体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

摘要

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein 4）及Activin/Nodal信号通路抑制剂，从人多能干细胞高效生成人滋养层细胞的实验方案。该方法适用于人多能干细胞的高效定向分化，可获得大量细胞用于遗传学操作。

摘要

胎盘是胚胎发生过程中最早发育的器官，对胚胎的存活至关重要。胎盘由多种滋养层细胞组成，这些细胞源自着床前胚泡的胚外滋养外胚层细胞。因此，由于在伦理和法律上对人类胚胎发生过程中的胚胎分离与操作存在限制，我们对人类胎盘早期分化事件的理解仍十分有限。人类多能干细胞（hPSCs）是研究人类发育的有力模型系统，也可被诱导分化 体外 分化为表达各类滋养层细胞标志物的滋养层细胞。本文介绍了一种利用骨形态发生蛋白4（BMP4）及Activin/Nodal信号通路抑制剂将人多能干细胞（hPSCs）分化为滋养层细胞的详细实验方案。该方法可生成多种类型的滋养层细胞，可用于siRNA转染以研究功能缺失表型，或用于病原体感染实验。此外，还可对hPSCs进行遗传修饰后再分化为滋养层前体细胞，以开展功能获得性分析。 体外 从人多能干细胞（hPSCs）出发生成人类滋养层细胞的分化方法克服了使用早期人类胚胎所面临的伦理与法律限制，该体系可用于多种应用，包括药物发现和干细胞研究。

引言

胎盘在妊娠期间对胎儿的生长和存活至关重要，它介导母体与胎儿循环之间的气体、营养物质、代谢废物和激素的交换。在哺乳动物胚胎发育过程中，最先形成的器官是胎盘，人类胎盘在受孕后6-7天开始发育，小鼠则在3.5-4.5天开始^1,2,3,4。滋养层细胞是胎盘中最重要的细胞，代表了哺乳动物胚胎最早发生的谱系分化事件之一。这些细胞起源于着床前胚泡的外层胚外滋养外胚层细胞。由于在模拟人类早期发育方面存在伦理和操作上的限制，我们对胎盘发育早期阶段的认识仍然有限。

在胚胎着床过程中，滋养层细胞侵入母体上皮并分化为特化的祖细胞⁵。细胞滋养层细胞（CTBs）是单核的未分化祖细胞，可融合并进一步分化为合体滋养层细胞（SYNs）和绒毛外侵袭性滋养层细胞（EVTs），后者将胎盘锚定于子宫壁。SYNs 是多核的终末分化细胞，能够合成维持妊娠所必需的激素。生成 EVTs 和 SYNs 的早期分化事件对胎盘形成至关重要，因为滋养层细胞功能受损可导致流产、子痫前期以及宫内生长受限¹。目前已建立的人类滋养层细胞系类型包括永生化 CTBs 和绒毛膜癌细胞系，后者可产生胎....

方案

注意：为了将人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为滋养层前体细胞，需先将生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上的人多能干细胞（hPSCs）转移至无饲养层条件下连续传代两次，然后再开始使用BMP4/A/P进行分化。此过程可消除分化细胞中的MEF污染。本文以hESC分化为例介绍实验方案，该方案同样适用于hiPSCs。

1. 在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养和复苏人胚胎干细胞（hESCs）（准备工作）

1. MEF 细胞的γ射线辐照
   1. 配制 500 ml MEF 细胞培养用培养基：含 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素（Pen/Strep）和 0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA）的 DMEM 培养基。
   2. 解冻一管原代 MEF 细胞，并使用 MEF 培养基进行细胞培养。利用 MEF 培养基将原代 MEF 细胞扩增至 30 个培养皿。
      注：此步骤对氧气浓度无严格要求，因此可在生理氧浓度（4%）或常氧环境（20%）的培养箱中进行。
   3. 收集 MEF 细胞。使用 0.25% 胰蛋白酶将 MEF 细胞从培养皿中消化下来，并转移至锥形管中。将 MEF 细胞放入辐照仪中，接受 3,500 拉德（Gy）的辐照剂量。
      注：辐照时间取决于辐照仪内放射源的活性。
   4. 用 MEF 培养基重悬经辐照的 MEF ....

结果

概述 体外 hPSCs的分化

此 体外 分化方案始于在饲养层细胞（MEFs）上培养的未分化人胚胎干细胞，这些细胞在转入无饲养层条件下传代一次后开始进行分化图1A）。尽管本方案中描述的是hESCs的分化，但我们也已成功应用该方案将hiPSCs分化为滋养层细胞。向细胞外基质的转移可去除大部分经照射处理的MEFs，而这些MEFs在需要纯度较高的人类滋养层细胞群体的分析实验中是不希望存在的。未分化的hPSCs在细胞外基质上培养，并使用含有B-FGF的CM培养基培养，直至集落达到传代所需状态（约一周时间），以在诱导BMP4/A/P介导的分化前维持其多能性状态。随后，使用dispase将集落消化为约50–100个细胞组成的细胞团块，并再次传代至包被有细胞外基质的培养板上。传代后次日，贴壁细胞即可用于启动分化，此时更换培养基为含BMP4/A/P但不含B-FGF的培养基。分化后的细胞持续增殖约两周，在此期.......

讨论

我们介绍了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为滋养层前体细胞的基本步骤。该方案近期已得到优化，通过添加Activin/Nodal信号通路抑制剂，可快速诱导hESCs分化，提高向滋养层细胞的分化效率，并避免仅使用BMP4处理时通常出现的中胚层前体细胞的生成。BMP4模型系统可用于研究人类滋养层谱系特化与扩增的最早阶段。此外，该BMP4模型系统还适用于探究滋养层细胞向特定亚谱系的分化，而这是使用绒毛膜癌细胞系或绒毛外滋养层细胞系所无法实现的。体外诱导获得的滋养层细胞也可用于利用siRNA进行的基因功能缺失实验¹⁹。此外，还可对hESCs或hiPSCs进行遗传修饰，以实现外源基因的可诱导表达¹⁹，或在内源性位点插入报告基因²⁰，随后利用本文所述条件将这些细胞分化为滋养层细胞。

实验方案中的关键步骤

为了从人胚胎干细胞（hESCs）获得滋养层祖细胞，必须在CM分化培养基中省略B-FG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out 血清替代物	Invitrogen	10828-028	本方案中将其称为 "血清替代物"。
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-谷氨酰胺	Invitrogen	10828-028
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-155
2-巯基乙醇	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
分散酶	Invitrogen	17105-041
IV型胶原酶	Invitrogen	17104-019
ROCK 抑制剂 Y27632	Calbiochem	688000
经辐照的 CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs 可从胚胎第13.5天的胚胎中分离并进行辐照处理。
0.22 µm 注射器滤器	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i 低氧培养箱	Heracell/VWR	89187-192	任何可调节氧气浓度的组织培养用培养箱均可使用。
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol 用于提取总 RNA。
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	本方案中将其称为 "细胞外基质"。