在将诱导性多能干细胞（iPSCs）用于其他应用之前，常规鉴定这些细胞以确认其多能状态的维持情况，是一项重要的步骤。本文介绍一种专为通过免疫细胞化学方法对人iPSCs进行简便且常规鉴定而设计的小规模传代培养方法。
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本文内容
摘要
摘要
由于人诱导性多能干细胞（hiPSCs）具有患者特异性和典型的干性特征，其在疾病建模和细胞治疗领域受到广泛关注。然而，在将这些细胞用于上述应用之前，必须确认iPSCs的多能性，因为多能性是其功能发挥的关键。尽管需要通过多种细胞和功能检测对iPSCs进行严格的表征以确立其多能性，但通过免疫细胞化学技术可更简便、有效地实现对多能性维持情况的常规评估。本文介绍了一种系统性的hiPSCs培养方案，采用缩小规模的培养方式，特别有助于利用免疫细胞化学方法验证其多能状态。更具体而言，该方法包含在无血清条件下高效且经济地培养iPSCs，并将其接种于适合免疫细胞化学分析的小型腔室载玻片或玻璃盖玻片上的完整流程。
引言
将人类成体体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），为获取可用于疾病研究的患者特异性细胞提供了潜在的无限来源1,2重现疾病表型 体外 将有助于研究与疾病相关的细胞和分子机制，并推动药物发现和个性化医疗的发展3此外，人诱导多能干细胞（hiPSCs）具有分化为特定细胞类型的潜力，可作为独特资源用于替代多种疾病状态下死亡或功能异常的细胞，从而恢复其功能4,5.
在上述应用中使用iPSCs的一个重要前提是确保其多能性和未分化状态在体外扩增过程中得以维持。通常，人们采用流式细胞术、蛋白质印迹、聚合酶链式反应以及功能检测等技术对iPSCs的多能性进行详细分析，但这些方法需要大量细胞和专用设备6,7,8,9,10。然而，通过有限地扩增这些细胞并专门用于免疫细胞化学（I....
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方案
人源性皮肤成纤维细胞取自4 mm皮肤钻孔活检组织，经实验室内部重编程获得人诱导多能干细胞（hiPSCs） 通过 仙台病毒介导的重编程11亚利桑那大学机构审查委员会批准了所有受试者招募和活检样本采集的程序。
1. 用于iPSC培养的细胞外基质包被表面的制备
- 在生长于iMEFs上的hiPSC培养物达到汇合前一天，准备包被细胞外基质（Matrigel）的培养板。
- 将一份细胞外基质（根据批号不同，遵循说明书上的指示）置于冰上并在4 °C下缓慢解冻2小时。
- 在生物安全柜中，使用预冷的移液器吸头（储存于-20 °C），按照该批次特定的稀释倍数，将一份细胞外基质加入到预冷的杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12/HEPES）中。
- 根据所需的新细胞培养处理过的12孔板，每孔加入约600 µL细胞外基质。
- 在室温下孵育培养板数小时，此处采用3小时的孵育时间。
注意：培养板可立即使用，或在4 °C下保存最多两周。
2. 将在iMEF饲养层细胞上培养的hiPSCs转移至细胞外基质进行传代培养
- 传代当天，从 4 °C 取出包被基质的培养板，在组织培养超净台中静置 1 小时，使其升至室温。
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结果
本方案逐步描述了如何将人iPSC从饲养层转移至无饲养层条件，并在有限传代的情况下进行扩增，以低成本地开展免疫细胞化学实验，确认多能性的维持情况。图1展示了本方案的示意图。图2A显示了在6孔板中生长于iMEFs上的hiPSC克隆。这些克隆具有典型形态，边界清晰，中心区域相位明亮且致密。如图2B所示，将iPSC转移至12孔板的无饲养层条件后，克隆形态略显混乱，边缘不够清晰。此外，此阶段培养物中可能仍残留少量iMEFs。图2C显示，在无饲养层体系中再经过一次传代后，iPSC克隆呈现出典型的单层形态，核质比高。在此阶段，培养物中的iMEFs已基本被清除。
在无饲养层条件下生长的克隆通过机械法挑选后，接种于小型多孔板或玻璃盖玻片上，并通过免疫细胞化学方法检测特定的多能性抗原。图3展示了代表性克隆.......
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讨论
本文介绍的系统性实验方案提供了一种省时且经济高效的方法，即通过缩小规模的培养技术，专门用于支持通过免疫细胞化学进行有效的多能性分析。
所述方法的主要优势如下。传统上，需要经过3至4代以上的传代，才能将iPSC从饲养层转移至无饲养层的培养条件，以消除使用大量解离技术后残留的iMEF，并使典型的单层形态显现12,13。相比之下，本文所介绍的方法缩短了时间周期，通过手动挑选iPSC克隆，可相对快速地将iPSC转移至无血清培养条件。via 该方法培养的iPSC可在有利于免疫细胞化学染色的小型腔室载玻片或盖玻片上有限量生长。实际上，每孔所需的培养基体积仅为0.5 mL，而单个盖玻片所需的稀释抗体溶液体积仅需40 µL，或每腔室孔300 µL即可。
我们发现，在初次传代期间（步骤 2.5），向 mTeSR1 培养基中加入等体积的 iMEF 条件培养基，是有助于提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率并维持其多.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
资金来源：亚利桑那大学、吉姆·希梅利克基金会以及亚利桑那复杂疾病生物学中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| 无血清替代物 | Life Technologies | 10828028 | |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM必需氨基酸溶液（MEM-NEAA） | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-巯基乙醇 | Life Technologies | 21985023 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic） | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK抑制剂 | R&D | 1254 | |
| IV型胶原酶 | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC认证基质 | Corning | 354277 | |
| mTeSR1基础培养基 | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5倍补充液 | StemCell Technologies | 05850 | |
| 温和细胞解离缓冲液 | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 缓冲液 | 实验室自备 | n/a | |
| 多聚甲醛颗粒 | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS） | n/a | n/a | |
| 正常山羊血清 | Life Technologies | 16210072 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) 兔单克隆抗体， Sox2 (D6D9) 兔单克隆抗体， SSEA4 (MC813) 小鼠单克隆抗体， TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling | 2840 3579 4755 4746 | 也可选择购买包含6种多能性一抗的组合试剂盒，货号 #9656 |
| 山羊抗小鼠IgM Alexa Fluor 488标记二抗 | Life Technologies | A21042 | |
| 山羊抗小鼠IgG3 Alexa Fluor 488标记二抗 | Life Technologies | A21151 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594标记二抗 | Life Technologies | A11037 | |
| 多孔细胞培养板 | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | 提供6、12、24、48、96孔规格 |
| 细胞培养腔室载玻片 | Fisher Scientific | 12 565 21 | 提供玻璃或Permanox塑料材质，1、2、4、8、16孔规格 |
| 用于细胞生长的盖玻片 | Fisher Scientific | 12 545 82 | 提供12、15、18、22和25 mm规格 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
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重印与许可
