三维纸基微流体装置的制造用于免疫分析

摘要

我们详细介绍的方法来制造三维纸基微流体装置用于在免疫测定的开发使用。我们对设备组装方式是一种多层，添加剂制造。我们展示了一个夹心免疫提供对这些类型的纸张为基础的设备的代表性结果。

摘要

纸中自主灯芯流体由于毛细管作用。通过用疏水性障碍图案的纸张，流体输送可以控制和一层纸内定向。此外，堆叠构图纸的多层创建复杂的三维微流体网络可以支持的分析和生物分析测定法的发展。纸基微流体装置是便宜的，携带方便，易于使用，并且不需要外部设备进行操作。其结果是，他们拥有巨大潜力，作为点的护理诊断的平台。为了正确评价的效用和纸为基础的设备的分析性能，必须开发合适的方法，以确保它们的制造是可重复的，并在一个尺度适合于实验室环境。在这个手稿中，一种方法来制造，可以用于纸基免疫测定一般器件结构进行说明。我们使用添加剂manufacturin的一种形式克（多层层压）来制备构成图案的纸张和图案化粘合剂的多层器件。除了演示正确使用这些三维纸基微流体装置与人绒毛膜促性腺激素（hCG）的免疫测定，在制造过程中的错误可能导致设备故障进行了讨论。我们预计这种方法制造的纸张为基础的设备会发现专门针对资源有限的设置旨在分析应用的广泛的实用性。

引言

纸是广泛使用的范围内的制剂或等级，可以官能化以调整其性能，并且可以通过毛细作用或芯吸自主地输送流体。如果纸是用疏水物质图案化（ 例如 ，光致抗蚀剂¹或蜡^2），流体的芯吸可以在空间上的纸层内的控制。例如，所施加的含水样品可以定向成许多不同的区，以与存储在纸内的化学和生化试剂反应。这些纸基微流体装置已被证明是用于便携式和廉价的分析测定^{3，4，5，6，7}的发展有用的平台。纸基微流体装置的应用包括点的护理诊断EF"> 8，环境污染物⁹的监测，检测假药^10，和离域医疗（或"远程医疗"）的有限资源设置^11。

构图纸的多个层可被组装成一个集成装置，其中来自相邻层（ 即 ，高于或低于）亲水区连接，以形成连续的流体网络，其入口和出口可联接或左独立。 ¹²每一层可以包括一个唯一的图案，使试剂和多个测定的空间分离在单个设备上执行。所得三维微流体装置，不仅能够芯吸流体，以使分析测定的（ 例如 ，肝功能试验¹³和小分子¹⁴的电化学检测），但它也可以SUP端口一些复杂的功能（ 例如 ，阀门¹⁵和简单机械^16）常见的传统微的方法。重要的是，因为纸灯芯通过毛细作用流体，这些设备可以从用户最小的努力工作。

因为试剂可以存储在纸基装置的三维结构中，复杂的协议可以减少到单一的加入含水样品到设备。最近，我们介绍了可用于使用蜡印技术来创建图案化层纸质免疫发展的一般三维器件结构。 ^17，18，这些研究主要集中在与层叠的层的设备号的设计方面是如何使用的，组合物的层，并且该三维微流体网络控制的总体％的图案免疫测定的性能。最终，我们能够利用这些设计规则，以促进一个多路复用免疫测定¹⁹的快速发展。在此手稿，人类绒毛膜促性腺激素（hCG;怀孕激素）一个先前开发的免疫测定¹⁷被用作一个例子来说明，我们已对三维纸基免疫测定的装配和制造开发的策略。因此，我们专注于一个设备，而不是化验开发的组装和操作。

在夹心免疫测定，这是一种用于检测hCG的，特定于激素的一个亚基涂覆到固体基质中，然后被阻止，以限制一个样品或任何后续的试剂的非特异性吸附捕获抗体的格式。该基板是最经常的聚苯乙烯微孔板（ 例如 ，酶联免疫吸附测定或ELISA）。然后将样品加入到孔中，温育一段时间。严谨洗涤后，特定的hCG的另一亚基的抗体并使其孵育。该检测抗体可以产生可测量的信号缀合的胶体粒子，酶，或荧光团。该井再次解释的测定的结果（ 例如 ，使用读板器）之前洗涤。而商业试剂盒依靠这种耗时多步过程中，所有这些步骤都可以迅速地在纸基微流体装置以最少的干预来的用户执行。

用于hCG的免疫测定的装置，包括六个有源层，其是，从顶部到底部，用于样品此外，共轭存储，孵化，捕获，洗涤和印迹（ 图1）。试样添加层从定性滤纸制成。它有利于引入液体样品的和保护试剂在缀合物Laye的ř从由用户环境或意外接触污染。缀合物层（定性滤纸）持有用于免疫测定的色剂（ 例如 ，胶体金标记的抗体）。孵化层（定性滤纸）允许样品到纸平面内横向行进到达下一个层，捕获层之前促进与试剂的分析物的结合。所述捕获层（尼龙膜）含有特异性吸附到材料被分析物的配体。在测定完成后，该层显露以使完成的免疫复合体的可视化。洗涤层（定性滤纸）绘制过量液体，包括自由共轭试剂从脸部的捕获层的入印迹层（厚色谱纸）的距离。六层设备是由图案化的，双面粘合剂的五层保持在一起:永久性粘合剂的四层保持ASSEM的完整性放血装置以及可移除的粘合剂的一层便于剥离装置的检查捕获层上的免疫测定的结果。

对于本手稿的目的，我们使用的hCG仅阴性和阳性对照样品（0 MIU / mL和81 MIU /毫升，分别），以提供一纸基免疫分析，其允许之间的关系的一个专门讨论的代表性结果制造方法和设备的性能。除了演示如何制造设备的成功，我们强调的几个制造误差，可能导致设备或不可重复测定结果的失败。在这个手稿详细的协议，并讨论将提供有价值的洞察纸质免疫是如何设计和制造的研究人员。虽然我们集中我们的免疫证明，我们预计这里提出的指导方针将是三地扪制造广泛有用简称AE，下同纸基微流体装置。

方案

1.基于纸张的微流体器件层的制备

1. 准备用于使用图形设计软件程序的纸张，尼龙，和粘合剂层的图案。 ⁶每个层可以具有不同的图案。
   注:该图案可以包括被不需要的官能纸质免疫对准孔，但与三维器件的重现性制造协助。如果设备是单独组装，成条，或作为全片这些孔的位置会有所不同。用于设计图形的软件程序可能基于图案化技术（ 例如 ，光刻，蜡染，或切割）的选择。 ⁶
2. 用的70％（体积/体积）乙醇和水的溶液喷雾的工作区。用干净纸巾的工作区。

2.纸层的制备:样品增量，共轭寄存，孵化，洗层

1. 准备使用大型台式切纸机定性滤纸的层。切股票纸上成标准的纸张尺寸使用固体油墨（蜡）打印机，以方便构图。例如，一个460点¯x570毫米²片可以让4张美书纸（8.5 x 11英寸^2）。在任何时候都处理好与干净的手套纸，以减少污染。
2. 装入层析纸的单页纸进打印机纸盒。打印先前设计层（参见图1）。
   注:图案可以直接印刷在使用自动进这个表。只有一张纸应在同一时间内打印，以避免卡纸。对于所有图层，使用"增强"打印设置。

3.尼龙薄膜层的制备:捕获层

1. 削减库存辊尼龙膜的成用台式裁纸刀片（7.5×10英寸^2）。在处理尼龙采取非常谨慎，膜，以保持它的完整性，并防止撕裂。存放在干燥器柜未使用的材料，如尼龙膜是湿气敏感。
   注:单页纸比美国Letter纸张窄。因为尼龙膜是薄且脆弱的，它们不能由打印机直接处理和要求的支持。细节将在下面讨论。
2. 使用蜡打印机，打印捕获层图案到一张复印纸，并将其粘在光盒以作为尼龙膜的定位的导向。光盒有助于多个层的对准。
3. 将复印纸丢球到复印纸的先前打印纸。胶带纸灯箱丢球，但不要带两片在一起。
4. 尼龙膜的裁切纸放置到一块干净的复印纸。确保膜覆盖复印纸的底层的印刷区域。用胶带将尼龙膜四边的丢球的复印纸。
   注意:确保尼龙膜的平整，光滑，以便有与印刷（ 如卡纸或蜡的印刷不均匀），没有任何问题。蜡可以其中尼龙膜附连到复印纸在磁带上进行打印。如果发生这种情况，由于胶带覆盖，其中的尼龙是不完全的图案化的区域应被丢弃。对于未来的制剂，较大的尼龙膜件可以用来避免这种打印错误。
5. 装入尼龙膜（贴吧复印纸支持）的薄片装入手动进纸打印机纸盒。在同一时间只能打印一张尼龙膜。
   注:对于印迹层不需要准备步骤，因为它是没有图案。

4.创建印刷层的疏水性障碍

1. 胶带印刷层到用于放置在重力对流烘箱时甚至上方和层下加热丙烯酸类帧。请贴在尼龙膜复印纸的支撑片，直到蜡之后被熔化并形成疏水屏障。
   注:丙烯酸帧是一个特制的，激光切割件的1/2。"正在制作中使用依赖于设备的数量厚的丙烯酸塑料两帧尺寸较小的框架外的边境措施11 5/8" ×2 3/4"，帧的内孔测量10 3/8"×1 3/4"。所述更大的帧的外边缘测量11 5/8"×8 7/8"，和内框架的孔测量10 1/4"×7 7/8"，开放式，内部空间允许甚至通过纸的整个厚度熔化蜡。
2. 放置在烤箱的层在150℃，30秒，直到蜡熔化到纸的厚度。确认该蜡已通过翻转，并检查在设计缺陷渗透的纸的厚度。
   注:强制空气炉或热板，也可以使用以熔化固体蜡油墨。熔倍或温度可能取决于加热方法而变化。
3. 从亚克力相架取出纸张和尼龙膜。此外，从复印纸的支持纸取出尼龙膜。

5.准备粘合层的

1. 先前准备使用机器人的刀绘图仪胶膜，用设计文件的模式双面纸（步骤1.1）。使用保护蜡衬垫纸外露粘合剂表面。
   注:双面粘合剂应当具有孔，其允许样品通过层作为连续流体通路流来图案化。蜡衬垫易于从粘合剂去除，并用于在切割过程中，以保护它免受污染和撕裂。激光切割机或模具压也可被用来粘接膜的图案层。

6.背衬胶粘剂器件层

1. 喷雾用的​​70％（体积/体积）乙醇和水的溶液中的光盒。用干净的纸巾擦拭ŧowel。
2. 胶带纸或尼龙膜图案层，需要用粘合剂备份到与印刷面朝下的灯箱。
3. 果皮从粘合剂的图案化片材保护性衬里的一侧，它固定到纸或尼龙膜上的层。使用灯箱，确保图案正确对齐。按在一起。放置部分组装设备进入一个保护滑移。
   注:保护滑是通过确保他们不接触层压辊免受污染或损坏设备层压薄膜后盾一张折叠。
4. 通过将得到的两层组件通过自动层压到完全按下粘合剂和纸张一起从邻接层除去空气中的任口袋。
   注:设备层之间的气穴可以与设备的完整性，并导致泄漏排汗重复性干扰。

7.共轭升治疗艾尔与试剂免疫此前器件大会

1. 胶带缀合物层上的丙烯酸类帧，使得要被处理的亲水性区域与框架接触暂停，而不是。
2. 在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入2.5微升100毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）与缀合物层上的亲水区。允许其在室温下干燥2分钟，然后在65℃下5分钟。
   注意:此卷是刚好足以润湿纸的区域。的BSA溶液有助于防止在干燥过程中的胶态纳米颗粒的聚集，这将有利于纳米颗粒的释放时的纸张和试剂通过样品再水化。
3. 添加5微升5外径胶体金纳米颗粒缀合到抗β-hCG的抗体，并重复干燥过程。
   注:胶态金纳米颗粒的浓度的单位通常表示为如通过ABSO测量的光密度（OD）rbance在λ= 540纳米。没有治疗需要在第10装置装配前灯芯垫。

8.横向通道的治疗试剂免疫此前器件大会

1. 胶带横向沟道层上的丙烯酸类帧，使得要被处理的亲水性区域与框架接触暂停，而不是。
2. 添加10微升阻断剂的（5毫克/毫升脱脂奶粉和0.1％（体积/体积）Tween 20的1×PBS中）来治疗的横向通道。重复相同的干燥处理（在室温下2分钟，然后在65℃，5分钟）作为共轭层。

9.试剂免疫此前器件大会捕获层的治疗

1. 胶带捕获层上的丙烯酸类帧，使得要被处理的亲水性区域与框架接触暂停，而不是。
2. 以1毫克/毫升的抗α-hCG的抗体5μL的治疗捕获层然后允许样品在室温下干燥2分钟，接着8分钟，在65℃。
3. 添加阻断剂的2液（5毫克/毫升脱脂奶粉和0.1％（体积/体积）Tween 20的1×PBS）中。重复干燥过程的捕获层。
   注:该量是合适的涂层不阻断尼龙膜，也使用多阻断剂时，可发生的孔中的论文。

基于纸张的10.大会三维微流体装置

1. 大盘洗层灯箱（朝上打印面）。如果使用的定位孔，使用手持打孔工具后续层将其删除。
2. 在捕获层的背面的保护膜，露出粘性。对齐用的定位孔作为引导洗涤层之上的捕获层。按两层在一起。避免接触的亲水区，以尽量减少污染或损坏设备。镊子可以用于协助assembLY。
3. 在孵化层的背面去除保护膜以暴露出粘合剂。对齐捕获层之上的孵化层，然后按在一起。继续以这种方式添加的层，直到所有的有源层被组装。
4. 放置部分组装设备插入保护滑，坚决加盖层使用层压在一起。
5. 在洗涤层的背面去除保护膜和印迹层固定到该装置的底部。重复层叠步骤10.4完成三维纸基微流体装置的组装。切期望数目从条带或用剪刀完全组装设备的薄片的设备。
   注:设备的完整片材，设备的条带，或单一的装置可使用类似的方法来制备。

11.执行基于纸张的免疫

1. 加入20μl的样品的亲水区在装置的顶部（ 即 ，叔他品尝层）。
2. 等待样品完全芯吸进入设备，则（在1×磷酸盐缓冲盐水0.05％体积/体积的吐温20）中添加15微升洗涤缓冲液中。洗涤缓冲液的第一等分试样完全邪恶到设备后，加入洗涤缓冲液的第二个15微升等分试样。
   注意:洗涤缓冲液具有完全恶成当液滴已经消失，显示在纸张的表面上没有凹凸的设备。该试验完成时，洗涤缓冲液的第二个等分试样已经完全进入该设备。
3. 揭示该测定的结果，使用镊子以暴露捕获层剥离设备的三个顶层。
   1. 定性通过观察颜色的存在或不存在解释该测定的结果。可替代地，图像用台式扫描仪和使用图像处理软件或算法来量化结果和内表征强度的分布的读出层检测区域。 ²⁰

结果

在三维纸基微流体装置获得可再现的测定性能依赖于确保设备之间的一致性的制造方法。为了实现这一目标，我们已经确定了一些制造工艺和材料方面的考虑，并在展示纸质免疫的情况下在这里他们讨论。我们使用的蜡印刷方法，以形成纸基微流体装置（ 图2A）内的疏水性的障碍。 ²此方法是理想的，因为它仅依赖于广泛使用的办公设备，需要最少的程序步骤来完成的，并且不要求使用可能与蛋白质吸附干扰或改变纸纤维的润湿性的化学物质（ 例如 ，光致抗蚀剂）的。此外，蜡印生产的流体通路与可重复的尺寸，这是至关重要的可重复的表演和持续时间TI试验MES。形成疏水性障碍后，粘合剂片材施加到层，以促进三维设备（ 图2B）的组装。用于免疫测定所需要的任何试剂可粘合膜被加入到层（ 图2C）的背面之后施加。因为许多装置可以并行制备该程序是用于在学术实验室制造工艺是有用的。之后的器件的所有层被堆叠并层压在一起（ 图2D）完成用...

讨论

确定一个可重复的制造策略是试验发展的一个重要组成部分。 ²²我们使用顺序，层-层的方法来制造三维纸基微流体装置。相反那些适用折叠或折纸技术来产生从纸²³的单个片材的多层器件的方法^，24添加剂制造提供了许多优点:（ⅰ）多材料可以并入到单个设备架构无需修改方法印刷，对齐，或层的装配。 （二）图案化粘合膜可以集成到组装过程。这些膜粘贴相邻层，并且，基于所述粘合剂的强度，可以是可逆的，以使剥离和内部层的评估。此外，粘合剂提供结构完整性的3维器件，这就排除了需要为粘结剂²⁵剪辑或加工的外壳。 ^23（ⅲ）美国信纸色谱纸的各个片材可以容纳重复的阵列，从而可大大提高实验室规模制造的吞吐量（ 图5）。评估需要技术重复无数实验条件时，这是特别有益的。通过这种方式，70三维纸基装置可以同时制备。 （ⅳ）类似的多层层压方法被用于众多的商业产品的高产量制造医疗（ ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Illustrator CC	Adobe		为纸张层和胶粘剂设计图案
Xerox ColorQube 8580 打印机	Amazon	B00R92C9DI	将蜡质模型打印到纸张层和尼龙
Isotemp 通用加热和干燥箱	Fisher Scientific	15-103-0509	将蜡融化到纸张中
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	协助对齐各层
Apache AL13P 层压机	Amazon	B00AXHSZU2	将各层层压在一起
Graphtec CE6000 刻字机	Graphtec America	CE6000-40	用于图案胶膜
Swingline 切纸机	Amazon	B0006VNY4C	切割纸张或设备
Epson Perfection V500 照片扫描仪	Amazon	B000VG4AY0	扫描读出层
经济钳式打孔	机McMaster-Carr	3488A9	，以去除对齐孔
Whatman 色谱纸，4 级	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand 色谱纸（厚）	Fisher Scientific	05-714-4	用作印迹层
Immunodyne ABC （0.45 µm 孔径 ）	颇尔公司	NBCHI3R	用作捕获层的材料
可移除/永久胶粘剂 - 双面衬垫	FLEXcon	DF021621	便于剥离
永久胶粘剂 双面衬垫	FLEXcon	DF051521
蜡衬垫	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW 衬垫	，用于协助丙烯酸胶粘剂图案化
板材	McMaster-Carr	8560K266	制造框架
自粘片	Fellowes	CRC52215	用作保护滑
无水乙醇	VWR	89125-172	对工作区域进行消毒
血清白蛋白	AMRESCO	0332
积水诊断 OSOM hCG 尿液质控品	Fisher Scientific	22-071-066	用作阳性和阴性样品
抗 β;-hCG 单克隆抗体胶体金偶联物（克隆 1）	Arista Biologicals	CGBCG-0701	治疗偶联层
山羊抗 α;-hCG 抗体	Arista Biologicals	ABACG-0500	处理捕获层
10X 磷酸盐缓冲盐水	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid 脱脂奶粉	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147