定制室测定细胞迁移

Summary

该协议细节来测量响应于也可用于确定药物的扩散速度出聚合物基质的化学引诱物细胞迁移可定制方法。

Abstract

细胞迁移是免疫反应，生长和伤口愈合的重要组成部分。细胞迁移是一个复杂的过程，涉及到细胞，细胞外基质，和可溶的和不可溶的化学因素（ 例如 ，化学引诱物）之间的相互作用。标准方法测量细胞，如Boyden小室测定法中，通过在除法器的任一侧细胞计数工作的迁移。这些技术很容易使用;然而，他们提供针对不同应用的小几何修改。与此相反，微流体装置可用于观察与可溶性因子^1,2定制浓度梯度细胞迁移。然而，用于制造基于微流体分析的方法是很困难的学习。

这里，我们描述用于创建细胞培养室，测量响应于化学浓度梯度细胞迁移的简单方法。我们的细胞英里格雷申室方法可以为了研究细胞迁移对于各种应用创建不同的线性浓度梯度。该方法是相对容易使用，并且通常由大学生进行。

所述微通道室通过将在最后的微腔的形状的丙烯酸插入井到培养皿创建。在此之后，聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）倒在刀片的顶部。将PDMS被允许硬化，然后除去插入件。这允许以任何所需的形状或尺寸的创作孔中。细胞可以随后添加到微室中，和可溶性剂可以通过在所需的剂浸泡琼脂糖块被加入到孔中的一个。琼脂糖块加入到孔中的一个，和时间推移的图片可以量化细胞迁移可采取微通道室。变化，以这种方法可以用于给定的应用进行，使得这种方法HIG溶血素可定制的。

Introduction

为了使伤口愈合、免疫反应和胚胎发育等重要过程发生，必须进行细胞迁移。细胞迁移涉及细胞与相邻细胞之间的相互作用、细胞外基质和可溶性化学线索（引诱剂或驱虫剂）。例如，在伤口愈合过程中，成纤维细胞在纤维化生成和伤口收缩中起着不可或缺的作用，其中细胞被募集到损伤部位合成胶原蛋白，以形成细胞外基质³。已经研究了成纤维细胞迁移到伤口部位的许多机制，它们包括不同的机械、物理、电气和趋化因子⁴。成纤维细胞对生长因子的不同浓度梯度反应特别好。这些不同的生长因子共同作用以优化组织再生⁵。在观察成纤维细胞对生长因子浓度的趋化反应的同时，可以研究成纤维细胞定向迁移的模式以及它们如何绕过物理障碍以到达目的地。因此，本研究的目标是首先开发一个系统，在该系统中，可以在物理屏障的指导下跟踪成纤维细胞的生长，其次对成纤维细胞在系统中导航时的生长进行建模。

目前，Boyden 室测定法是测量细胞迁移最广泛⁶ 的系统。Boyden 腔室由一个双腔多孔板组成，其中每个孔可能包含含或不含化学引诱剂的培养基⁷。滤膜在每个孔的两个腔室之间提供多孔界面;这会形成一个屏障，使细胞无法通过，除非通过主动迁移。通常，对于 Boyden 室，在下室中添加化学引诱剂，并允许系统平衡以在上下井之间形成梯度⁴。Boyden 室测定的一个问题是陡峭的梯度最终会沿着垂直于膜表面的单轴形成。这导致上下井之间的趋化剂浓度差异低于最初的预期。由于这种限制，Boyden 室测定法很难将特定细胞反应与特定梯度特征（例如斜率和浓度差异）相关联。如果没有这些测量，就很难研究多梯度信号积分。

为了解决传统博伊登室分析的一些限制，已经开发了微流体分析以形成可定制的浓度梯度¹。创建微流体系统的标准方法需要用于光刻技术的洁净室。这些技术可能很难学习，尤其是在标准的课堂环境中。因此，我们设计了一种用于测量细胞迁移的腔室系统，该系统可以在不使用洁净室的情况下进行。使用我们的系统，可以将分析孔调整为首选大小，并且可以产生自定义斜率的线性浓度梯度。这允许准确测量随机运动的趋化性。该设计是一种廉价且易于使用的系统，用于模拟响应不同化学刺激的细胞生长。

Protocol

1，一种生产微通道室以产生浓度梯度

1. 切割丙烯酸防霉片
   1. 获得一块所需宽度的丙烯酸。通常选用1/16英寸厚的压克力板材。较厚的片是难以切割好，非常薄的片材不具有必要的机械强度，使它们的过程中断裂或变形。
   2. 创建与丙烯酸片的所需形状的CAD文件到聚二甲基硅氧烷（PDMS）内产生的空腔。调节通道的宽度和长度，以实现相关的个别实验方案所需的梯度。
      1. 在这里，用丙烯酸片尺寸如下:由0.127厘米宽的通道连接（0.254厘米长）两个正方形（0.254厘米点¯x0.254厘米）（ 图1）。
   3. 根据马努在激光切割机导入CAD文件到激光切割设备，然后将一块亚克力厂家的协议。
      注:另外，3D打印从CAD设计作品。这种方法的优点是，替代材料，可用于在模具中;但是，分辨率和重复性，可以用3D打印相比，激光切割下降。

图1:微通道商会计算机辅助设计（CAD）表示。该图像描述了创建微室所需的亚克力插入的CAD图纸。 1 A）CAD出图，1B）CAD的侧视图英寸的尺寸图，1C）CAD的顶视图英寸的尺寸图的顶视图，请点击此处查看该图的放大版本。

浇注聚二甲基硅氧烷（PDMS）
1. 在一个称量船（重量）商业弹性体基的（ 如的Sylgard 184）与1重量份的商业橡胶固化剂（ 如的Sylgard 194）的混合10份。通常情况下，混合10克橡胶基地到1g弹性体固化剂。
2. 搅用微量5分钟的基料和固化剂相结合。
3. 设立一个真空钟，并将与PDMS中称量船在真空30分钟以除去截留的空气气泡。
4. 关闭真空并取出称重舟。倒入一个小培养皿丙烯酸切出顶部的PDMS。确保PDMS完全覆盖刀片。
5. 允许PDMS固化过夜（至少18小时）在室温下。
2. 去除PDMS插入
   1. 固化的PDMS后，通过小心地切割PDMS周围的丙烯酸系片用手术刀取下刀片。

2.电镀细胞在微通道商会

1. 灭菌电镀细胞室中。
   注意:虽然PDMS可使用环氧乙烷或其他技术进行灭菌，快速UV处理是快速，廉价，并且足以用于细胞培养研究。短UV处理时间也没有损害的PDMS片的结构或机械完整性。
   1. 在标准细胞培养柜，完全覆盖，用70％的乙醇的腔室。
   2. 把与所述盖子关闭层流罩的培养皿。
   3. 关闭引擎盖打开紫外线灯。暴露于UV光1-2小时。
   4. 打开层流罩，并等待15分钟重新建立流动。
   5. 除去70％的乙醇。
   6. 用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤腔室的两倍。使用1毫升的PBS每次洗涤。除去PBS并允许室与盖子关干通宵。
      注:此外，相反使用层流罩中，使用的UV腔室箱灭菌如果有一个可用。通过将UV光源在一个纸箱用铝箔衬里的背面使紫外线框。铝箔反射光，以允许甚至照明样品。
2. 在室内电镀细胞
   1. 使用计数台盼蓝和血球细胞。
      1. 加入100μL细胞悬液400微升0.4％台盼蓝，轻轻混匀。由玻璃盖玻片下轻轻填充两院应用100微升此解决方案血细胞计数仪。
      2. 使用显微镜用10倍的目标集中在血球电网。用一只手式计数器，以一组的血球16平方内计数活的未染色细胞。
      3. 在全体4套16平方的细胞。从4台16平方取平均细胞计数和由5×10 ⁴繁殖。这个最后的数字是numbe在细胞悬浮液中细胞/ mL的河
   2. 添加2500细胞一个孔在每个室中。这转化为的〜30,000 / cm ²的近汇合的细胞密度。
   3. 允许细胞在腔室坐60分钟添加介质之前（Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素）。

3.浸泡葡聚糖琼脂糖块

1. 创建琼脂糖块
   1. 琼脂糖倒3％到3D印刷模具（2毫米×2毫米×2mm）的。
   2. 允许琼脂糖在真空室内固化30分钟，以除去任何气泡。
   3. 除去从模具琼脂糖块。
      注意:可替换地，琼脂糖倒3％成小培养皿在厚度为2毫米。切使用手术刀或者其它切割工具2毫米×2mm的×2mm的块。这不是作为模具系统那样精确，但是它可以更容易一点做。
2. 完全submergE在趋化因子的所需浓度的溶液琼脂糖块。为了评估浓度梯度的形成，荧光右旋糖酐第一冲洗室。葡聚糖的浓度和分子量应匹配的可溶性因子或感兴趣的药物。
3. 浸泡琼脂糖块过夜。

葡聚糖扩散4.时间推移，评估可溶性因子浓度梯度

1. 将葡聚糖浸泡琼脂糖块在微室的小方井。
2. 放置所述微通道室中的细胞成像系统，或使用其他荧光显微镜与时间推移的能力。根据制造商的说明开始的时间推移。
   注:显示的结果采取GFP过滤器，50％的光，pH值4/10和放大4倍。

细胞生长5.定时

1. 板中的细胞微通道室中的一端室。在这里，使用3T3成纤维细胞。添加2500细胞一个孔在所述微通道室中。在2.2.1中描述计数细胞。
   1. 允许细胞在腔室坐60分钟添加介质之前（Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素）。保持与铺板的细胞在微室中于37℃在5％CO _2。通过信道细胞迁移可以用显微镜观察。
   2. 添加标记或使用在腔室作为标记的显微缺陷，以作为一个起点，以量化的距离的小区前移动。
2. 通过将琼脂糖凝胶（8 mm ³的块）包含建立梯度浓缩生长因子，趋化引诱剂，药物，或者被测试其他因子（这里，40％的FBS被用作一个例子）在所述微通道的一端室。
3. 就拿移动单元前的时间推移图像。在此，结果表明，该细胞的图像来回核苷酸已采取使用成像系统每12小时。
4. 使用电池前的照片来量化细胞的生长速度。计算由第一利用MATLAB polyfit功能（roipoly）来创建由细胞前，通道壁，和参考标记限定的多边形掩模的增长率。该掩模的尺寸，得到由此计算平均电池锋速度前的迁移距离。其他研究已经利用类似的方法^8。
   注:在该相同的距离进行比较的细胞生长前面各帧的可溶因子的浓度上的边缘。可溶性因子的浓度梯度是使用一维扩散模型近似计算。
5. 采取用鬼笔环肽和DAPI染色的细胞的荧光图像。
   1. 与鬼笔环肽染色之前修复细胞。
      1. 在37℃的温水4％多聚甲醛。
      2. 补充足够的4％多聚甲醛覆盖细胞。保持在细胞中多聚甲醛10分钟。
      3. 用PBS冲洗两次，每次15分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
   2. 从细胞中除去PBS中并添加足够的透化溶液（0.1％的Triton X-100的PBS），以覆盖细胞。离开溶液10分钟。
   3. 用PBS洗两次，每次5分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
   4. 从细胞中除去PBS中并添加20分钟阻断溶液（在PBS中1％牛血清白蛋白）。
   5. 除去阻断溶液并用PBS洗涤2次，每次5分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
   6. 从这点来说，在不使用时保护细胞免受光用铝箔。从细胞中除去PBS中并在PBS中添加鬼笔环肽488 1:50稀释1小时。
   7. 洗2次在PBS中5分钟，每次洗涤。使用足够的PBS覆盖细胞。然后从细胞中移除PBS。
   8. 在PBS 1000细胞15分钟:加入DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基）稀释1。
   9. 删除和DAPI洗涤细胞两次，用PBS进行5分钟，每次洗涤。
   10. 删除最后一次洗涤和补充足够的PBS覆盖细胞。细胞现在可以用荧光显微镜成像。

Results

图2示出横跨通道的细胞前的响应于放置在信道的从细胞接种，其中相对端胎牛血清的梯度的运动。小区前示出在48小时（ 图2A），72小时（ 图2B），96小时（ 图2C），和120小时（ 图2D）交电镀。小区前的运动用这些时间推移图象跟踪，和迁移距离和生长率分别由MATLAB polyfit函数计算。由此看来，平均气泡锋速度被发现是13.4微米/小时（ 图3）。 图4示出通过在通道的一端放置葡聚糖浸泡琼脂糖块并允许葡聚糖通过信道扩散12小时建立的荧光梯度。一时间推移图像摄于每一小时，横跨的距离的荧光信道测量并绘制成图4所示相比，一维扩散模型。

Discussion

我们的微腔可用于目的，包括确定细胞迁移速率响应于生长因子和趋化因子以及从聚合物基质测定药物的扩散速率的多种。它可以利用我们的微腔室生长细胞并放置一个趋化在腔室的一端。细胞生长响应于趋化和细胞迁移可以通过取可在为了确定细胞迁移率分析的时间推移的图像进行量化。这种方法的代表性结果示于图3，其中被确定的增长率是使用MATLAB polyfit函数13.4微米/小时。

我们的微腔室的另一用途是用于测量药物的扩散速度出聚合物基质。类似的分子量与感兴趣的药物的荧光标记的葡聚糖可用于DRU的扩散模型克的兴趣。要注意的是，样品必须精心为大量的对流会扰乱梯度进行处理是重要的。该方法的代表性结果示于图4。这种模式相比于Boyden小室测定法的一个优点是，它更适用于因为平坦表面的贴壁细胞类型;然而，细胞必须坚持之前穿过Boyden小室的小管下降。的Boyden小室测定法的另一个限制是，它是一个端点化验;因此，趋化不能被肉眼观察到。相反，我们的方法中，趋化是通过时间推移图像⁹观察。使用含有化...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	Sigma-Aldrich	761036	聚（二甲基硅氧烷） 2 部分套件，包括硅胶弹性体基材和硅胶弹性体固化剂
丙烯酸板	塑料	44200
一次性培养皿	猎鹰	25373-041
异硫氰酸荧光素右旋糖酐	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
琼脂糖，I 型，低 EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Fisher Scientific	11965092	细胞培养基组分
胎牛血清	Fisher Scientific	16000036	细胞培养基组分
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140148	细胞培养基组件
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL 细胞成像系统	Thermo Fisher Scientific	AME3300	用于拍摄延时图像的仪器
Versa Laser	Universal Laser Systems， Inc.	型号 VLS2.30	用于切割塑料的激光切割机