需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用双色标记克隆分析系统进行细胞谱系追踪与基因功能研究

9.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55278

⸱

2017年3月2日

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, 2Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种嵌合标记技术的实验方案，该技术可使源自同一前体细胞的神经元以两种不同的颜色进行可视化。这有助于开展神经谱系分析，能够对单个神经元进行出生时间标记，并在不同个体的相同神经元中研究基因功能。

摘要

利用可抑制细胞标记的嵌合分析（Mosaic analysis with a repressible cell marker, MARCM）是一种正向嵌合标记系统，已广泛应用于Drosophila神经生物学研究中，用于描绘复杂的神经元形态，并在整体未标记且未受干扰的生物体中对特定神经元亚群的基因功能进行操控。MARCM系统中的遗传嵌合体通过分裂中的前体细胞内同源染色体之间的位点特异性重组实现，在有丝分裂过程中产生被标记（MARCM克隆）和未被标记的子细胞。MARCM方法的一种扩展技术称为双色标记MARCM（twin-spot MARCM, tsMARCM），可利用两种不同的荧光颜色同时标记来自同一前体细胞的两个子代细胞。该技术的开发旨在从两个半谱系中同时获取有用信息。通过系统分析不同组合的tsMARCM克隆，tsMARCM系统能够实现高分辨率的神经谱系图谱构建，揭示由共同前体细胞产生的标记神经元的精确出生顺序。此外，tsMARCM系统还拓展了基因功能研究，允许对不同个体中相同类型的神经元进行表型分析。本文中，我们描述了如何应用tsMARCM系统以促进对Drosophila神经系统发育的研究。

引言

大脑由大量且多样化的神经元组成，赋予动物感知、处理和应对外界挑战的能力。成年个体的神经元 果蝇 中枢脑在发育过程中源自数量有限的神经干细胞，称为神经母细胞（NBs）1,2参与大脑神经发生的大多数NBs在 果蝇 进行不对称分裂，产生具有自我更新能力的神经母细胞（NBs）和神经节母细胞（GMCs），随后GMCs再经历一次分裂，生成两个子细胞，这些子细胞分化为神经元3 (图1A）。由于神经元形态复杂，且识别特定神经元存在困难，研究人员开发了一种正向镶嵌标记技术——利用可抑制细胞标记物的镶嵌分析（mosaic analysis with a repressible cell marker, MARCM），该技术能够从大量未标记的邻近神经元中实现单个神经元或少量神经元亚群的可视化4.

MARCM 利用 Flippase（FLP）/FLP 识别靶点（FRT）系统，在携带阻遏基因杂合等位基因的分裂前体细胞中介导同源染色体之间的位点特异性重组，该阻遏基因的表达通常抑制报告基因的表达4。有丝分裂后，重组染色体被分配到两个子细胞中，使得一个细胞含有阻遏基因的纯合等位基因，而另一个细胞则完全缺失阻遏基因——报告基因在该细胞及其后代中的表达不再受到抑制4。当在神经母细胞（NBs）或成神经细胞（GMCs）中随机诱导 FLP 时，MARCM 实验中通常可观察到三种克隆模式：单细胞和双细胞-GMC 克隆，可用于单细胞分辨率下神经元形态的描绘；以及多细胞-NB 克隆，可揭示源自同一神经母细胞的全部神经元的形态模式（图1B）。MARCM 技术已广泛应用于黑腹果蝇（Drosophila）神经生物学研究中，包括神经元类型鉴定以重建全脑连接网络、神经谱系分析以揭示神经元的发育历史、细胞命运决定相关基因功能的表型表征，以及神经元形态发生和分化研究5,6,7,8,9,10。由于传统的 MARCM 仅在诱导的有丝分裂重组事件后标记两个子细胞之一（及其谱系），来自未标记一侧的潜在有用信息因此丢失。这一局限性使得基本的 MARCM 系统难以应用于许多快速转换细胞命运的神经谱系的高分辨率分析，或难以对不同个体中相同神经元的基因功能进行精确分析11,12。

双标记MARCM（tsMARCM）是一种先进的系统，可利用两种不同的颜色标记源自同一前体细胞的神经元，从而能够从双生细胞的两侧获取有用信息，克服了原始MARCM系统的局限性11（图2A–2C）。在tsMARCM系统中，两个基于RNA干扰（RNAi）的抑制子位于前体细胞中同源染色体的反式位点上，这些抑制子的表达可独立抑制各自报告基因的表达（图2B）。在FLP/FRT系统介导的位点特异性有丝分裂重组发生后，这两个基于RNAi的抑制子被分配到双生细胞中，从而允许不同报告基因的表达（图2B）。在tsMARCM实验中通常可观察到两种克隆模式：单细胞关联的单细胞克隆和两细胞GMC（成神经细胞）关联的多细胞NB（神经母细胞）克隆（图2C）。来自双生细胞一侧的信息可作为另一侧的参照，从而实现高分辨率的神经谱系分析，例如对标记神经元进行出生时间测定，以及在不同个体动物中对相同神经元进行表型分析，以精确研究神经基因功能11,12。本文提供了一个逐步操作的实验方案，描述如何开展tsMARCM实验，可供其他实验室用于拓展对果蝇（Drosophila）神经系统发育（以及其他组织发育，如适用）的研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 使用所需转基因构建适用于tsMARCM的果蝇11,13

  1. 从携带转基因的个体果蝇中生成可用于tsMARCM技术的原始果蝇品系11 （参见 表1）。通过将多个转基因整合到同一果蝇品系中，进行标准的果蝇遗传杂交实验，具体方案此前已有描述。13.
    1. 在一条亲本品系中，组装转基因 FRT40A, UAS-mCD8::GFP （第一个报告基因，mCD8::GFP；该转基因的表达由上游激活序列启动子调控，表达产物为小鼠分化簇8蛋白的膜锚定型报告分子，该蛋白与绿色荧光蛋白融合） UAS-rCD2RNAi （抑制第二个报告基因表达的抑制子；针对大鼠分化簇2表达的RNA干扰） rcd2) 在2号染色体的左臂上nd 染色体。放置 组织特异性的-GAL4 X 或 3 上的驱动程序rd 染色体，如果可能的话。
    2. 在另一亲本品系中，组装转基因的 FRT40A, UAS-rCD2::RFP （第二个报告基因，rCD2::RFP；另一种膜锚定报告基因，由rCD2蛋白与红色荧光蛋白融合而成），以及 UAS-GFPRNAi （抑制mCD8::GFP表达的抑制子；针对表达的RNAi） gfp) 在2号染色体的左臂上nd 染色体。放置 热激（hs）-FLP 或组织特异性-FLP 在 X 或 3 上rd 染色体，如果可能的话。
  2. 从携带转基因的个体果蝇中生成可用于tsMARCM的新版本果蝇14 （参见 表1）。通过将多个转基因整合到同一果蝇品系中，进行标准的果蝇遗传杂交实验，相关方案此前已有描述。13.
    1. 在一条亲本品系中，组装转基因的 FRT 位点和 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i （一个组合的转基因） mCD8::GFP 以及在同一侧臂中共同插入抑制rCD2::RFP表达的抑制子nd 或 3rd 染色体（适当配对的转基因） FRT 和 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i 如图所示 表1）。放置 组织特异性GAL4 除所选染色体之外的其他染色体上的驱动因子 FRT 尽可能选择合适的位点。
    2. 在另一亲本品系中，组装转基因的 FRT 位点和 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi （另一个组合的转基因） rCD2::RFP 以及在同一臂的2中抑制mCD8::GFP表达的抑制子nd 或 3rd 染色体（适当配对的转基因） FRT 和 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi 如图所示 表1）。放置 hs-FLP 或 组织特异性FLP 除所选染色体以外的其他染色体上 FRT 尽可能选择合适的位点。

2. 杂交具备 tsMARCM 条件的果蝇以在其子代中产生 tsMARCM 克隆

  1. 将已准备好用于tsMARCM的果蝇进行杂交（例如， 将步骤1.1.1或1.2.1中的10–15只雄蝇与步骤1.1.2或1.2.2中的20–30只处女雌蝇共同放入一个装有新鲜制备酵母糊（涂于管壁）的果蝇培养管中。
  2. 将已交配的tsMARCM准备果蝇在25 °C下维持2天，以提高收集受精卵前的交配成功率。
  3. 定期将已交配的tsMARCM准备果蝇转移至新添加酵母的试管中，以避免过度拥挤（轻敲试管使果蝇沉降，或使用二氧化碳麻醉果蝇以方便转移；每10 mL果蝇培养基试管中保留的受精卵不超过80–100个，以防孵化幼虫过多）。
  4. 培养 tsMARCM 动物（即， 受精卵；tsMARCM 动物基因型的一个示例，如实验中所用 图3是 hs-FLP[22]，w/w；UAS-mCD8::GFP，UAS-rCD2RNAi，FRT40A,GAL4-GH146/UAS-rCD2::RFP,UAS-GFPRNAi,FRT40A; +; +）在25 °C下连续转移至小瓶中培养，直至发育至所需阶段（例如， 胚胎、幼虫或蛹
  5. 将含有tsMARCM动物且处于相同发育阶段的转移小管分别置于37 °C水浴中处理10、20、30、40和50分钟，以确定诱导FLP表达从而产生目标tsMARCM克隆的最佳热激时间。若采用组织特异性启动子驱动FLP表达，则可省略此步骤。FLP 正在用于tsMARCM实验（hs-FLP 神经谱系分析首选该方法；此前已有文献描述了选择该方法的原因15).
    注意：若希望在后续的tsMARCM实验中获得更多的tsMARCM克隆，请使用最佳热激时间重复步骤2.5；通常，更长的热激时间会诱导出更多的FLP表达 hs-FLP[22] 与……相比 hs-FLP[1] 相同的热激时间
  6. 将热激后的tsMARCM动物在25 °C下培养至适当的发育阶段，然后进行步骤3。

3. 准备、染色并封片含有 tsMARCM 克隆的果蝇大脑

  1. 准备镊子保护皿。将硅胶弹性体试剂盒的A组分（30 g）和B组分（3 g）与活性炭（0.25 g）混合。将混合物倒入适当的培养皿中。
  2. 在解剖显微镜下，使用镊子在镊子保护皿中的1×磷酸盐缓冲液（PBS）内解剖tsMARCM动物的幼虫、蛹或成虫脑组织。注：果蝇脑组织解剖方案已有先前文献描述16。
  3. 在玻璃凹孔板中，用含4%甲醛的1×PBS在室温下固定果蝇脑组织20分钟。后续所有步骤均在此玻璃凹孔板中处理果蝇脑组织。
  4. 用含1% Triton X-100的1×PBS（即1% PBT）冲洗果蝇脑组织三次，随后在1% PBT中每次孵育30分钟，共洗涤三次（冲洗：迅速移除PBT并加入新的PBT；洗涤：移除PBT后加入新的PBT，并将果蝇脑组织置于新PBT中使用旋转摇床孵育）。
  5. 在4 °C下过夜或在室温下孵育4小时，使果蝇脑组织与一抗混合物反应。一抗混合物示例：大鼠抗CD8抗体（1:100）、兔抗DsRed抗体（1:800）和小鼠抗Bruchpilot（Brp）抗体（1:50），溶于含5%正常山羊血清（NGS）的1% PBT中。
  6. 用1% PBT冲洗果蝇脑组织三次，然后在1% PBT中每次洗涤30分钟，共三次。
  7. 在4 °C下过夜或在室温下孵育4小时，使果蝇脑组织与二抗混合物反应。二抗混合物示例：与绿色荧光染料偶联的山羊抗大鼠IgG抗体（1:800）、与黄色荧光染料偶联的山羊抗兔IgG抗体（1:800）和与远红荧光染料偶联的山羊抗小鼠IgG抗体（1:800），溶于含5% NGS的1% PBT中。
  8. 用1% PBT冲洗果蝇脑组织三次，然后在1% PBT中每次洗涤30分钟，共三次。将脑组织用抗淬灭试剂封片于载玻片上。盖上盖玻片以覆盖并保护果蝇脑组织。用透明指甲油密封盖玻片与载玻片的边缘。将封好的果蝇脑组织标本于4 °C保存。

4. 获取、处理和分析 tsMARCM 克隆的荧光图像

  1. 使用选定的共聚焦显微镜系统，对步骤3.8中制备的样品中的tsMARCM克隆进行荧光成像。
  2. 使用所选共聚焦显微镜系统配套的图像处理软件，将 tsMARCM 共聚焦荧光图像的投影堆栈生成二维平面图像（参见 图3B-3E, 3G-3J, 3L-3O, 和 3Q-3T 用于展示共聚焦荧光图像的平面化示例）。
  3. 使用适当的图像处理软件，对tsMARCM克隆的多细胞-NB侧的细胞数量进行计数例如， 的 "细胞计数仪" ImageJ 中的功能17；参见 图3E, 3J, 3O，以及 3T （例如神经元的细胞体）

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

tsMARCM 系统已被用于促进神经谱系分析和基因功能研究，通过获取源自共同神经母细胞（NBs）的神经元的重要信息。该系统已被用于鉴定大多数（即使不是全部）神经元类型，确定每种神经元类型的细胞数量，并明确这些神经元的出生顺序11,12,18（详见讨论部分中关于使用 tsMARCM 进行神经谱系分析或基因功能研究的说明）。在此，我们以标记有 GAL4-GH146 的四个 anterodorsal 嗅觉投射神经元（adPNs，在果蝇 Drosophila 嗅觉系统的 ALad1 神经谱系中）的 tsMARCM 克隆为例，说明如何进行 tsMARCM 实验1,2。在胚胎期诱导 FLP 表达后，在一个 tsMARCM 克隆中检测...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

方案中的关键步骤

步骤 1.1.1、1.2.1、2.3、2.5 和 3.2 对获得良好的 tsMARCM 结果至关重要。在步骤 1.1.1 和 1.2.1 中，应优先选用在神经前体细胞中不表达 GAL4 的组织特异性-GAL4 驱动子。在步骤 2.3 中，应避免果蝇培养瓶中的个体过于拥挤。由于热激后 FLP 的诱导潜伏期、GAL4 表达水平以及神经前体细胞（即 神经母细胞 NBs 和中间神经前体细胞 GMCs）的平均分裂时间尚不明确，建议在步骤 2.5 中对相同基因型和发育阶段的不同样本采用不同的热激时间（10、20、30、40 和 50 分钟），以确定最佳热激时间，从而获得理想的 tsMARCM 克隆比例。此外，在步骤 3.2 进行果蝇脑解剖时需格外小心，以获取完整的脑组织样本，这对于准确计数神经元数量至关重要。对于希望将 tsMARCM 技术应用于研究其他染色体臂上基因功能的研究人员（例如 2R、3L 和 3R），应参照表 1 中所列的 FRT、UAS-mCD8.GFP....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由科技部（MOST 104-2311-B-001-034）以及中国台湾中央研究院细胞与个体生物学研究所资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二氧化碳（CO2）本地供应商n.a.麻醉果蝇
CO2 垫本地供应商n.a.分选、杂交和转移果蝇
10x PBS pH 7.4Uniregion Bio-Tech（或其他供应商）PBS001解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织
甲醛Sigma-Aldrich252549固定果蝇脑组织
吐温 X-100Sigma-AldrichT8787漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织
正常山羊Jackson ImmunoResearch 005-000-121免疫染色果蝇脑组织
血清
大鼠抗小鼠 CD8 抗体InvitrogenMCD0800免疫染色果蝇脑组织
兔抗 DsRed 抗体Clonetech632496免疫染色果蝇脑组织
小鼠抗 Brp 抗体发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）nc82免疫染色果蝇脑组织
与 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗大鼠 IgG 抗体InvitrogenA11006免疫染色果蝇脑组织
与 Alexa Fluor 546 偶联的山羊抗兔 IgG 抗体InvitrogenA11035免疫染色果蝇脑组织
与 Alexa Fluor 647 偶联的山羊抗小鼠 IgG 抗体InvitrogenA21236免疫染色果蝇脑组织
SlowFade gold 抗淬灭试剂Molecular ProbesS36936封片并防止荧光淬灭 
PYREX 9 孔玻璃培养皿Corning7220-85解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒World Precision InstrumentsSYLG184制备黑色 Sylgard 培养皿，以保护解剖镊子在脑组织解剖过程中的使用
活性炭Sigma-Aldrich242276-250G制备黑色 Sylgard 培养皿
Dumont #5 解剖镊Fine Science Tools11252-30解剖和封片果蝇脑组织
载玻片Corning2948-75x25封片果蝇脑组织
1.5 号盖玻片VWR International48366-205封片果蝇脑组织
指甲油本地供应商不可用密封盖玻片于载玻片上
培养箱 Kansin InstrumentsLTI603在 25 °C 下培养果蝇
（或其他供应商）
水浴锅Kansin InstrumentsWB212-B2在 37 °C 下诱导果蝇热激反应
（或其他供应商）
旋转摇床Kansin InstrumentsOS701清洗和免疫染色果蝇脑组织
（或其他供应商）
解剖显微镜LeicaEZ4分选、杂交和转移果蝇；解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织
共聚焦显微镜Zeiss（或其他供应商）LSM 700（或其他型号）成像 tsMARCM 克隆
图像处理软件 1
（例如，Zeiss LSM 图像浏览器） 		Zeiss不可用投影共聚焦图像的图层堆栈
图像处理软件 2
（例如，ImageJ） 		不可用不可用计数 tsMARCM 克隆的细胞数量

参考文献

  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

细胞谱系分析果蝇神经生物学Flippase表达共聚焦显微镜热激方案神经谱系定位嵌合标记系统遗传嵌合体
利用双色标记克隆分析系统进行细胞谱系追踪与基因功能研究
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。