我们开发了一种模块化的高通量筛选系统，用于发现针对Mycobacterium tuberculosis的新化合物，该系统可靶向胞内生长和液体培养基中生长的细菌，同时评估化合物对哺乳动物宿主细胞的细胞毒性。
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摘要
摘要
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病（TB）的致病菌，也是全球发病和死亡的主要原因之一。随着耐多药结核病（MDR-TB）的传播日益广泛，迫切需要开发针对M. tuberculosis感染的新型治疗策略。传统上，化合物的评估主要基于其在液体培养基中体外（in vitro）生长条件下的抗菌活性；然而，对于M. tuberculosis等胞内病原体而言，液体培养中的表型筛选条件与人体内的实际疾病环境存在显著差异，因此结果往往具有误导性。由于M. tuberculosis感染的复杂性、感染程度的变异性以及复制速度缓慢，传统上在巨噬细胞内筛选有效抑制剂一直较为困难。在本研究中，我们报告了一种新方法，可快速评估化合物在巨噬细胞感染模型中对M. tuberculosis存活能力的影响。通过结合细胞毒性检测和液体培养中M. tuberculosis存活率检测，我们建立了一个能够对目标化合物进行综合分析的筛选系统。该系统能够在低成本条件下生成定量数据，适用于大多数实验室，并且具有高度可扩展性，可适应大规模工业环境的需求。
引言
Mycobacterium tuberculosis 是结核病（TB）的致病菌，在全球范围内是导致发病和死亡的主要原因之一。药物敏感性结核病是一种可治疗的疾病，需联合使用多种抗生素治疗6个月。尽管该病可治，2015年全球结核病死亡人数仍估计达150万1。在过去10年中，人们对耐药性M. tuberculosis的流行情况日益关注。耐多药结核病（MDR-TB）定义为对至少异烟肼（INH）和利福平（RMP）耐药的结核病，且大多数MDR-TB菌株也对部分二线抗结核药物耐药，从而限制了治疗选择。耐药性带来的影响使合并感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的患者治疗面临更大挑战；2015年，全球有40万患者死于HIV相关结核病1。令人失望的是，在过去40年中，美国食品药品监督管理局仅批准了一种用于治疗MDR-TB的新型结核病药物——贝达喹啉2。为了在对抗结核病和耐多药结核病的斗争中保持领先，迫切需要在开发更有效且疗程更短的结核病疗法方面取得进展。
传统上，结核病药物筛选是在液体培养基中的体外（in vitro）生长条件下进行的，即将化合物加入正在生长的菌液中，通过在固体培养基上计数菌落形成单位（CFU）来评估其杀灭微生物的效果。由于CFU计数费时、费力且成本较高，已开发出多种间接方法以缓解这一问题。....
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方案
1. 细菌菌株与培养基
- 将25 g牛血清白蛋白、10.0 g葡萄糖和4.05 g氯化钠溶于460 mL去离子水中，配制白蛋白葡萄糖盐溶液（ADS）。经滤膜除菌后，于4 °C保存。
- 将4.7 g 7H9粉末和2 mL甘油加入900 mL纯化水中，配制7H9液体培养基。在121 °C下高压灭菌10分钟，随后冷却至室温再进行后续操作。取900 mL 7H9液体培养基，加入100 mL ADS和0.5 mL Tween80，配制成7H9ADST培养基。4 °C保存。
- 称取50 mg硫酸卡那霉素，溶于1 mL去离子水中，终浓度为50 mg/mL。过滤除菌后，于-20 °C保存。每1 L 7H9ADST培养基中加入0.5 mL卡那霉素储备液。
注意：该培养基应新鲜配制，因此需根据培养规模相应调整体积。 - 培养 M. tuberculosis 在含卡那霉素的7H9ADST静置培养液中培养。每日振荡培养物，并在OD600达到1.0之前进行稀释，以避免菌体聚集。
注意： M. tuberculosis 用于本方法开发的菌株是带有 pJAK2 质粒的 H37Rv12pJAK2.A 是一种基于 pMV361 载体的整合型质粒，可实现萤火虫荧光素酶基因的高水平表达 hsp60 启动子，并可使用卡那霉素进行筛选。
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结果
高通量细胞内筛选 M. tuberculosis 表达荧光素酶基因
图2A 和 表1 包含光度计收集的原始数据，以相对发光单位（RLU）表示，显示利福平浓度递增对结核病药物作用的影响 M. tuberculosis 在 THP-1 细胞内。 图 2A 是不同浓度利福平的原始发光值（RLU）的散点图。误差线表示均值的标准误差（SEM）。 图2B 显示了处理孔与未处理孔相比发光强度的降低百分比。数据表明，利福平能够降低发光强度 > 99.9% 的 RLU 来自细胞内 M. tuberculosis 在浓度为 0.1 µg/mL。这与先前发表的 MIC 值在 0.1 至 0.4 µg/mL16每个孔中产生的发光信号表明了荧光.......
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讨论
本研究的目的是利用人类细胞内感染模型，建立一种简单且成本效益高的高通量筛选方法 M. tuberculosis结核病是一种由肺泡巨噬细胞感染引起的疾病，其特征为 M. tuberculosis由于生物安全问题，过去的研究曾采用细菌和宿主细胞的生物模型。然而，已有研究表明，替代性细菌和非人类模型在药物研发中对苗头化合物向先导化合物转化的成功率预测能力较差，表明药物筛选最好在感染了目标病原体的人类细胞中进行 M. tuberculosis19,20,21,22.
在本方法中，我们对目前最先进的用于人巨噬细胞样THP-1细胞系的筛选方案进行了改进和优化。为了实现高通量检测，我们对感染流程引入了多项技术改进。首要改进是用基于荧光素酶的报告系统取代了菌落形成单位（CFU）测定中的所有步.......
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披露
作者声明本研究不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由BC肺癌协会和Mitacs资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技 | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | 贝克顿·迪金森公司 | 271210 | |
| 吐温80 | 菲舍尔科技 | T164 | |
| 牛血清白蛋白，pH7 | 安必胜 | 10857 | |
| 右旋葡萄糖 | 菲舍尔科技 | BP350 | |
| 氯化钠 | 菲舍尔科技 | BP358 | |
| 硫酸卡那霉素 | 菲舍尔科技 | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | 菲舍尔科技 | D131 | |
| 1 M 盐酸（HCl） | 菲舍尔科技 | 351279212 | |
| 乙酸 | 菲舍尔科技 | 351269 | |
| SDS | 菲舍尔科技 | BP166 | |
| 刃天青 | 阿尔法埃萨 | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| 甘油 | 菲舍尔科技 | BP229 | |
| THP-1 | 美国模式培养物集存库 | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96孔平底白色板 | 康宁 | 3917 | |
| 95孔平底透明板 | 康宁 | 3595 | |
| 透明板封膜 | 赛默飞世尔科技 | AB-0580 | |
| 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | Biomate 3 | |
| 微孔板分光光度计 | Biotek | Epoch | |
| 发光检测仪 | 应用生物系统 | Tropix TR717 |
参考文献
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric m....
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