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方法文章

一种可定制的细胞迁移测量装置

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DOI：

10.3791/55264

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2017年3月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Clemson University

本文内容

摘要

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。

摘要

细胞迁移是免疫反应、生长和伤口愈合过程中的关键环节。细胞迁移是一个复杂的过程，涉及细胞、细胞外基质以及可溶性和非可溶性化学因子（例如，趋化因子）之间的相互作用。测量细胞迁移的标准方法（如Boyden小室实验）通过计数分隔膜两侧的细胞数量来实现。这些技术易于使用，但在不同应用中几何结构的可调节性有限。相比之下，微流控装置可用于观察可溶性因子浓度梯度可定制的细胞迁移过程1,2。然而，基于微流控的检测方法的制备技术可能较难掌握。

本文介绍了一种简便的方法，用于构建细胞培养腔室，以检测细胞在化学浓度梯度作用下的迁移行为。我们的细胞迁移腔室方法能够形成不同的线性浓度梯度，适用于多种研究场景下的细胞迁移分析。该方法操作相对简单，通常由本科生即可完成。

通过将丙烯酸材质的插入物（其形状与最终的微通道腔室孔相同）放入培养皿中，制备出微通道腔室。随后，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇注在该插入物表面。待PDMS固化后，移除插入物，从而形成任意所需形状或尺寸的孔。之后可将细胞加入微通道腔室中，并通过将琼脂糖块浸泡于目标试剂中，再将其置入其中一个孔内，以引入可溶性试剂。将琼脂糖块放入其中一个孔后，可对微通道腔室进行延时成像，以定量分析细胞迁移情况。该方法可根据具体应用进行多种调整，具有高度可定制性。

引言

为了实现伤口愈合、免疫反应和胚胎发育等重要生理过程，细胞迁移必须发生。细胞迁移涉及细胞与邻近细胞、细胞外基质以及可溶性化学信号（趋化吸引物或排斥物）之间的相互作用。例如，在伤口愈合过程中，成纤维细胞在纤维形成和伤口收缩中起着关键作用，这些细胞被募集到损伤部位，合成胶原蛋白以形成细胞外基质3。目前已有大量研究探讨成纤维细胞向伤口部位迁移的机制，包括不同的力学、物理、电学和趋化性因素4。成纤维细胞对不同浓度梯度的生长因子尤其敏感。这些不同的生长因子协同作用，以优化组织再生5。在观察成纤维细胞对生长因子浓度的趋化反应时，可以研究其定向迁移的模式，以及它们如何在物理障碍周围调整自身方向以到达目标位置。因此，本研究的目标首先是建立一个系统，用于在物理屏障引导下追踪成纤维细胞的生长；其次是对成纤维细胞在该系统中迁移过程中的生长行为进行建模。

目前，Transwell小室法是最广泛用于检测细胞迁移的实验体系6。Transwell小室由一种双室多孔板构成，每个孔的下室可含有或不含趋化因子的培养基7。滤膜在每个孔的上下两室之间形成多孔界面，构成物理屏障，使细胞只能通过主动迁移穿过膜。通常，在Transwell实验中，将趋化因子加入下室，使系统达到平衡，从而在上下室之间形成浓度梯度4。Transwell小室法的一个问题是，趋化因子梯度往往沿垂直于膜表面的单一轴向形成陡峭的梯度分布，导致上下室之间的趋化因子浓度差低于预期值。由于这一限制，难以将特定的细胞反应与梯度的特定特征（如斜率和浓度差）相关联。缺乏这些测量参数，研究多梯度信号整合将变得困难。

为解决传统Boyden小室实验的一些局限性，已开发出微流控实验技术，用于形成可定制的浓度梯度1。构建微流控系统的标准方法通常需要在洁净室中进行光刻加工，而这类技术尤其在常规课堂教学环境中较难掌握。因此，我们设计了一种无需洁净室即可制备的细胞迁移检测小室系统。利用该系统，实验中的加样孔可调节至所需尺寸，并可产生具有自定义斜率的线性浓度梯度，从而能够准确区分趋化性迁移与随机运动。该设计是一种低成本、易操作的系统，可用于模拟细胞在不同化学刺激下的生长行为。

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方案

1. 制备微通道室以产生浓度梯度

  1. 切割亚克力模具片
    1. 获取所需宽度的亚克力片。通常使用厚度为1/16英寸的亚克力板。较厚的板材难以精确切割，而过薄的板材则缺乏必要的机械强度，容易在过程中断裂或变形。
    2. 创建一个CAD文件，设计所需形状的亚克力片，以在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中形成空腔。根据具体的实验方案调整通道的宽度和长度，以获得所需的梯度。
      1. 此处使用的亚克力片尺寸如下：两个正方形（0.254 cm × 0.254 cm）通过一条宽0.127 cm、长0.254 cm的通道连接（图1）。
    3. 将CAD文件导入激光切割设备，并按照制造商的操作说明将亚克力片放入激光切割机中。
      注意：也可根据CAD设计使用3D打印制作该部件。此方法的优势在于可选用其他材料作为模具；但与激光切割相比，3D打印的分辨率和可重复性可能降低。

显示结构组件几何尺寸的三维建模示意图。
图1：微通道室的计算机辅助设计（CAD）示意图。 该图像展示了用于制作微通道室的亚克力插入件的CAD图纸。1A) CAD图纸的俯视图，1B) 带有英寸尺寸标注的CAD图纸侧视图，1C) 带有英寸尺寸标注的CAD图纸俯视图 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 浇注聚二甲基硅氧烷（PDMS）
    1. 在称量舟中，按重量比混合10份商用弹性体基础剂（Elastomer Base）例如 Sylgard 184）与1份重量的商用弹性体固化剂（例如 Sylgard 194）。通常将10 g弹性体基础剂与1 g弹性体固化剂混合。
    2. 用移液器搅拌5分钟，使基础剂与固化剂充分混合。
    3. 设置真空钟罩，将装有PDMS的称量皿放入真空环境中脱气30分钟，以去除其中截留的气泡。
    4. 关闭真空泵，取下称量舟。将PDMS倒入小培养皿中的亚克力裁切片上，确保PDMS完全覆盖插入物。
    5. 让PDMS在室温下固化过夜（至少18 h）。
  2. 从PDMS中移除插入物
    1. PDMS 固化后，用手术刀小心地沿丙烯酸部件周围切割 PDMS，以移除插入物。

2. 在微通道腔室中接种细胞

  1. 细胞接种前对培养腔室进行灭菌。
    注意：虽然聚二甲基硅氧烷（PDMS）可通过环氧乙烷或其他方法灭菌，但快速紫外线（UV）处理具有快速、经济且足以满足细胞培养研究的优点。短暂的UV处理不会影响PDMS材料的结构或机械完整性。
    1. 在标准细胞培养操作台中，用70%乙醇完全覆盖腔室。
    2. 将培养皿放入超净工作台中，并打开皿盖。
    3. 关闭工作台，打开紫外灯，照射1–2小时。
    4. 打开超净工作台，等待15分钟以重新建立层流气流。
    5. 移除70%乙醇。
    6. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗腔室两次，每次使用1 mL PBS。移除PBS后，将腔室在打开皿盖的条件下过夜干燥。
      注意：也可不使用超净工作台，而采用专用的UV灭菌箱进行灭菌（如有条件）。可通过在衬有铝箔的纸箱内壁后方安装紫外光源来自制UV灭菌箱。铝箔可反射光线，使样品受光均匀。
  2. 在腔室内接种细胞
    1. 使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数。
      1. 将100 µL细胞悬液加入400 µL 0.4%台盼蓝溶液中，轻轻混匀。取100 µL该混合液，轻轻填充血细胞计数板盖玻片下的两个计数室。
      2. 使用显微镜10倍物镜聚焦于血细胞计数板的网格线。使用手动计数器统计血细胞计数板上一组16个方格内的未染色活细胞数量。
      3. 对全部4组16个方格中的细胞进行计数，计算4组细胞数的平均值，并乘以5×104，所得结果即为细胞悬液的细胞浓度（个/mL）。
    2. 向每个腔室的一个孔中加入2,500个细胞。此接种量相当于约30,000/cm2的接近汇合的细胞密度。
    3. 加入细胞后，静置60分钟，再添加培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）。

3. 葡聚糖浸泡琼脂糖块

  1. 制备琼脂糖块
    1. 将3%琼脂糖倒入3D打印的模具中（2 mm × 2 mm × 2 mm）。
    2. 将琼脂糖置于真空室中静置30分钟，使其完全凝固并去除气泡。
    3. 从模具中取出琼脂糖块。
      注意：也可将3%琼脂糖倒入小型培养皿中，厚度为2 mm，然后使用解剖刀或其他切割工具切出2 mm × 2 mm × 2 mm的琼脂糖块。该方法不如模具系统精确，但操作相对简便。
  2. 将琼脂糖块完全浸入所需浓度的趋化因子溶液中。为评估浓度梯度的形成，可先用荧光标记的葡聚糖冲洗小室。所用葡聚糖的浓度和分子量应与目标可溶性因子或药物一致。
  3. 将琼脂糖块浸泡过夜。

4. 通过葡聚糖扩散的时间推移成像评估可溶性因子浓度梯度

  1. 将浸有葡聚糖的琼脂糖块放入微通道室的小方形孔中。
  2. 将微通道室置于细胞成像系统中，或使用具有延时成像功能的其他荧光显微镜。根据制造商的说明开始延时成像。
    注意：所示结果使用GFP滤光片、50%光照、4/10 pH和4倍放大倍数获得。

5. 细胞生长的延时观察

  1. 将细胞接种于微通道室的一端。此处使用3T3成纤维细胞。向微通道室的一个孔中加入2,500个细胞。细胞计数方法见2.2.1节。
    1. 加入培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）前，让细胞在室中静置60分钟。将接种了细胞的微通道室置于37 °C、5% CO2条件下培养。可通过显微镜观察细胞在通道中的迁移情况。
    2. 使用一个标记物，或利用微通道室中的显微结构缺陷作为标记，以确定细胞前沿移动距离的起始位置。
  2. 通过在微通道室一端放置含有高浓度生长因子、趋化因子、药物或其他待测因子（此处以40% FBS为例）的琼脂糖凝胶（8 mm3块状）建立浓度梯度。
  3. 对移动的细胞前沿进行延时成像。此处结果显示，使用成像系统每12小时拍摄一次细胞前沿图像。
  4. 利用细胞前沿图像量化细胞生长速率。首先使用MATLAB中的polyfit函数（roipoly）生成一个多边形掩膜，该掩膜由细胞前沿、通道壁和参考标记共同定义。根据此掩膜的尺寸可得出细胞前沿的迁移距离，进而计算平均细胞前沿迁移速度。其他研究也采用了类似方法8。
    注意：将每一帧图像中细胞生长前沿的位置与该距离处可溶性因子的浓度进行比较。可溶性因子的浓度梯度通过一维扩散模型近似计算得出。
  5. 使用鬼笔环肽（Phalloidin）和DAPI染色对细胞进行荧光成像。
    1. 染色前对细胞进行固定。
      1. 将4%多聚甲醛在37 °C下预热。
      2. 加入足量4%多聚甲醛覆盖细胞，并将细胞置于其中固定10分钟。
      3. 用PBS漂洗两次，每次15分钟。每次使用足量PBS覆盖细胞。
    2. 去除PBS，加入足量透化液（含0.1% Triton X-100的PBS）覆盖细胞，室温孵育10分钟。
    3. 用PBS洗涤两次，每次5分钟。每次使用足量PBS覆盖细胞。
    4. 去除PBS，加入封闭液（含1%牛血清白蛋白的PBS），孵育20分钟。
    5. 去除封闭液，用PBS洗涤两次，每次5分钟。每次使用足量PBS覆盖细胞。
    6. 从此步骤开始，当不进行操作时，使用铝箔包裹样品以避光。去除PBS后，加入用PBS按1:50稀释的Phalloidin 488染液，覆盖细胞，室温孵育1小时。
    7. 用PBS洗涤两次，每次5分钟。每次使用足量PBS覆盖细胞，然后去除PBS。
    8. 加入用PBS按1:1,000稀释的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液，覆盖细胞，室温孵育15分钟。
    9. 去除DAPI染液，用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
    10. 去除最后一次洗涤液，加入足量PBS覆盖细胞。此时可使用荧光显微镜对细胞进行成像。

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结果

图2展示了细胞前沿在通道中朝向牛胎血清梯度方向的移动情况，该血清梯度位于细胞接种位置相对的通道另一端。细胞前沿在接种后48小时（图2A）、72小时（图2B）、96小时（图2C）和120小时（图2D）的状态如图所示。通过这些延时成像追踪细胞前沿的移动，并利用MATLAB的polyfit函数计算细胞迁移距离和生长速率。据此得出细胞前沿的平均迁移速度为13.4 µm/h（图3）。图4展示了在通道一端放置经葡聚糖浸泡的琼脂糖块后，葡聚糖在通道内扩散12小时所建立的荧光梯度。每小时采集一次延时图像，测量并绘制通道长度方向上的荧光强度分布，如图4所示，并与一维扩散模型进行比较。

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讨论

我们的微通道室可用于多种用途，包括测定细胞在生长因子和趋化因子作用下的迁移速率，以及测量药物从聚合物基质中的扩散速率。可以利用我们的微通道室培养细胞，并在腔室的一端放置趋化因子。细胞会朝向趋化因子方向生长，通过采集延时图像并进行分析，可对细胞迁移进行定量，从而确定细胞迁移速率。该方法的代表性结果如图3所示，使用MATLAB的polyfit函数测得生长速率为13.4 µm/h。

我们微通道室的另一个用途是测量药物从聚合物基质中的扩散速率。可使用与目标药物分子量相似的荧光标记葡聚糖来模拟目标药物的扩散过程。需要注意的是，必须小心处理样品，因为强烈的对流会破坏浓度梯度。该方法的代表性结果如图4所示。与Boyden小室法相比，该模型的一个优势在于其表面为平面，更适用于贴壁细胞类型；而在Boyden小室中，细胞必须先穿过一个小管才能贴附。Boyden小室法的另一个局限性在于它是一种终点检测法，因此无法直接观察趋化运动过程。相比之下，使用我们的方法可以通过延时成像实时观察趋化现象9

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢克莱姆森大学的创意探究项目以及美国国家科学基金会（NSF CBET1254609）为本项目提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒Sigma-Aldrich761036双组分聚（二甲基硅氧烷）试剂盒，包含硅酮弹性体基础液和硅酮弹性体固化剂
丙烯酸板US Plastic44200
一次性培养皿 Falcon 25373-041
异硫氰酸荧光素–葡聚糖Sigma-AldrichFD20s-100MG
琼脂糖，I型，低电渗扩散（EEO）Sigma-AldrichA6013-100G
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）Fisher Scientific11965092细胞培养基成分
胎牛血清Fisher Scientific16000036细胞培养基成分
青霉素-链霉素Fisher Scientific15140148细胞培养基成分
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP24384
EVOS XL 细胞成像系统Thermo Fisher ScientificAME3300用于拍摄延时图像的仪器
Versa 激光切割机Universal Laser Systems, Inc. 型号 VLS2.30用于切割塑料的激光切割仪

参考文献

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