本文介绍了一种利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）雄性交配驱动力来研究动机行为的实验方法。通过该方法，研究人员可结合先进的果蝇神经遗传学技术，揭示调控此类动机行为的遗传、分子和细胞机制。
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本文内容
摘要
摘要
尽管经过数十年的研究，动机状态的神经与分子基础仍不明确。我们近期开发了一种新颖、简化且可扩展的系统，用于深入研究雄性黑腹果蝇（Drosophila melanogaster (Drosophila)）的求偶动机，本文详细描述了该系统的实验方法。该行为范式基于以下发现：雄性果蝇的求偶动机随着多次交配导致的生育力下降而降低，并在约3天内逐渐恢复。在此系统中，果蝇强大的神经遗传学工具与性行为相关的基因可及性及潜在的神经连接图谱相结合，使得研究人员能够快速分离并研究具有特定动机功能的小型神经元群体。本文详细介绍了用于测量和调控雄性果蝇求偶动机的饱足实验（satiety assay）的设计与操作流程。利用该实验，我们还证明了通过激活多巴胺能神经元可克服雄性果蝇低水平的求偶动机。该饱足实验操作简便、成本低廉，且不易受遗传背景差异的影响。我们预期该实验将为动机状态的神经生物学机制带来大量新的见解。
引言
对黑腹果蝇（Drosophila）的研究已深入且开创性地揭示了多种生物学现象，包括基因的本质1、胚胎发育的基本原理2、昼夜节律3，以及神经系统的发育与神经环路的连接机制4,5,6。然而，相较于这些现象，动机行为的研究仍远未充分，这或许源于迄今所采用研究体系的局限性。果蝇的动机行为主要在饥饿背景下进行研究，但由于果蝇每次摄食的食量极微，且其外骨骼阻碍了脂肪沉积的外部观察，因此该研究面临诸多挑战。因此，有必要拓展用于研究果蝇动机行为的实验体系。
我们描述了一种用于研究黑腹果蝇（Drosophila）交配驱动力的行为学研究框架。该系统利用了果蝇中成熟的神经遗传学工具，以及其性别二态性神经环路在实验上的可及性7,8,9,10,
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方案
注意：本实验方案描述了二维饱食性实验的制备（第1-3节）、实施（第4节）和分析（第4节）。随后，以多巴胺能刺激为例，第5节展示了如何将热遗传学刺激与二维饱食性实验相结合以诱导雄性果蝇的性欲亢进。第6节描述了验证二维饱食性实验结果的三种方法。最后，第7节展示了如何测量雄性果蝇交配欲望的恢复情况。
1. 制备8孔和32孔行为实验装置
注意：每个行为实验区域由多层激光切割的塑料片组成，四角通过六角螺丝和手拧螺母固定（图1A）。
- 制作竞技场的各层结构。使用激光切割机将亚克力塑料板切割成适当形状以制作每一层（参见 图1B，1C 用于产品）。
注意：许多研究机构的机械加工车间或创客空间都配备有激光切割机。如果所在机构可使用激光切割机，请继续执行以下步骤；否则，请改按步骤 1.2 中的说明进行操作。- 对于每一层，在激光切割机的软件中打开设计图案。
注意：设计图可在相应命名的 PDF 文件中找到（例如, 8通道腔室 - 第2层 - 门.pdf）见补充材料1。该文件还包含有关所用塑料类型的注释（例如，1/8 英寸（即 3.175 毫米）透明亚克力板。每一层的确切厚度并不关键，主要要求是确保腔室中留有 0.12 英寸....
- 对于每一层，在激光切割机的软件中打开设计图案。
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结果
为了表征 果蝇 交配驱动力，使用3日龄的野生型Canton-S雄蝇在二维饱食实验中进行测试。在实验过程中（4.5小时），雄蝇平均交配次数为4.8 ± 0.3次（均值 ± 均值标准误，SEM）。交配行为主要发生在前2小时内（占78%）（图6A，6B）并且随着检测的进行而变得越来越少图6A，6B）。这种减少并非由于缺乏交配对象（在整个实验过程中，74%的雌性保持未交配状态）或体力疲劳所致（图6F）。相反，这种效应可能是由于在检测过程中雄性求偶行为的减少所致，从 42.6 ±8.0%（均值 ±SEM）（1st h）到非交配时间的 2.0 ± 0.7%（均值 ± 标准误）（最后一小时）图6C）。当雄性在求偶行为实验中与新的雌性进行测试时，也观察到求偶行为的下降。图6D、6E，且在雄性与雌性隔离 3 d 后恢复图6G，6H这些结果表明，雄性果.......
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讨论
动机状态可以被满足、维持和恢复34。我们提出了一种二维饱足实验方法，能够快速且稳健地测量果蝇交配驱动力的上述各个方面。该实验方法为利用先进的果蝇遗传操作技术来研究动机行为的分子和神经环路机制提供了可能。
饱食度检测依赖于雄性果蝇成功求偶和交配，并在适当时间终止交配的能力。尽管性欲低下（hyposexual）的果蝇求偶行为较少，但求偶水平低的果蝇并不一定属于性欲低下；例如，它们可能难以识别或追踪雌性35。因此，饱食度检测最适合用于检测性欲亢进（hypersexuality）表型，而这种表型在标准求偶检测中难以可靠观察，因为未经交配的野生型雄性求偶指数接近1。在饱食度检测中，性欲亢进应相对于雄性果蝇的年龄来评估——根据我们的经验，较年长的雄性交配频率往往略高于本实验所用的3日龄雄性。
我们利用多巴胺能神经元的热遗传学刺激，来示范在此系统中可用于研究动机相关组分的神经遗传学操控方法。此外，研究人员还可以在整个二维饱食实验过程中使用热遗传学.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Mike Crickmore、Dragana Rogulja 和 Michelle Frank 对手稿提出的建议。Pavel Gorelik 为行为实验装置的制造提供了技术支持。本研究在 Mike Crickmore 实验室完成，并得到 Whitehall 基金会资助（主要研究者：Dragana Rogulja）。S.X.Z. 是哈佛医学院 Stuart H.Q. 与 Victoria Quan 奖学金研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/16 英寸透明亚克力 | McMaster-Carr | 8589K12 | 用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。 |
| 1/8 英寸透明亚克力 | McMaster-Carr | 8589K42 | 用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。 |
| 3/16 英寸透明亚克力 | McMaster-Carr | 8560K219 | 用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。 |
| 1/32 英寸黑色聚甲醛（Delrin） | McMaster-Carr | 8575K132 | 用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。 |
| 六角螺钉，1 英寸长（50个） | McMaster-Carr | 92314A115 | 用于制作实验区域。32腔实验装置可改用3/4英寸螺钉（92314A113，McMaster-Carr）。 |
| 手拧螺母（25个） | McMaster-Carr | 92741A100 | 用于制作实验区域。可用普通六角螺母（90480A005，McMaster-Carr）替代。 |
| 摄像机 | Canon | Vixia HF R700 | 可用任何消费级摄像机替代。 |
参考文献
- Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
- Hall, J. C.
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