细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

摘要

这里，我们提出了一个协议，用于一个马赛克标记技术，它允许从一个共同的祖细胞在两种不同颜色来源的神经元的可视化。这有利于与出生约会单个神经元中不同个体的相同的神经元的能力，研究基因功能的神经谱系分析。

摘要

中号 osaic带有R epressible 有丝米 arker 一 nalysis（MARCM）是一种已被广泛应用在果蝇的神经生物学研究来描绘复杂的形态和内，否则无人盯防和泰然自若操纵基因功能的神经元亚群的积极镶嵌标签制度生物。在MARCM系统中产生遗传马赛克通过同源染色体之间的位点特异性重组内分裂前体细胞的有丝分裂过程中，以产生两个标记（MARCM克隆）和未标记的子细胞介导的。所述MARCM方法的扩展，称为双点MARCM（tsMARCM），标签都从具有两种不同颜色的共同祖先来源的双细胞。这种技术被开发，以使从两个半谱系有​​用信息的检索。通过综合分析对不同tsMARCM克隆的tsMARCM系统允许高分辨率神经系mapping至揭示从共同祖细胞产生的标记的神经元的确切出生顺序。此外，tsMARCM系统还通过允许不同动物的相同神经元的表型分析延伸基因功能的研究。在这里，我们将介绍如何应用tsMARCM系统，方便神经发育研究果蝇 。

引言

脑，由广大多样类型的神经元的，赋予动物感知，处理和来自外部世界的挑战的反应能力。成年果蝇中央脑的神经元被从神经干细胞的数量有限的派生，称为神经母细胞（NBS），开发^1,2中。大多数国家统计局参加在果蝇脑内神经发生不对称分裂产生自我更新国家统计局和神经节母细胞（系膜细胞）和系膜细胞然后再通过另一轮分裂产生分化成神经元³两个子细胞（ 图1A ）。由于神经元形态的复杂性，并确定具体的神经元，正面镶嵌标签技术，以阻遏细胞标记物（MARCM）马赛克分析相关的挑战，被发明使visualizat一个单一的神经元即神经元的一小部分出来的周边，未标记的神经元⁴的人口的离子。

MARCM利用翻转酶（FLP）/ FLP识别目标（FRT）系统介导携带阻抑基因，其表达通常抑制报道基因⁴的表达的杂合等位基因的分割前体细胞内的同源染色体之间的位点特异性重组。的有丝分裂后，重组染色体分成双细胞，使得一个单元包含阻抑基因的纯合等位基因，而另一个单元没有阻遏基因的记者的在该小区（和其后代）表现不再⁴受阻。三个克隆型态通常在MARCM实验....

方案

1.建立使用所需转基因^11，13 tsMARCM准备苍蝇

1. 生成tsMARCM准备苍蝇从被个别苍蝇进行¹¹转基因的原始版本（ 见表1）。进行标飞遗传交叉方案中，其中先前已经描述的，通过将多个转基因在相同的飞股^13。
   1. 在一种亲本系，组装FRT ^40A，UAS - mCD8 :: GFP（第一报告，mCD8 :: GFP的转基因;转基因的表达是上游激活序列的启动子控制，其产生的膜-拴系记者下所述RNAi对大鼠簇0的表达;绿色荧光蛋白融合的分化8蛋白的小鼠群），和UAS-rCD2RNAi（抑制第二记者表达的抑制的˚F分化2，rcd2）在^第 2 ^次染色体的左臂。地点 组织特异性-GAL4驱动在X或^第三染色体，如果可能的话。
   2. 在另一亲本系，组装FRT ^{40A，UAS-rCD2} :: RFP的转基因（第二记者，rCD2 :: RFP;另一膜-拴系的记者由具有红色荧....

结果

该tsMARCM系统已被用于通过检索来自共同的NB衍生的神经元的重要信息，以促进神经谱系分析和基因功能研究。该系统已被用于识别大部分（如果不是全部）的神经元类型，确定每个神经元类型的细胞数量，并确定使用tsMARCM这些神经元的出生顺序^{11，12，18（}见讨论部分的详细说明开展神经系分析和基因功能研究）。在这里，我们使用具有GAL4-GH146标记为实施例anterodorsal嗅觉投射神经元（在果蝇嗅觉系统的ALAD1神经谱系adPNs）四tsMARCM克隆来说明如何进行tsMARCM实验^1,2。后FLP表达处于萌芽阶段，SI诱发45品红adPNs相关ngle，绿色VL2p ADPN在tsMARCM克隆（ -

讨论

该议定书中的关键步骤

步骤1.1.1，1.2.1，2.3，2.5和3.2是获得良好tsMARCM结果是至关重要的。不表达在神经祖细胞GAL4组织特异性-GAL4驱动是优选的步骤1.1.1和1.2.1。避免过度拥挤在步骤2.3在飞食品小瓶生长的动物。因为感应延迟，FLP的在热休克的表达水平，和神经祖细胞（ 即，NBS和系膜）的平均分割时间是未知的，这是最好的，以改变热休克的时间（10，20，30 ，40，和50分钟）在步骤2.5中相同的基因型和发育阶段的不同的样品。这将允许的最佳热休克时间的确定，以便获得感兴趣tsMARCM克隆的最佳比例。此外，在步骤3.2，以获得完整的脑样品蝇脑解剖期间小心;这是用于精确地计数神经元细胞数的关键。对于RESE弓箭谁有兴趣使用tsMARCM研究其他染色体臂基因的功能（ 例如，2R，3L和3R），tsMARCM就绪蝇应当通过选择合适的成对FRT，UAS-的转基因的组装如在步骤1.2 mCD8.GFP.UAS-rCD2i， 和UAS-rCD2.RF.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二氧化碳 （CO2）	当地供应商	n.a.	麻醉苍蝇
CO2垫	当地供应商	n.a.	分拣、交叉和转移果蝇
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech（或其他供应商）	PBS001	解剖、冲洗、清洗和免疫染色苍蝇脑
甲醛	Sigma-Aldrich	252549	修复苍蝇大脑
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	冲洗、清洗和免疫染色苍蝇大脑
正常山羊	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	果蝇脑
抗小鼠 CD8 抗体	Invitrogen	MCD0800	免疫染色果蝇脑
抗 DsRed 抗体	Clonetech	632496	免疫染色果蝇脑
抗 Brp 抗体	发育研究 杂交瘤细胞库	nc82	免疫染色果蝇脑
与 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗大鼠 IgG 抗体	Invitrogen	A11006	免疫染色果蝇脑
羊抗兔 IgG 抗体与 Alexa Fluor 546	偶联 Invitrogen	A11035	免疫染色
羊抗小鼠 IgG 抗体与 Alexa Fluor 647 偶联	Invitrogen	A21236	免疫染色果苍
SlowFade gold 抗淬灭试剂	Molecular Probes	S36936	安装苍蝇脑并保护荧光淬灭
PYREX 9 凹陷玻璃点板	康宁	7220-85	解剖、冲洗、清洗和免疫染色苍蝇脑
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	世界精密仪器	SYLG184	制作黑色 Sylgard 培养皿，在脑解剖过程中保护镊子
活性炭	Sigma-Aldrich	242276-250G	制作黑色 Sylgard 培养皿
Dumont #5 镊子	Fine Science工具	11252-30	解剖和安装苍蝇大脑
微型载玻片	康宁	2948-75x25	安装苍蝇大脑
微型盖玻片 1.5	号 VWR International	48366-205	安装苍蝇大脑
指甲油	当地供应商	不可用	密封微型载玻片上的微型盖玻片
培养箱	Kansin Instruments	LTI603	培养物在 25 °C
（或其他供应商）
水浴	Kansin Instruments	WB212-B2	37 °C 下对果蝇产生热休克;C
（或其他供应商）
轨道摇床	Kansin Instruments	OS701	洗涤和免疫染色 果蝇脑
（或其他供应商）
解剖显微镜	Leica	EZ4	分选、杂交和转移果蝇;解剖、冲洗、清洗和免疫染色 苍蝇脑
共聚焦显微镜	蔡司（或其他供应商）	LSM 700（或其他型号）	图像 tsMARCM 克隆
图像处理软件 1 （例如，蔡司 LSM 图像浏览器）	蔡司	不可用	共聚焦图像图像
处理软件 2 项目堆栈（例如 、ImageJ）	不可用	不可用 计数	tsMARCM 克隆的细胞数