一种可定制的细胞迁移测量装置

摘要

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。

摘要

细胞迁移是免疫反应、生长和伤口愈合过程中的关键环节。细胞迁移是一个复杂的过程，涉及细胞、细胞外基质以及可溶性和非可溶性化学因子（例如，趋化因子）之间的相互作用。测量细胞迁移的标准方法（如Boyden小室实验）通过计数分隔膜两侧的细胞数量来实现。这些技术易于使用，但在不同应用中几何结构的可调节性有限。相比之下，微流控装置可用于观察可溶性因子浓度梯度可定制的细胞迁移过程^1,2。然而，基于微流控的检测方法的制备技术可能较难掌握。

本文介绍了一种简便的方法，用于构建细胞培养腔室，以检测细胞在化学浓度梯度作用下的迁移行为。我们的细胞迁移腔室方法能够形成不同的线性浓度梯度，适用于多种研究场景下的细胞迁移分析。该方法操作相对简单，通常由本科生即可完成。

通过将丙烯酸材质的插入物（其形状与最终的微通道腔室孔相同）放入培养皿中，制备出微通道腔室。随后，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇注在该插入物表面。待PDMS固化后，移除插入物，从而形成任意所需形状或尺寸的孔。之后可将细胞加入微通道腔室中，并通过将琼脂糖块浸泡于目标试剂中，再将其置入其中一个孔内，以引入可溶性试剂。将琼脂糖块放入其中一个孔后，可对微通道腔室进行延时成像，以定量分析细胞迁移情况。该方法可根据具体应用进行多种调整，具有高度可定制性。

引言

为了实现伤口愈合、免疫反应和胚胎发育等重要生理过程，细胞迁移必须发生。细胞迁移涉及细胞与邻近细胞、细胞外基质以及可溶性化学信号（趋化吸引物或排斥物）之间的相互作用。例如，在伤口愈合过程中，成纤维细胞在纤维形成和伤口收缩中起着关键作用，这些细胞被募集到损伤部位，合成胶原蛋白以形成细胞外基质³。目前已有大量研究探讨成纤维细胞向伤口部位迁移的机制，包括不同的力学、物理、电学和趋化性因素⁴。成纤维细胞对不同浓度梯度的生长因子尤其敏感。这些不同的生长因子协同作用，以优化组织再生⁵。在观察成纤维细胞对生长因子浓度的趋化反应时，可以研究其定向迁移的模式，以及它们如何在物理障碍周围调整自身方向以到达目标位置。因此，本研究的目标首先是建立一个系统，用于在物理屏障引导下追踪成纤维细胞的生长；其次是对成纤维细胞在该系统中迁移过程中的生长行为进行建模。

目前，Transwell小室法是最广泛用于检测细胞迁移的实验体系⁶。Transwell小室由一种双室多孔板构成，每个孔的下室可含有或不含趋化因子的培养基⁷。滤膜在每个孔的上下两室之间形成多孔界面，构成物理屏障，使细胞只能通过主动迁移穿过膜。通常，在Transwell实验中，将趋化因子加入下室，使系统达到平衡，从而在....

方案

1. 制备微通道室以产生浓度梯度

1. 切割亚克力模具片
   1. 获取所需宽度的亚克力片。通常使用厚度为1/16英寸的亚克力板。较厚的板材难以精确切割，而过薄的板材则缺乏必要的机械强度，容易在过程中断裂或变形。
   2. 创建一个CAD文件，设计所需形状的亚克力片，以在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中形成空腔。根据具体的实验方案调整通道的宽度和长度，以获得所需的梯度。
      1. 此处使用的亚克力片尺寸如下：两个正方形（0.254 cm × 0.254 cm）通过一条宽0.127 cm、长0.254 cm的通道连接（图1）。
   3. 将CAD文件导入激光切割设备，并按照制造商的操作说明将亚克力片放入激光切割机中。
      注意：也可根据CAD设计使用3D打印制作该部件。此方法的优势在于可选用其他材料作为模具；但与激光切割相比，3D打印的分辨率和可重复性可能降低。

结果

图2显示了细胞前沿在通道中朝向牛胎血清梯度方向的移动，该血清梯度位于细胞接种位置相对的通道另一端。细胞前沿在接种后48小时（图2A）、72小时（图2B）、96小时（图2C）和120小时（图2D）的情况如图所示。通过这些延时成像追踪细胞前沿的移动，并利用MATLAB的polyfit函数计算细胞迁移距离和生长速率。据此得出细胞前沿的平均速度为13.4 µm/h（图3）。图4显示了在通道一端放置经葡聚糖浸泡的琼脂糖块，使葡聚糖在12小时内扩散通过通道所建立的荧光梯度。每小时采集一次延时图像，测量并绘制通道距离上的荧光强度分布，如图4所示，并与一维扩散模型进行比较。

讨论

我们的微通道室可用于多种用途，包括测定细胞在生长因子和趋化因子作用下的迁移速率，以及测量药物从聚合物基质中的扩散速率。可以利用我们的微通道室培养细胞，并在腔室的一端放置趋化因子。细胞会朝向趋化因子方向生长，通过采集延时图像并进行分析，可对细胞迁移进行定量，从而确定细胞迁移速率。该方法的代表性结果如图3所示，使用MATLAB的polyfit函数测得生长速率为13.4 µm/h。

我们微通道室的另一个用途是测量药物从聚合物基质中的扩散速率。可使用与目标药物分子量相似的荧光标记葡聚糖来模拟目标药物的扩散过程。需要注意的是，必须小心处理样品，因为强烈的对流会破坏浓度梯度。该方法的代表性结果如图4所示。与Boyden小室法相比，该模型的一个优势在于其表面为平面，更适用于贴壁细胞类型；而在Boyden小室中，细胞必须先穿过一个小管才能贴附。Boyden小室法的另一个局限性在于它是一种终点检测法，因此无法直接观察趋化运动过程。相比之下，使用我们的方法可以通过延时成像实时观察趋化现象⁹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Sigma-Aldrich	761036	双组分聚（二甲基硅氧烷）试剂盒，包含硅酮弹性体基础液和硅酮弹性体固化剂
丙烯酸板	US Plastic	44200
一次性培养皿	Falcon	25373-041
异硫氰酸荧光素–葡聚糖	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
琼脂糖，I型，低电渗扩散（EEO）	Sigma-Aldrich	A6013-100G
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）	Fisher Scientific	11965092	细胞培养基成分
胎牛血清	Fisher Scientific	16000036	细胞培养基成分
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140148	细胞培养基成分
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL 细胞成像系统	Thermo Fisher Scientific	AME3300	用于拍摄延时图像的仪器
Versa 激光切割机	Universal Laser Systems, Inc.	型号 VLS2.30	用于切割塑料的激光切割仪