方法文章

大分子生物聚合物在干燥空气-液晶界面自整合的方法

DOI：

10.3791/55274

⸱

2017年4月7日

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

本文内容

摘要

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本文提供了一种在气-液晶体界面处通过干燥诱导大分子生物聚合物自组装的方法。该方法不仅有助于理解生物聚合物的宏观性能，还可作为生物医学和环境领域中软材料的评估手段。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用水的生物体在环境中总是容易发生干燥。其生命活动由基于生物大分子的微观和宏观结构驱动，例如维管束中水分的运输以及皮肤层中水分的保湿。本研究建立了一种评估由生物大分子组成的水性液晶（LC）溶液对干燥影响的方法。由于LC生物大分子具有超大分子量，我们选择研究多糖、细胞骨架蛋白和DNA。在偏振光下观察生物大分子溶液干燥过程时，可发现从不稳定的空气-LC界面开始的毫尺度自整合现象。通过从单侧开口的样品池中蒸发水分，可监测水性LC生物大分子溶液的动力学行为。利用正交偏振光拍摄图像并进行分析，能够识别出空间和时间上的变化 取向序参量该方法不仅可用于表征多个领域中的人工材料，还可用于表征天然活体组织。我们相信，该方法将为生物医学和环境领域的软质材料提供一种有效的评估手段。

引言

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通过关注生物大分子的刚性棒状结构，动态软材料已被用于多种应用，包括多糖生物膜基质1、由细胞骨架蛋白组成的"活性凝胶"2，以及具有特定形状的"DNA折纸"3。为了阐明其结构特性，研究人员已探索了多种策略，如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、原子力显微镜和共聚焦荧光显微镜。然而，由于这些方法大多在干燥或静态状态下进行，难以解释实际生命系统中宏观尺度上的动态行为。最近，我们通过偏振光成功观测到生物大分子在水-空气液晶界面的动态行为4。在干燥生物大分子溶液过程中对取向结构进行可视化时，时间上的变化表明生物大分子在不稳定的空气-液晶界面上发生了自整合。

在此，我们描述了一种利用偏振仪器在气-液晶界面干燥液晶生物聚合物溶液的实验方案。与那些不考虑干燥过程的液晶相分析方法不同5,6通过评估单侧开口细胞中流体相侧向视图的取向序参数，研究了干燥过程中液晶的动态行为。结合细胞蒸发与偏振仪器的使用，实现了对蒸发方向可控的宏观监测。此外，通过聚焦吸附微区的晶体结构，可对干燥记录进行验证，这些晶体结构受到分子量、浓度的影响。 等等。 为验证该方法的有效性，研究了具有刚性棒状结构的基本生物大分子（如多糖、微管（MTs）和DNA）的干燥过程。选择这些生物大分子是因为它们是具有兆级分子量的层级化大分子的典型代表，且其分子间相互作用使其能够形成液晶态。

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方案

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1. 仪器

  1. 偏振装置
    1. 构建偏振装置时，需配备卤素灯作为光源、导光管、偏振片、样品台、光学导轨、支架杆和数码单反相机（偏振装置的部件参见图1C和材料清单）。

2. 生物大分子溶液的制备

  1. 多糖溶液
    1. 溶解萨克兰7 (0.5 g) 溶于纯水 (100 mL) 中，于约 80 ℃ 搅拌溶解 °在室温下静置超过12小时以充分溶解。溶解过程中，用塑料薄膜覆盖容器以防止蒸发。以相同方法制备黄原胶的水溶液。
    2. 将溶液冷却至约 25 °C，以制备0.5 wt%的水溶液。
    3. 将囊藻素溶液离心以去除杂质（48,400 × g，4 °C） °C，1小时，3次）
  2. MT 溶液
    1. 配制 1 mL 含 0.5 wt% 微管蛋白的 Britton-Robinson 缓冲液（80 mM 哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸) (PIPES)；1 mM 乙二醇-双(β-氨基乙基醚-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）；和 5 mM MgCl2，pH 6.8）置于冰上8.
    2. 使用0.5 wt%的微管蛋白溶液（50 µL）和鸟苷-5'-[（α,β)-亚甲基三磷酸（GpCpp）（5 µL）以制备含 GpCpp 的微管蛋白溶液（50 µL）。在37℃下孵育 °C下孵育3小时以获得稳定的微管核。
      注意：GpCpp 的作用是支持微管（MT）的形成，并完全抑制微管解聚为微管蛋白。
    3. 将0.5 wt%微管蛋白溶液（950 µL）以及含 GpCpp 的微管蛋白溶液（50 µL）在约25 °C 下保存 1 天，以获得稳定的 0.5 wt% MT 溶液。
  3. DNA溶液
    1. 在Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，含1 mM EDTA）中配制0.5 wt%的DNA溶液（1 mL）。
  4. 将0.5 wt%的生物聚合物样品溶液置于25 ℃下保存 °干燥实验中的 C。

3. 偏振光下干燥实验与观察

  1. 一侧开口容器中的溶液（图1A）
    1. 将硅胶片（参见材料列表）切割成适当形状，厚度为1 mm（内径尺寸为5-15 mm、1 mm和约20 mm）； 图1A).
      1. 组装一个单侧开口的样品池，该样品池由内尺寸为5-15 mm、1 mm和约20 mm的硅胶垫片以及两片未修饰的玻璃载片（76 mm × 1 mm × 26 mm）。预先用双夹固定细胞的两侧，以防止样品溶液泄漏。
    2. 缓慢加入每种0.5 wt%的生物聚合物溶液（100–300 µL）使用孔径约 1 mm 的移液器吸头向每个细胞加入约 25 °C. 使用注射器针头去除样品池中的气泡。
    3. 将细胞置于带有空气循环装置的60 °C烘箱中 °在大气压下进行蒸发，蒸发方向与重力方向相反。
  2. 正交偏振光下的观察（图1B-1C）
    1. 通过100 W卤素灯提供均匀区域（80 mm × 80 mm）的平面光源直射可见光。将偏振器调整至45°° 和135° 使用支架（图1C).
    2. 使用光学导轨和支架固定光源、偏振片、样品台和相机的位置（图1C将样品台置于两个偏振片之间（偏振片之间的距离应约为 5 cm）。将相机置于距样品台约 20 cm 处，以便对焦。
    3. 在指定时间，将步骤 3.1.3 中的样品置于平行于 XZ 平面的载物台上两偏振片之间，并用黑色帘布覆盖装置；实际装置如图所示 图1C.
    4. 使用数码单反相机配备标准变焦镜头（参见材料列表），通过线性交叉偏振器拍摄样品。利用计算机软件（参见材料列表）控制相机设置，如焦距等参数。
  3. 透射光强度的时空分析（图1C）
    1. 评估取向序参量的变化 在干燥过程中，每小时采集一次照片，持续24小时。
    2. 使用图像处理程序沿 Z 方向中心线测量透射光强度的灰度值（例如， ImageJ
    3. 绘制灰度值随距上部开口侧距离变化的函数图像。
  4. 正交偏振光下的显微观察（图1D）
    1. 为验证该方法，使用配备CCD相机的偏光显微镜进行显微观察9. 在光路中放置一阶延迟片。使用计算机软件控制拍摄条件。

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结果

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使用如图1所示的装置，评估了在干燥的空气-液晶（LC）界面上从微区到宏区的自组装过程（图2A）。作为干燥实验的首次演示，比较了两种巨型大分子多糖：依克多因多糖（sacran，Mw = 1.9 × 107 g mol-1）和黄原胶（4.7 × 106 g mol-1）。图2B显示了在正交偏振光下样品池中溶液的照片。干燥前，两种溶液中均可见散在分布的多个明亮区域，表明有透射光通过。在60 °C下干燥6小时后，sacran溶液中空气-LC界面下方区域显著增强。这表明在界面处形成了宏观取向结构，类似于凝胶收缩过程中表层的形成10。相比之下，当温度从25 °C升至60 °C时，黄原胶溶液的强度急剧下降，且在界面下方仅观察到一些较小的宏区。这是因为黄原胶微区的分子运动性对温度的敏感性远高于sacran微区。因此...

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讨论

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由于透射光强度过低，相机有时难以对样本进行对焦。在这种情况下，在载物台上放置一层延伸的透明塑料薄膜有助于调节焦距。可观测分辨率的限制取决于相机镜头，本例中约为 10 µm。样本厚度的可观测极限 Δy 取决于光源的最大光强，本例中约为 10 mm。

所示装置的优势在于 图1B 其优势在于可在样品干燥过程中拍摄侧面图像。该观察方法无需依赖普通显微镜所使用的水平平面。在干燥实验中，通过将一侧开口的样品室垂直放置，可调控蒸发方向，使其与重力方向相反。对侧面的监测还可实现干燥速率的计算4.

未来，通过在设备的样品台上安装温度和湿度调节器，将能够自动监测取向序参量的时间变化。此外，在装置中增加用于监测重量变化的天平将有助于浓度的估算。该方法还可用于阐明多糖水凝胶的各向异性溶胀过程11,12。因此，将有可能实时监测软致动器的结构变化。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究得到了日本文部科学省青年科学家资助项目（16K17956）、京都高科技中心以及御谷研究与发展基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
sacran日本 Green Science Materials 公司来自 Aphanothece sacrum。
Mw = 1.9 × 107 g mol-1
黄原胶日本太阳化学株式会社Neosoft XC来自野油菜黄单胞菌。
Mw = 4.7 × 106 g mol-1
微管蛋白Cytoskeleton, Inc., USAT240来自猪脑。
GpCppJena Bioscience，德国NU405L
哌嗪-N,N′-二(2-乙烷磺酸)Sigma-Aldrichi, Co. LLC.P6757-500GPIPES
乙二醇-双(β-氨基乙基醚-N,N,N',N'四乙酸Dojindo Molecular Technologies, Inc.342-01314EGTA
MgCl2-6H2O和光纯药工业株式会社135-15055
KOH和光纯药工业株式会社162-21813沉淀物
DNASigma-Aldrich, Co. LLCD1626来自鲑鱼睾丸
Mw = 1.3 × 106 Da（约 2,000 bp）
Tris-EDTA 缓冲液Sigma-Aldrich, Co. LLCT9285-100ML10 mM Tris，pH 8.0，含 1 mM EDTA
载玻片日本 Matsunami Glass Ind., Ltd.S1111
硅橡胶片Asone 公司6-611-32厚度：1 mm
离心机Beckman-Coulter, Inc., USAAvanti J-25配备 JA-20 转子
光源住友电工光学玻璃株式会社，日本LS-LHA
导光板Sumita Optical Glass, Inc., 日本GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80 mm × 80 mm
卤素灯Ushio Inc.，日本JCR 15V150WBN
支架Sigmakoki, Co., Ltd.KMH-80
样品台Sigmakoki, Co., Ltd.TARW-25503L
样品池Sigmakoki, Co., Ltd.SHA-25RO
棒状Sigmakoki, Co., Ltd.ROU-12-40
样品架Sigmakoki, Co., Ltd.RS-6-40
样品架Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-60
样品架Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-80
样品架Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-130
载体Sigmakoki, Co., Ltd.CAA-25LS
相机支架Sigmakoki, Co., Ltd.CMH-2
中等光学导轨Sigmakoki, Co., Ltd.OBA-500SH
透镜管Tomytech, BORGlenstube BK80φ，L25 毫米 
透镜管Tomytech, BORGlenstube BK80φ，L50 毫米 
多波段Tomytech, BORG80φ 
V 片Tomytech, BORGV型板 60S
载物台Viexen, Co., Ltd.SX样品板架
EOS Kiss X7i 佳能株式会社，日本8594B001使用标准变焦镜头  EFP 18-55 mm
摄影软件佳能公司，日本EOS Utility
PCMicrosoft表面
偏振显微镜OlympusBX51
一阶延迟片OlympusU-TP530λ = 530 nm
CCD相机OlympusDP80
摄影软件OlympuscellSens Standard
基于Java的图像处理程序美国国立卫生研究院ImageJ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

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