方法文章

通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

DOI：

10.3791/55282

⸱

2017年1月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mathematical and Physical Sciences, Faculty of Science, Japan Women's University, 2Department of Bioorganization Research, Okazaki Institute for Integrative Bioscience, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of Life and Coordination-Complex Molecular Science, Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences, 4Research Center for Complex Systems Biology, The University of Tokyo

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

包含高度密集的微米级组分的巨大囊泡是有效的细胞模型。水包油乳液离心法是一种制备包封材料的巨大囊泡的简单而强大的工具。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

构建生物学与合成生物学在创造人工生命方面的研究，涉及自下而上地组装生物性或非生物性材料。这类方法在探索生命与非生命物质边界的研究中受到广泛关注，并在过去二十年中被用于构建人工细胞。其中，巨型囊泡（Giant Vesicles, GVs）常被用作人工细胞膜。本文描述了一种制备封装高密度微球的GVs的方法，作为含有高度浓缩生物大分子的细胞模型。GVs通过一种简单的油包水乳液离心法制备。具体而言，使用均质器将含有待封装物质的水溶液与溶解有磷脂的油相进行乳化，随后将所得乳液小心地铺在另一水溶液的表面。将该分层体系进行离心，从而生成GVs。该高效方法可用于封装从小分子到微球等多种物质。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

建构性或合成生物学方法为探索生命与非生命物质之间的界限提供了一条引人入胜的途径。由于细胞是目前我们所理解的生命所需的最小单位，许多研究人员尝试利用简单且已被充分理解的化学物质构建人工细胞，以便研究此类人工细胞内部发生的现象，其最终目标是阐明生命的起源，并探究活细胞的基本功能1,2,3。特别是由两亲性分子构成的球形微区室——囊泡4，因其能够包封蛋白质5,6和DNA7,8,9,10等生物分子，常被用作生物膜的模型。

囊泡可根据其大小分为小型（定义为直径<100 nm）、大型（直径<1 µm）和巨型（直径>1 µm）。巨型囊泡（GVs）因在尺寸、形态和结构上与活细胞相似而被广泛研究。由于GVs的尺寸较大，其膜的形态变化可在光学显微镜下实时直接观察。

已有多种制备GVs的方法被报道11，包括水合法12,13，冻融法14，电形成法15,16，以及微流控装置方法17,18然而，利用这些方法将蛋白质及其他大分子以高浓度包封到GVs中十分困难。特别是，要将生物材料包封至足够量（20–30 体积%）以模拟细胞内拥挤的环境，极具挑战性19,20为快速形成GVs，Weitz及其同事建立了一种水包油（w/o）乳液离心法。21,22该方法具有五个重要特征。第一，采用此方法制备的脂质体（GVs）具有较低的层状结构23,24，它们的膜非常薄，因此容易发生形变。已有研究探讨了FtsZ（一种细菌细胞分裂蛋白）、微管蛋白及其他大分子诱导的GV膜形变25,26,27,28，我们观察到微球封装诱导的GV膜出现类多面体形变29,30其次，膜蛋白可通过此方法插入囊泡膜中，尽管存在一定的难度。31例如，Yomo 研究组利用该方法研究了 体外 膜蛋白α-溶血素的合成及其成孔活性32第三，可以制备不对称的脂质体，其内层和外层脂质成分不同。22例如，Whittenton 等 在内层含有阳离子脂质以包封带负电荷的多核苷酸、在外层含有中性脂质以降低毒性和非特异性细胞摄取的不对称性GVs33第四，GVs 内部物质的浓度和体积分数可能相对较高28,34第五，可包载多种类型的材料35例如，Nishimura 等 包封的 体外 将转录-翻译系统导入GVs，并利用该系统在GVs内表达绿色荧光蛋白（GFP）36这五个特点使得无乳化离心法成为制备模拟细胞的巨型囊泡（GVs）不可或缺的方法。

在之前的研究中，通过离心生成的巨型囊泡（GV）通常使用带有长16 G不锈钢针头的注射器收集，针头内含部分终末水溶液22。对于经验不足的技术人员而言，该收集方法容易导致GV被部分油相污染。在本研究中，我们采用了由Yomo课题组开发的水包油（w/o）乳液离心法23,37，其中沉淀的GV通过离心管底部预先开设的小孔收集。我们制备了包封1.0 µm微球的GV，其尺寸与细胞内细胞器相近。使用微球可使我们通过计算其体积分数来估算其浓度。建立一种能够实现内含物高密度封装的GV制备方法，是构建人工细胞的重要步骤。为验证本方案对多种内含物的适用性，我们还证明绿色荧光蛋白（GFP）和一种小分子水溶性荧光染料（荧光素，uranine）均可被有效包封于GV中。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 通过水/油法准备GVs 乳液离心法

  1. 在氯仿中配制1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC，25 mM）的储备液和德克萨斯红1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺三乙基铵盐（Texas Red DHPE，0.20 mM）的储备液，并将储备液于-20 °C保存。
  2. 配制油相溶液。
    1. 将DOPC储备液（51.0 µl）与Texas Red DHPE储备液（19.2 µl）混合，置于5 ml玻璃小瓶内壁，在流动氮气下蒸发，形成脂质膜。
    2. 将脂质膜在减压条件下孵育过夜，然后向小瓶中加入1.0 ml液体石蜡（0.86–0.89 g/cm3）。用铝箔包裹小瓶，在80 °C静置孵育过夜。DOPC和Texas Red DHPE的最终浓度分别为1.3 mM和3.8 × 10−3 mM，DOPC与Texas Red DHPE的摩尔比为100:0.3。
  3. 配制内水相分散液。
    1. 在1.5 ml带盖微量离心管中，混合237.5 µl的1.0 µm非荧光微球分散液（2.5 vol%）与12.5 µl的1.0 µm荧光微球分散液（2.5 vol%）；该比例对应非荧光微球与荧光微球的体积比为95:5。
    2. 加入64 mg蔗糖，随后加入125 µl Tris缓冲液（TBS，1 M）和875 µl去离子水。微球的最终体积分数为0.5 vol%，Tris-HCl（pH 7.5）和蔗糖的最终浓度分别为0.1 M和0.15 M。
    3. 将微量离心管涡旋振荡30秒，随后超声处理10分钟。
  4. 配制外水相溶液。
    1. 按照与内水相相同的步骤配制10 ml Tris缓冲液（0.1 M Tris-HCl [pH 7.5]，0.15 M葡萄糖），取1 ml该溶液置于1.5 ml带盖微量离心管中。涡旋振荡30秒，随后超声处理10分钟。
  5. 配制含微球的水/油乳液。
    1. 在1.5 ml微量离心管中，将1 ml油相溶液（含DOPC和Texas Red DHPE的液体石蜡）与300 µl内水相溶液混合。
    2. 使用机械匀浆器（带有高速旋转刀片的搅拌器）在室温下以10,000 rpm处理2分钟，使两相在微量离心管中乳化。
  6. 沉淀GVs。
    1. 在1.5 ml带盖微量离心管中，将300 µl水/油乳液轻轻铺加在4 °C的1 ml外水相溶液上层。将微量离心管在4 °C冷却10分钟。
  7. 收集GVs。
    1. 冷却后立即以18,000 × g离心30分钟。用图钉刺穿微量离心管底部，收集一滴沉淀的GVs至无菌的1.5 ml微量离心管中。
    2. 若获得的GVs量过多导致观察困难，可用外水相溶液将沉淀的GV液滴稀释10–100倍（体积比）。

2. GVs 的显微镜观察

  1. 制备显微镜样本。
    1. 放置一个粘附式孵育室 原位 聚合酶链式反应和杂交（反应室尺寸为9 mm × 9 mm × 0.3 mm厚）在显微镜盖玻片上进行。
    2. 使用微量移液器，将25 µl稀释后的沉淀GVs滴加到样品区域，立即在孵育腔室上方放置另一块盖玻片（厚度约为0.15 mm）。
  2. 记录GVs的微分干涉相差显微镜图像。
    1. 使用显微镜（10X、20X 和 40X）记录囊泡的显微图像 配备12V100WHAL-L卤素灯的物镜）
  3. 进行荧光显微镜观察。
    1. 将 U-FBNA 和 U-FMCHE 荧光镜组单元插入显微镜中。为这些单元安装 470–495 纳米和565-585 nm 激发滤光片，以及透射 510-550 的发射滤光片 纳米米和600-690 nm 光，分别。

结果

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w/o 乳液离心法以照片和示意图形式展示于图1中。图1中的示意图表明，该方法成功的关键因素在于内层水相溶液的比重必须大于外层水相溶液的比重，以确保巨型囊泡（GVs）在离心过程中发生沉淀。此外，为了在水/油（w/o）界面形成脂质单层，乳液铺置于外层水相溶液后需将体系冷却10分钟。由于GVs是通过乳液液滴跨越w/o界面转移而形成的，因此内层与外层水相之间的渗透压必须相等。作为对照实验，我们还采用图1及步骤1.3所示流程制备了不含微球的GVs，唯一区别在于内层水相溶液中未添加微球。

离心后沉淀的GVs的收集过程如图2所示。除了微量管最底部的半透明相外，我们在外层水相中还观察到一层白色、浑浊的中间相（图2a）。该中间相富含微球和油的聚集体，而底部相则含有GVs。因此，在用图钉刺穿微量管底部（图2b）后，我们仅收集第一滴液体（图2c），其中含有大量GVs。需注意收集的液滴不得超过两滴；若收集更多液滴，可能混入微球和脂质的聚集体，从而导致GVs密度降低。所获得的囊泡分散液通常含有位于GVs外部的包封物质，因为GVs在离心过程中常发生破裂。为获得纯净的GVs，应根据包封物质的大小选择适当的分选方法，例如透析、凝胶过滤或荧光激活细胞分选。若后续实验需要，可使用外层水溶液对沉淀的GVs进行稀释。在某些情况下，中间相延伸至管底，表明所形成的任何囊泡均被油相包裹在一起。

我们获得了不含微球的GVs的微分干涉显微图像和荧光显微图像（图3a，3b），以及含微球的GVs的相应图像（图3c-3f）。与先前报道一致23,37，本实验方案生成的GVs具有较低的层状结构。实验中使用了与Texas Red DHPE偶联的脂质，该脂质可发出红色荧光，从而通过观察薄层膜直接确认囊泡的形成。在获得的160个GVs中，55个包裹了微球，105个为空囊泡，包裹率为34%。

我们通过以下方法确定了GVs中微球的体积分数（φ，vol %）。由于每个GV包含数十至数百个微球，在光学显微镜下计数所有微球具有挑战性。因此，我们将非荧光性1.0 µm微球与少量荧光微球混合，并在荧光显微镜下对荧光微球进行人工计数。封装微球的总数（N）通过将人工计数的荧光微球数量（n）乘以20计算得出（基于非荧光与荧光微球原始体积比为95:5 [v/v]）。然后通过公式Nv100/V估算φ值，其中v为微球体积，V为单个GV的体积。需要注意的是，由n推算N会产生计数误差，这些误差在计算φ时必须予以考虑。φ值由直接计算为20n的N得出，这导致φ 准确反映真实值的概率<50%。事实上，N在20n周围存在一定程度的波动，因此需将其视为20(n ± i)，其中i为n的误差。我们基于泊松分布估算了i，使得n ± i的概率超过50%。通过估算i，我们进一步计算了20(n ± i)，以及直径为10和15 µm的GVs包含计数误差的φ值（表1）。根据该方法，图3c所示GV中微球的体积分数估计为11 ±3 vol %。所计算体积分数的精度为10–30%。

我们的结果表明，已成功将1 μm的微球以高体积分数封装入GVs中。我们还使用相同的外部水溶液和相同方案，将其他材料封装进100 mol % DOPC GVs中（图4）。具体而言，含有0.1 µm微球的GVs是通过以下三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液制备的：其中包含0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 M蔗糖和0.5 vol %荧光微球，制备方法参照含1.0 µm微球的GVs的方案（图4a）。根据上述方案，还制备了含有GFP的DOPC GVs（0.1 M Tris-HCl [pH 7.5]、0.15 M蔗糖和100 µg/mL GFP；图4b）以及含有荧光素（uranine）的GVs（0.1 M Tris-HCl [pH 7.5]、0.15 M蔗糖和30 µM 荧光素；图4c）。

nNφ (10-µm 直径)φ (15-µm 直径)
360 ± 206.0 ± 2.01.8 ± 0.6
480 ± 208.0 ± 2.02.4 ± 0.6
5100 ± 2010 ± 23.0 ± 0.6
6120 ± 3012 ± 43.6 ± 1.2
10200 ± 3220 ± 35.9 ± 0.9
20400 ± 4540 ± 512 ± 2
30600 ± 55-18 ± 2
a 误差按文中所述方法确定；n = 手动计数的微球数量；N = 包埋微球的总数。

表1：微球的数量与体积分数（φ，vol%）a。a 误差计算方法见正文；n = 手动计数的微球数量；N = 包封的微球总数。

油水乳化过程示意图；通过离心技术形成囊泡分散液。
图1：水/油乳液离心法的流程图与示意图。（a）由DOPC和Texas Red DHPE（100:0.3 摩尔比）溶于液体石蜡组成的油相溶液。（b）由蔗糖和微球分散于Tris-HCl缓冲液中组成的内水相分散液。（c）由葡萄糖溶解于Tris-HCl缓冲液中组成的外水相溶液。（d）1 ml油相溶液与300 µl内水相分散液的混合物。（e）使用均质器进行乳化（10,000 rpm，2分钟）。（f）形成的水/油（w/o）乳液。（g）将300 µl乳液铺在1 ml外水相溶液上。（h）离心后立即沉淀的巨型囊泡（GVs）。（i）水/油乳液离心法原理的示意图。黑色箭头表示离心加速度的方向。请点击此处查看该图的放大版本。

微型离心管中的组织消化过程；样品提取；洗涤沉淀步骤。
图 2： 微型离心管穿刺操作。（a）离心后刚沉淀的 GV。红色椭圆标示出沉淀 GV 分散液的液滴（亦见图 1h）。（b）使用图钉穿刺微型离心管。通过用图钉在微型离心管底部附近穿孔，并从孔中收集液滴，获得含有 GV 的沉淀物。（c）用外部水溶液稀释后的沉淀 GV 分散液液滴（黄色箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

Microscopy images showing cell structures in various light conditions, fluorescence analysis.
图3： GVs 的显微镜图像。 (a微分干涉差显微镜下无微球的GV图像。GV的直径约为10 µm。比例尺 = 10 µm。b) 未添加微球的GV的荧光显微镜图像。红色荧光由Texas Red DHPE发出。c微分干涉差显微镜下含有微球的生发泡图像。d荧光显微镜图像显示生发泡（GV）内1.0 µm微球（YG羧基微球）。计数的荧光微球数量（n）为6。我们估算了误差（i = 2）基于泊松分布. 然后我们估算了内层微球的总数（N = 20 (n ±i)) 为 120 ± 40。据计算，GV 中含有体积分数为 1.0 µm 微球φ = Nv100/V约为 11 ± 3 体积% v 是微球的体积 V 是GVs的体积。eGV膜的荧光显微镜图像。红色荧光由Texas Red DHPE发出。f) 图中各面板图像的合并图 d 和 e. 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示细胞融合实验中荧光变化的显微镜图像、吸光度和发射。
图 4： 包封不同材料的GVs的微分干涉差显微镜与荧光显微镜图像。 包含（a）0.1 µm 微球、（b）GFP 和（c）荧光素的GVs的微分干涉差显微镜（上图）和荧光显微镜（下图）图像。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

内层水相分散介质与外层水相溶液的比重必须仔细选择。为了使水包油（w/o）乳液在离心过程中沉淀进入外层水相溶液，内层水相分散介质的比重必须大于外层水相溶液的比重。我们曾尝试使用不含糖类的内层和外层溶液来制备巨型囊泡（GVs），但在这些条件下未能获得GVs，因为内层水相溶液的质量不足以克服两相之间的界面阻力。如果两种溶液之间存在较大的渗透压差，沉淀进入外层水相溶液的GVs可能会发生收缩或破裂。因此，GVs内部与外部的渗透压必须相等。为实现这一点，我们在内层水相分散体系中使用蔗糖作为溶质，在外层水相溶液中使用葡萄糖作为溶质，且两种糖的浓度相同。盐22和糖23,35,38均已被用于此类目的，但通常更倾向于使用糖，因为其毒性较低且溶解度高于盐。然而，如果加入过多的糖，GVs可能接触到盖玻片底部并发生塌陷。有多种策略可避免这一问题。一种策略是减小内层与外层水相溶液之间的比重差异，使GVs在较温和的条件下沉淀；具体而言，可将沉淀后的GV分散液上清液置换为与内层水相溶液相同的溶液，以降低因浮力作用导致GV黏附于盖玻片而破裂的可能性。另一种策略是预先在两张盖玻片表面涂覆一层薄脂膜29。

正确制备和孵育乳液至关重要。我们使用液体石蜡来配制油相溶液。矿物油26,31、十二烷21,33和角鲨烷33,39也常被用作溶剂油。由于这些材料在比重、黏度和表面张力方面存在差异，即使采用相同的离心条件，形成的囊泡数量也会有所不同33。为了获得具有目标特性的囊泡，必须优化内水相和外水相溶液的比重与黏度，以及离心加速度。在配制油相时，必须在高温和干燥环境（如恒温培养箱或脱水器）中进行孵育。在本研究中，我们将液体石蜡加热至80 °C，以充分溶解脂质分子。此外，乳液应现用现配，并立即进行离心处理，因为乳液在刚制备后不稳定，水包油（w/o）液滴容易相互融合。乳液可通过超声、涡旋振荡或轻敲的方式大量制备。然而，使用均质器可快速制备大量乳液，并更易于在高黏度油中实现乳化。将乳液轻柔且迅速地铺加到外水相溶液上，随后在4 °C下冷却，这一点也十分重要。为缩短乳化与离心之间的时间间隔，可在乳液铺加前将油相-外水相系统预先冷却，之后立即对整个系统进行离心。若观察到白色浑浊出现的速度比正常情况更快或更慢，必须彻底冲洗机械均质器，以去除残留的清洁洗涤剂。此外，在乳化前，油溶液、内水相溶液和乳化剂均需恢复至室温。

适当的离心加速度也非常重要。通过在18,000 × g 条件下离心，我们能够制备出内部包封单一物质且浓度较高的GVs。当需要包封多种物质时，最好降低离心加速度。例如，一种包封了七种化合物的肌动蛋白组装系统，可在低于350 × g 的离心条件下实现35。在不宜使用离心的情况下，可通过调节糖浓度或在自身质量作用下使乳液沉淀来获得GVs38,40,41。

本文报道的方法存在两个主要局限性。其一是油分子（本实验中为石蜡）可能溶解于GV膜中，这一点已被Weitz研究组指出21。当需要将膜蛋白插入GV膜时，必须考虑共存油分子对蛋白的影响。另一个局限性是体积分数的变异。在本研究中，我们估算GV内微球的体积分数范围为4–30 vol%；该体积分数与制备GV时所用内水相溶液的体积分数并不相同。尽管我们能够以足够高、可用于显微镜观察的体积分数将微球包封于GV中，但该方法不适用于制备具有均匀体积分数分布的GV。已有文献报道，微球体积分数的分布在离心过程中会发生变化34。

水包油（w/o）乳液离心法常用于制备包封有物质的巨型囊泡（GVs）。然而，关于包封微米级材料的GVs的制备，相关报道较少34,42。最近，已有研究构建出包含包封DNA装置或分子装置的分子机器人43,44。对于此类应用，具有区室结构的GVs是首选；因此，诸如我们所介绍的这类可用于包封磁性微球以及具有不同表面功能化的微球的技术，预计将具有重要应用价值44。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢山口智子绘制了图1中的示意图。本研究得到了日本自然科学研究机构（NINS）冈崎统合生物科学研究所冈崎ORION项目的支持；得到了NINS天体生物学中心项目（编号AB281010）的支持；得到了日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究中心研究费补助金（“为实现综合功能的生物分子系统的动态有序化”，编号25102008）的支持；得到了JSPS青年科学家研究费补助金（B类）（KK，编号15K17850）的支持；以及得到了JSPS研究活动启动补助金（YN，编号15H06653）的支持。此外，本研究还获得了野口研究所资助项目、花王艺术与科学基金会资助项目以及久保田水与环境基金会资助项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂：
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti Polar Lipids850375C囊泡膜分子
德克萨斯红 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，三乙基铵盐（Texas Red DHPE）Thermo Fisher ScientificT1395MP
1 M Tris-HCl（pH 7.5）Nippon Gene Co.318-90225缓冲液
D(+)-葡萄糖Wako Pure Chemical Industries049-31165用于外部水溶液
蔗糖Wako Pure Chemical Industries196-00015用于内部水溶液
Polybead 羧基微球 1.0 µmPolysciences08226-15非荧光性，2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG 羧基微球 1.0 µmPolysciences15702-10荧光性，2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG 羧基微球 0.10 µmPolysciences16662-10荧光性，2R = 0.10 µm
荧光素钠盐（荧光黄）Sigma Aldrich JapanF6377-100G
GFP 标准品（重组）Vector LaboratoriesMB-0752
名称公司目录编号备注
设备：
Centrifuge 5427REppendorf 5409000233离心机转子：FA-45-48-11
PhyscotronMicrotec Co.NS-310EIII便携式微型匀浆器
发生器轴Microtec Co.NS-4匀浆器附件
用于原位PCR 和杂交的 Frame-Seal 孵育室Bio-Rad LaboratoriesSLF0201杂交室体积：25 µL
室尺寸：9 × 9 × 0.3 mm
用于原位PCR 和杂交的 Frame-Seal 孵育室Bio-Rad LaboratoriesSLF0601杂交室体积：65 µL          
室尺寸：15 × 15 × 0.3 mm
Microman EGilsonFD10006用于粘稠液体的移液器。我们使用该仪器测量液体石蜡。
倒置显微镜Olympus Co.IX73
镜组单元Olympus Co.U-FBNA激发滤光片：470 - 495 nm
发射滤光片：510 - 550 nm
镜组单元Olympus Co.U-FMCHE激发滤光片：565 - 585 nm
发射滤光片：600 - 690 nm

参考文献

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