞提供了潜在的无限来源1,2重现疾病表型 体外 将有助于研究与疾病相关的细胞和分子机制，并推动药物发现和个性化医疗的发展3此外，人诱导多能干细胞（hiPSCs）具有分化为特定细胞类型的潜力，可作为独特资源用于替代多种疾病状态下死亡或功能异常的细胞，从而恢复其功能4,5.

在上述应用中使用iPSCs的一个重要前提是确保其多能性和未分化状态在体外扩增过程中得以维持。通常，人们采用流式细胞术、蛋白质印迹、聚合酶链式反应以及功能检测等技术对iPSCs的多能性进行详细分析，但这些方法需要大量细胞和专用设备6,7,8,9,10。然而，通过有限地扩增这些细胞并专门用于免疫细胞化学（ICC）检测，即可有效实现对iPSCs未分化状态的常规评估，从而节省时间和资源。

近期的技术进步使得诱导多能干细胞（iPSCs）能够在明确的无血清条件下生长，这相较于需要小鼠成纤维细胞饲养层和含血清培养基的传统培养系统是一项显著改进。然而，目前的文献中尚缺乏清晰的分步操作方案，来描述如何将iPSCs从饲养层依赖体系过渡到无饲养层培养系统。

在此背景下，本实验方案系统地阐述了如何将生长在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）饲养层上的人诱导多能干细胞（hiPSCs）（1）适应于无血清培养基中传代培养，以及（2）在小规模培养条件下进行培养，以专门支持稳健的免疫细胞化学分析。总体而言，该方法为在无血清条件下常规传代培养人iPSCs并利用免疫细胞化学技术验证其多能性提供了一种及时且经济有效的方法。

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方案

人源性皮肤成纤维细胞取自4 mm皮肤钻孔活检组织，经实验室内部重编程获得人诱导多能干细胞（hiPSCs） 通过 仙台病毒介导的重编程11亚利桑那大学机构审查委员会批准了所有受试者招募和活检样本采集的程序。

1. 用于iPSC培养的细胞外基质包被表面的制备

  1. 在生长于iMEFs上的hiPSC培养物达到汇合前一天，准备包被细胞外基质（Matrigel）的培养板。
  2. 将一份细胞外基质（根据批号不同，遵循说明书上的指示）置于冰上并在4 °C下缓慢解冻2小时。
  3. 在生物安全柜中，使用预冷的移液器吸头（储存于-20 °C），按照该批次特定的稀释倍数，将一份细胞外基质加入到预冷的杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12/HEPES）中。
  4. 根据所需的新细胞培养处理过的12孔板，每孔加入约600 µL细胞外基质。
  5. 在室温下孵育培养板数小时，此处采用3小时的孵育时间。
    注意：培养板可立即使用，或在4 °C下保存最多两周。

2. 将在iMEF饲养层细胞上培养的hiPSCs转移至细胞外基质进行传代培养

  1. 传代当天，从 4 °C 取出包被基质的培养板，在组织培养超净台中静置 1 小时，使其升至室温。
  2. 吸除生长在 iMEFs 上的 6 孔板中一个孔的 hiPSC 培养基，加入 500 µL 胶原酶消化试剂（1 mg/mL，溶于基础培养基中）。
  3. 在 37 °C 下孵育约 10 - 30 分钟，直至 iPSC 克隆边缘出现轻微翘起。
    注意：孵育时间因细胞系而异，需在显微镜下观察消化情况。
  4. 小心吸除消化试剂，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）轻柔洗涤两次。
  5. 向孔中加入 1 mL 室温的 mTeSR1 完全培养基，其中含 10 ng/mL Rho 相关蛋白激酶抑制剂（Y-27632 ROCK 抑制剂）。
    注意：建议在首次传代时使用 iMEF 条件培养基与 mTeSR1 以 50:50 比例混合的培养基，有助于 hiPSC 在培养基转换过程中的存活。
  6. 将倒置相差显微镜部分置于超净台内，使用注射器和针头（25 G，1½ 英寸）手动划线并挑选 1 - 2 个 hiPSC 克隆（直径约 700 - 1,000 µm），再用 P200 移液器吸头将划线后的克隆碎片推入培养基中。
  7. 小心吸除新培养板中的基质液，注意不要破坏已形成的包被层。
  8. 将含有已划线 iPSC 的旧孔中的 1 mL 细胞悬液转移至新的包被基质的孔中。
  9. 将培养板放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中，快速前后、左右轻摇培养板数次，使细胞均匀分布。此后 24 小时内不要扰动培养板。
  10. 每天更换 mTeSR1 完全培养基（在步骤 2.5 初次接种后，无需再添加 Y-27632 ROCK 抑制剂）。

3. 在基质包被的培养板上进行小规模 hiPSC 传代

注意：通常情况下，在将hiPSCs初次传代至基质包被的培养板后，应以类似方式再传代一次，以确保所有iMEFs均已被清除，且细胞已适应无饲养层条件。

  1. 在iPSC达到汇合前一天，按第1节所述准备新包被的基质板。
  2. 传代当天，将包被基质的培养板从4 °C孵育环境中取出，在组织培养超净台中静置1小时，使其适应室温。
  3. 吸除一个6孔板中hiPSC（最初由饲养层转移至基质）一孔的培养基，加入500 µL细胞解离缓冲液。
    注意：此处使用的商用细胞解离缓冲液（见材料表）相较于胶原酶更适用于mTeSR1培养基。
  4. 室温孵育3–7分钟，直至iPSC集落边缘出现轻微翘起。如前所述，孵育时间因细胞系而异且具有可变性，因此需在显微镜下观察细胞解离情况以确定最佳时间。
  5. 小心吸除解离缓冲液，并用PBS轻柔洗涤两次。
  6. 向孔中加入500 µL室温的含10 ng/mL Y-27632 ROCK抑制剂的mTeSR1完全培养基。
  7. 与步骤2.6中划线处理不同，使用P200枪头将所需数量的集落推入培养基中，并在孔的一角轻轻吹打细胞悬液2次，使hiPSC集落分散为约50–200 µm大小的细胞团块。例如，对于12孔板，每个新孔转移1–2个集落。将细胞悬液从原孔转移至12孔板中的一个新孔。
  8. 快速前后、左右轻摇培养板数次，使细胞均匀分布，随后将培养板置于37 °C、5% CO2孵箱中静置培养24小时。
  9. 每日更换mTeSR1完全培养基。如前所述，初次接种后无需再添加Y-27632 ROCK抑制剂。
    注意：步骤3.7中未使用的hiPSC集落可在此时方便地进行冷冻保存。

4. 用于免疫细胞化学的 hiPSC 细胞接种用培养腔载玻片和盖玻片的制备

注意：以下实验方案使用4孔塑料培养板和12 mm玻璃盖玻片，并在多孔板中加入适量培养基，以支持经济高效的免疫细胞化学实验。然而，如果希望使用更大的孔板和盖玻片尺寸，可相应增加培养基体积。

  1. 在hiPSC达到汇合前一日，按照第1节所述方法，准备新包被了细胞外基质的腔室载玻片。每孔加入足够的基质溶液（约300–500 µL，适用于4孔腔室载玻片的每个孔），充分覆盖各孔，无需担心蒸发。或者，在将1个清洁并灭菌的盖玻片放入24孔板的每个孔后，加入500 µL细胞外基质溶液进行包被，并确保盖玻片未漂浮在溶液表面。
  2. 传代当天，将包被好的腔室载玻片/盖玻片从4 °C取出，在组织培养超净台中静置，使其适应室温约1小时。
  3. 吸除12孔板中1孔hiPSC的培养基，并加入500 µL解离缓冲液。
  4. 室温孵育约3–7分钟，直至iPSC克隆边缘出现轻微翘起。
  5. 小心吸除解离缓冲液，向孔中加入1 mL室温的含10 ng/mL Y-27632 ROCK抑制剂的mTeSR1完全培养基。
  6. 使用放置在组织培养超净台内的小型相差显微镜，用P200移液器吸头轻推培养板表面，将单个克隆推入培养基中，手动挑选1个克隆转移至新的4孔腔室载玻片的1个孔或1个新盖玻片上（直径约1,000–1,500 µm）。
  7. 小心吸除新腔室载玻片/盖玻片中的基质溶液，注意不要破坏包被层。
  8. 将细胞悬液轻轻在孔的一角吹打2次，使hiPSC克隆解离为直径约50–200 µm的细胞团块。将250 µL细胞悬液从原孔转移至4孔腔室载玻片/盖玻片的每个新孔中。
  9. 用含10 ng/mL Y-27632 ROCK抑制剂的mTeSR1培养基补加至每个新孔的终体积为500 µL。
  10. 将腔室载玻片/盖玻片置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  11. 24小时后，每日更换全部培养基，使用mTeSR1完全培养基。如前所述，初次接种后无需再添加Y-27632 ROCK抑制剂。

5. 免疫细胞化学检测用诱导多能干细胞的制备

  1. 待细胞融合后，通过移除孔中培养基并加入预热的CAUTION 4% 多聚甲醛（约 300 µL/孔，适用于 4 孔培养板或盖玻片）固定 hiPSC 克隆。室温孵育 20 分钟。
  2. 根据机构规定的生物危害物和化学品安全指南，妥善处理废弃的多聚甲醛。
  3. 用 PBS 在台式摇床上清洗细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    注意：此步骤后，带有细胞的培养板或盖玻片可置于足量 PBS 中于 4 °C 长期保存，也可直接用于免疫细胞化学染色（ICC）。

6. 使用多能性标志物对人诱导多能干细胞进行免疫染色

注意：使用标准的多能性抗体对人诱导性多能干细胞（hiPSCs）进行免疫染色。例如，此处细胞依次进行双重染色，分别针对一个细胞表面抗原和一个细胞内抗原：抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）与抗八聚体结合蛋白4（OCT-4）联合使用，抗Tra-1-60与抗SRY相关HMG BOX基因2（SOX2）联合使用（抗体详细信息请见材料表）。

  1. 吸去孔中的 PBS，每孔加入 500 µL 不含 Triton-X-100 的封闭液，室温孵育 1 小时。
  2. 使用不含 Triton X-100 的封闭液，将表面抗体（SSEA4 或 Tra-1-60）稀释至预设浓度（此处使用 1:200）。
    1. 对于腔室载玻片，通过混合上述 298.5 µL 封闭液与 1.5 µL 抗 SSEA4 或 Tra-1-60 一抗，配制 300 µL/孔的溶液，加入 4 孔腔室载玻片中。
    2. 对于盖玻片，通过混合199 µL封闭液与1 µL抗SSEA4或Tra-1-60一抗，配制40 µL/盖玻片的溶液。
  3. 吸去免疫组化笔画圈区域内的封闭液，向各孔中加入适量的一抗。对于盖玻片，将一片Parafilm置于培养皿内并压平，滴加40 µL一抗于Parafilm上形成液滴。使用弯头注射器针头和镊子小心将盖玻片从培养孔中取出，细胞面朝下放置于Parafilm上的抗体液滴中。4 °C孵育过夜。
  4. 次日早晨，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5–10 分钟，通过从腔室载玻片中移除抗体并加入 PBS 进行洗涤。对于盖玻片，将每张盖玻片从石蜡膜上取下，翻转后放回 24 孔板的孔中，细胞面朝上，小心加入 PBS。
  5. 在封闭液中按1:500比例配制适当的二抗。
    1. 对于腔室载玻片，通过混合499 µL封闭液与1 µL goat anti-mouse IgG3 Alexa Fluor 488（用于SSEA4）或1 µL goat anti-mouse IgM Alexa Fluor 488（用于Tra-1-60），配制每孔300 µL的4孔腔室载玻片工作液。
    2. 对于盖玻片，通过混合499 µL封闭液与1 µL Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG3（用于SSEA4）或1 µL Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgM（用于Tra-1-60），配制40 µL/盖玻片的溶液。
  6. 从腔室载玻片中吸除 PBS，并将二抗加入相应的孔中。对于盖玻片，在执行步骤 6.2 后，将盖玻片倒置在置于室温下帕拉膜上的抗体溶液中，孵育 2 小时。
    注意：若使用荧光标记的二抗，细胞必须避光处理。在孵育和洗涤过程中，将培养板和盖玻片置于避光环境中。
  7. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5–10 分钟，共洗涤 3 次，洗涤时从腔室载玻片中移除抗体并加入 PBS。对于盖玻片，需小心地从石蜡膜上取下每一片，并将其细胞面朝上放回 24 孔板的孔中。洗涤过程中应轻柔地加入 PBS。
  8. 在检测第二种抗原（本例中为细胞内OCT-4或SOX2）之前，用含破膜试剂（Triton-X-100）的封闭液于室温孵育1小时。
  9. 为了对OCT-4或SOX2进行免疫染色，只需按照第6.1–6.6步所述方法应用一抗和二抗。在本实验方案中，OCT-4和SOX2的一抗稀释比例为1:200，二抗使用山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594，稀释比例为1:500。
  10. 在完成上述一抗和二抗孵育后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5–10 分钟，如需观察细胞核，则按照标准操作流程使用 4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）进行复染。

7. 观察前准备

  1. 对于腔室载玻片，请按照制造商的说明小心地将上层腔室从载玻片上移除。然后用蒸馏水冲洗，并加入封片剂和盖玻片，以便进行显微镜观察。
  2. 对于盖玻片，将盖玻片倒置在置于玻璃载玻片上的封片剂液滴上。
  3. 在标准荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜下进行成像。

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结果

本方案逐步描述了如何将人iPSC从饲养层转移至无饲养层条件，并在有限传代的情况下进行扩增，以低成本地开展免疫细胞化学实验，确认多能性的维持情况。图1展示了本方案的示意图。图2A显示了在6孔板中生长于iMEFs上的hiPSC克隆。这些克隆具有典型形态，边界清晰，中心区域相位明亮且致密。如图2B所示，将iPSC转移至12孔板的无饲养层条件后，克隆形态略显混乱，边缘不够清晰。此外，此阶段培养物中可能仍残留少量iMEFs。图2C显示，在无饲养层体系中再经历一次传代后，iPSC克隆呈现出典型的单层形态，核质比高。在此阶段，培养物中的iMEFs已基本被清除。

在无饲养层条件下生长的克隆通过机械法挑选后，接种于小型多孔板或玻璃盖玻片上，并通过免疫细胞化学方法检测特定的多能性抗原。图3展示了代表性克隆...

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讨论

本文介绍的系统性实验方案提供了一种省时且经济高效的方法，即通过缩小规模的培养技术，专门用于支持通过免疫细胞化学进行有效的多能性分析。

所述方法的主要优势如下。传统上，需要经过3至4代以上的传代，才能将iPSC从饲养层转移至无饲养层的培养条件，以消除使用大量解离技术后残留的iMEF，并使典型的单层形态显现12,13。相比之下，本文所介绍的方法缩短了时间周期，通过手动挑选iPSC克隆，可相对快速地将iPSC转移至无血清培养条件。via 该方法培养的iPSC可在有利于免疫细胞化学染色的小型腔室载玻片或盖玻片上有限量生长。实际上，每孔所需的培养基体积仅为0.5 mL，而单个盖玻片所需的稀释抗体溶液体积仅需40 µL，或每腔室孔300 µL即可。

我们发现，在初次传代期间（步骤 2.5），向 mTeSR1 培养基中加入等体积的 iMEF 条件培养基，是有助于提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率并维持其多...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

资金来源：亚利桑那大学、吉姆·希梅利克基金会以及亚利桑那复杂疾病生物学中心。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM-F12/HEPESLife Technologies11330032
无血清替代物Life Technologies10828028
L-谷氨酰胺Life Technologies25030081
MEM必需氨基酸溶液（MEM-NEAA）Life Technologies11140050
2-巯基乙醇Life Technologies21985023
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic）Cell SciencesCRF001B
Y-27632 ROCK抑制剂R&D1254
IV型胶原酶Life Technologies17104019
Matrigel hESC认证基质Corning354277
mTeSR1基础培养基StemCell Technologies05850
mTeSR1 5倍补充液StemCell Technologies05850
温和细胞解离缓冲液StemCell Technologies07174
0.1 M PO4 缓冲液实验室自备n/a
多聚甲醛颗粒Electron Microscopy Sciences19202
1×磷酸盐缓冲液（PBS）n/an/a
正常山羊血清Life Technologies16210072
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
曲拉通 X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) 兔单克隆抗体，
Sox2 (D6D9) 兔单克隆抗体，
SSEA4 (MC813) 小鼠单克隆抗体，
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) 小鼠单克隆抗体		Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling		2840
3579
4755
4746		也可选择购买包含6种多能性一抗的组合试剂盒，货号 #9656
山羊抗小鼠IgM Alexa Fluor 488标记二抗Life TechnologiesA21042
山羊抗小鼠IgG3 Alexa Fluor 488标记二抗Life TechnologiesA21151
山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594标记二抗Life TechnologiesA11037
多孔细胞培养板Fisher Scientific 0720080/0720081提供6、12、24、48、96孔规格
细胞培养腔室载玻片Fisher Scientific 12 565 21提供玻璃或Permanox塑料材质，1、2、4、8、16孔规格
用于细胞生长的盖玻片Fisher Scientific 12 545 82提供12、15、18、22和25 mm规格

参考文献

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