用于免疫分析的三维纸质微流控装置的制备

摘要

我们详细介绍了一种用于构建基于纸张的三维微流控装置的方法，该装置可用于免疫测定的开发。我们的装置组装方法属于一种多层增材制造技术。我们展示了夹心免疫测定法，以提供此类基于纸张的装置的代表性结果。

摘要

由于毛细作用，纸张能够自主输送液体。通过在纸张上构建疏水性屏障图案，可在纸层内控制并引导液体的传输。此外，将多层带有图案的纸张堆叠起来，可形成复杂的三维微流控网络，从而支持分析和生物分析检测方法的开发。基于纸张的微流控装置成本低廉、便于携带、操作简便，且无需外部设备即可运行。因此，这类装置作为即时诊断（point-of-care diagnostics）平台具有广阔的应用前景。为了准确评估基于纸张的装置的实用性及其分析性能，必须建立适当的方法，以确保其制造过程具有可重复性，并能够适应实验室环境下的规模化需求。本文描述了一种用于制备适用于纸基免疫分析的通用装置结构的方法。我们采用一种增材制造技术（多层覆膜）来制备包含多层图案化纸张和图案化粘合剂的装置。除了展示如何正确使用这些三维纸基微流控装置进行人绒毛膜促性腺激素（hCG）免疫分析外，本文还讨论了制造过程中可能导致装置失效的常见错误。我们预期，这种纸基装置的制造方法将在针对资源有限环境设计的分析应用开发中发挥广泛的用途。

引言

纸张具有多种配方或等级，来源广泛，可通过功能化处理调节其性能，并能通过毛细作用或芯吸作用自主运输液体。若使用疏水性物质（例如，光刻胶¹ 或石蜡²）对纸张进行图案化处理，则可在纸层内实现对液体芯吸过程的空间控制。例如，施加的水相样品可被引导进入多个不同区域，与预先固定在纸张中的化学或生物化学试剂发生反应。这些基于纸张的微流控装置已被证明是开发便携式、低成本分析检测方法的有效平台^3,4,5,6,7。基于纸张的微流控装置的应用包括现场即时诊断⁸、环境污染物监测⁹、假药识别¹⁰，以及在资源有限环境中实现分散化医疗（或"远程医疗"）¹¹。

多层图案化纸张可组装成一体化装置，其中相邻层（即 上层或下层）的亲水区域相互连接，形成连续的....

方案

1. 基于纸张的微流控装置层的制备

1. 使用图形设计软件程序制备纸张、尼龙和粘合剂各层的图案。⁶ 每一层可具有不同的图案。
   注意：图案可包含对齐孔，这些对齐孔对于基于纸张的免疫测定功能并非必需，但有助于三维装置的可重复制造。若装置以单个、条带或整张形式组装，这些孔的位置将有所不同。用于设计图案的软件程序可能因图案化技术的选择（例如，光刻、蜡印或切割）而异。⁶
2. 用70%（v/v）乙醇水溶液喷洒工作区域，并用洁净的纸巾擦拭工作区域。

2. 试纸层的制备：样本添加、结合物储存、孵育和洗涤层

1. 使用大型台式纸张切割机准备定量滤纸的层片。将一整张纸裁剪为标准纸张尺寸，以便使用固体墨（蜡）打印机进行图案化。例如，一张 460 × 570 mm² 的纸张可裁剪为 4 张美标信纸（8.5 × 11 英寸²）。操作纸张时应始终佩戴洁净手套，以尽量减少污染。
2. 将裁好的层析纸装入打印机纸盒中。打印预先设计好的图层（见图 1）。
   注意：可通过自动进纸直接将图案打印到该纸张上。每次仅打印一张纸，以避免卡纸。所有图层均应使用"增强"打印设置。

结果

在三维纸质微流控装置中获得可重复的检测性能，依赖于一种能够确保装置间一致性的制造方法。为实现这一目标，我们确定了若干制造工艺和材料选择因素，并在此以纸质免疫检测的演示为例进行讨论。我们采用蜡印法在纸质微流控装置内形成疏水屏障（图 2A）²。该方法理想之处在于仅依赖广泛可用的办公设备，操作步骤极少，且无需使用可能干扰蛋白质吸附或改变纸纤维润湿性的化学试剂（例如，光刻胶）。此外，蜡印法可产生具有可重复尺寸的流体通道，这对于实现性能和反应时间可重复的检测至关重要。在形成疏水屏障后，通过在各层上施加粘性薄膜以促进三维装置的组装（图 2B）。免疫检测所需的所有试剂均可在将粘合膜贴附到某一层背面之后进行添加（图 2C）。该步骤在学术实验室的制造流程中具有实用价值，因为可同时平行制备多个装置。当装置的所有层堆叠并热压粘合后，免疫检测装置的组装即告完成（图 2D）。随后加入样品以启动检测。.......

讨论

确定一种可重复的制造策略是检测方法开发中的关键环节。²² 我们采用逐层叠加的顺序方法来制造基于纸张的三维微流控装置。与那些通过折叠或折纸技术从单张纸制备多层装置的方法相比^23,24，增材制造具有多项优势：（i）可在不改变各层打印、对准或组装方法的前提下，将多种材料整合到单一装置结构中。（ii）可在组装过程中集成图案化压敏胶膜。这些胶膜用于固定相邻层，并且根据胶粘剂强度的不同，可实现可逆粘接，从而便于剥离并观察内部层结构。此外，胶粘剂为三维装置提供了结构完整性，因而无需使用粘合剂²⁵、夹具或机械加工外壳。²³（iii）单张美标A4色谱纸可容纳大量重复样本阵列，显著提高实验室规模制造的通量（图5）。当需要评估多种实验条件并进行技术重复时，这一优势尤为显著。通过该方法，可同时制备70个三维纸基微流控装置。（iv）类似的多层覆膜技术已广泛应用于医疗领域多.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Illustrator CC	Adobe		用于设计纸张和粘合剂层的图案
Xerox ColorQube 8580 打印机	Amazon	B00R92C9DI	用于将蜡图案打印到纸张和尼龙层上
Isotemp 通用加热干燥箱	Fisher Scientific	15-103-0509	用于将蜡熔入纸张
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	用于辅助各层的对齐
Apache AL13P 覆膜机	Amazon	B00AXHSZU2	用于将各层压合在一起
Graphtec CE6000 切割绘图仪	Graphtec America	CE6000-40	用于制作粘合膜的图案
Swingline 纸张裁切机	Amazon	B0006VNY4C	用于裁切纸张或器件
Epson Perfection V500 照片扫描仪	Amazon	B000VG4AY0	用于扫描读出层的图像
经济型钳式打孔器	McMaster-Carr	3488A9	用于去除对齐孔
Whatman 色谱纸，4号	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand 色谱纸（厚型）	Fisher Scientific	05-714-4	用作吸附层
Immunodyne ABC（0.45 µm 孔径）	Pall Corporation	NBCHI3R	用作捕获层材料
可移除/永久性双面胶带衬纸	FLEXcon	DF021621	便于剥离操作
永久性双面胶带衬纸	FLEXcon	DF051521
蜡质衬纸	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	辅助粘合剂图案化
丙烯酸板	McMaster-Carr	8560K266	用于制作框架
自粘性保护片	Fellowes	CRC52215	用作保护滑片
无水乙醇	VWR	89125-172	用于消毒工作区域
牛血清白蛋白	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG 尿液对照品	Fisher Scientific	22-071-066	用作阳性和阴性样本
抗-β-hCG 单克隆抗体胶体金结合物（克隆1）	Arista Biologicals	CGBCG-0701	用于处理结合层
山羊抗-α-hCG 抗体	Arista Biologicals	ABACG-0500	用于处理捕获层
10X 磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid 脱脂奶粉	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147