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方法文章

测量与调控雄性交配驱动力 黑腹果蝇

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DOI：

10.3791/55291

⸱

2017年2月15日

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）雄性交配驱动力来研究动机行为的实验方法。通过该方法，研究人员可结合先进的果蝇神经遗传学技术，揭示调控此类动机行为的遗传、分子和细胞机制。

摘要

尽管经过数十年的研究，动机状态的神经与分子基础仍不明确。我们近期开发了一种新颖、简化且可扩展的系统，用于深入研究雄性黑腹果蝇（Drosophila melanogaster (Drosophila)）的求偶动机，本文详细描述了该系统的实验方法。该行为范式基于以下发现：雄性果蝇的求偶动机随着多次交配导致的生育力下降而降低，并在约3天内逐渐恢复。在此系统中，果蝇强大的神经遗传学工具与性行为相关的基因可及性及潜在的神经连接图谱相结合，使得研究人员能够快速分离并研究具有特定动机功能的小型神经元群体。本文详细介绍了用于测量和调控雄性果蝇求偶动机的饱足实验（satiety assay）的设计与操作流程。利用该实验，我们还证明了通过激活多巴胺能神经元可克服雄性果蝇低水平的求偶动机。该饱足实验操作简便、成本低廉，且不易受遗传背景差异的影响。我们预期该实验将为动机状态的神经生物学机制带来大量新的见解。

引言

对黑腹果蝇（Drosophila）的研究已深入且开创性地揭示了多种生物学现象，包括基因的本质1、胚胎发育的基本原理2、昼夜节律3，以及神经系统的发育与神经环路的连接机制4,5,6。然而，相较于这些现象，动机行为的研究仍远未充分，这或许源于迄今所采用研究体系的局限性。果蝇的动机行为主要在饥饿背景下进行研究，但由于果蝇每次摄食的食量极微，且其外骨骼阻碍了脂肪沉积的外部观察，因此该研究面临诸多挑战。因此，有必要拓展用于研究果蝇动机行为的实验体系。

我们描述了一种用于研究黑腹果蝇（Drosophila）交配驱动力的行为学研究框架。该系统利用了果蝇中成熟的神经遗传学工具，以及其性别二态性神经环路在实验上的可及性7,8,9,10,11,12和潜在的连接组信息8,13。此外，调控求偶行为的大部分先天14,15,16,17,18,19,20,21和后天学习22,23,24的感-运动神经环路已被详细解析，为精确定位动机作用的神经环路节点提供了难得的机会。我们近期报道了在果蝇中，如同在人类中一样，多巴胺水平在交配驱动力中起核心作用25,26,27。我们已实现了对果蝇中相关多巴胺生成和接收神经元的遗传操控，从而可利用本文所述的检测方法，对该保守现象在分子和神经环路水平上进行深入分析25。

我们将行为学实验添加到张 等25 一种新的平面行为实验装置，可实现视频评分，我们称之为二维（2-D）饱足检测法，是对以往方法的重要改进。因此，新检测法更具可扩展性和可量化性，更适合用于筛选与动机相关基因和神经元的遗传学研究。我们结合求偶行为检测和神经遗传学操控手段，利用这一新检测方法，展示如何测量并调控果蝇的交配驱动力。

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方案

注意：本实验方案描述了二维饱食性实验的制备（第1-3节）、实施（第4节）和分析（第4节）。随后，以多巴胺能刺激为例，第5节展示了如何将热遗传学刺激与二维饱食性实验相结合以诱导雄性果蝇的性欲亢进。第6节描述了验证二维饱食性实验结果的三种方法。最后，第7节展示了如何测量雄性果蝇交配欲望的恢复情况。

1. 制备8孔和32孔行为实验装置

注意：每个行为实验区域由多层激光切割的塑料片组成，四角通过六角螺丝和手拧螺母固定（图1A）。

  1. 制作竞技场的各层结构。使用激光切割机将亚克力塑料板切割成适当形状以制作每一层（参见 图1B，1C 用于产品）。
    注意：许多研究机构的机械加工车间或创客空间都配备有激光切割机。如果所在机构可使用激光切割机，请继续执行以下步骤；否则，请改按步骤 1.2 中的说明进行操作。
    1. 对于每一层，在激光切割机的软件中打开设计图案。
      注意：设计图可在相应命名的 PDF 文件中找到（例如, 8通道腔室 - 第2层 - 门.pdf）见补充材料1。该文件还包含有关所用塑料类型的注释（例如，1/8 英寸（即 3.175 毫米）透明亚克力板。每一层的确切厚度并不关键，主要要求是确保腔室中留有 0.12 英寸（3 毫米）或更大的自由垂直空间。
    2. 调整激光设置（功率、焦距， 等等。）以确定所用塑料的类型和厚度。将塑料放入激光切割机的切割床中，并运行激光切割机。
      注意：这些参数设置会因激光切割机型号及其激光强度的不同而有显著差异。应根据以往经验或通过在废弃塑料上进行测试切割来确定合适的设置。设计中包含较深的六边形凹槽，用于容纳六角螺丝的头部。这一设计可实现单手拧紧蝶形螺母，并使实验区域在台面上平稳放置（避免螺丝头突出）。然而，使用激光切割机制作较深的凹槽通常难以实现且耗时较长。此步骤为可选步骤，跳过不会影响行为学实验结果。
    3. 切割门框时（第2层， 图1A），同时使用适当的激光设置来刻蚀设计中包含的腔室编号（如 图1B，1C).
  2. 在线激光切割加工服务商处下单，上传8室和/或32室 arena 的全部PDF设计文件，并注明材料类型（例如，1/8 英寸（即 3.175 毫米）透明亚克力，依据文件中的注释。结果将显示如下 图1B （8室实验区）和 1C （32室实验区）
  3. 使用四个六角螺丝和四个手拧螺母将塑料层对齐并固定在一起，组装实验区域（图1A）。实验区域将显示如下所示 图1D，1E （8孔）和 图1F，1G （32孔）
    注意：食物壁（第4层在 图1A仅用于二维饱食实验，而在求偶行为实验所用的32室实验装置中则省略。

2. 二维饱腹感实验的食物制备

注意：由于二维饱食实验持续4.5小时，实验区域内需使用果蝇食物以提供营养和水分。本方案采用常规的玉米粉-琼脂果蝇食物，但不限于该配方。

  1. 使用第3至第6层部分组装二维饱食行为实验装置（8室型），并用手指螺母和六角螺丝拧紧固定（层结构分配见图1A）。
  2. 将新鲜果蝇食物放入一个洁净、可微波加热的瓶子中。加入适量水，以刚好覆盖瓶底表面为宜（图2A）。
  3. 高火微波加热30至45秒。每隔15秒检查一次加热进度并搅拌，直至食物完全融化（图2B）。注意！果蝇食物容易沸腾溢出。
  4. 使用钝头的1,000-µL移液器吸头（图2C），缓慢将约1 mL融化的食物转移至每个腔室中（图2D）。
  5. 将食物在4 °C条件下重新凝固约10分钟（图2E），然后完成整个装置的组装（图2F）。
  6. 使用组装完成的装置进行实验（见第4节），或将其存放于4 °C环境中。
  7. 将剩余食物储存于4 °C环境中，可重复使用。

3. 行为实验用处女雌蝇的准备

注意：二维饱食实验需要大量处女雌蝇（每个完整行为实验装置约需 120 - 160 只），而使用常规方法难以收集到足够数量。本节介绍一种替代方法，利用位于 Y 染色体上的 hs-hid 转基因28，该方法已成功应用于求偶行为实验25,29。用于产生白眼处女雌蝇的果蝇品系基因型为 w1118(X)/hs-hid(Y);+/+;+/+（Bloomington 品系编号 24638）。

  1. 当20 - 50%的蛹已羽化（见图3A示例）且有足够的雄蝇（5 - 10只）用于维持品系时，将果蝇转移至新培养瓶中。
  2. 将原始培养瓶置于37 °C的热水浴中热激1小时，以充分激活hs-hid从而杀死雄蝇（图3B）。热激后，这些培养瓶中仅雌蝇会羽化，因此在实验前可保持处女状态。
    注意：确保培养瓶各面均匀受热（见图3A中的水位线）。若1小时不足以完全杀死所有雄蝇，可将热激时间延长至最多2小时。
  3. 实验前至少将收集的雌蝇隔离饲养3天，以确保其年龄足够并具备性接受能力25,29。
    注意：该品系偶尔会产生无Y染色体的雄蝇。这些雄蝇具有白眼，且因不携带hs-hid转基因而不受热激影响。它们无法产生精子，因此不会降低雌蝇的性接受能力30,31。

4. 进行并评分二维饱腹感检测

注意：控制雄蝇的年龄非常重要，因为交配欲望会随年龄而变化。本方案使用3 - 4天龄的雄蝇25。

  1. 将培养箱设置为所需的温度（例如，23 °C 用于标准条件和室温实验）以及湿度（>30%）。对于无湿度控制功能的培养箱，箱内放置一杯水即可满足要求。
  2. 将二维饱食行为检测装置放入培养箱中平衡约30分钟，以使温度达到平衡，并防止实验过程中检测腔内产生冷凝。旋转门应保持在打开位置。
  3. 使用果蝇吸管器32 将15至20只未交配雌性个体吸入每个实验区域的腔室中（图4).
    注意：雌性和雄性果蝇不应在实验当天进行麻醉。根据我们的经验，若在同一天麻醉，可能会影响雌性的交配接受度和雄性的交配行为。
  4. 将1只雄性吸入每个腔室中。
  5. 将装有样本的实验区域置于培养箱内，并在标准的民用摄像机下进行拍摄图5）并曝光 4.5 小时。
  6. 通过记录每只雄性果蝇开始和结束每次交配的时间来对视频进行评分（即 交配）。此步骤在初期可能较为耗时。经过练习后，可将视频以5倍速或更高速度进行评分。
    注意：果蝇在约 23 °C 下交配时间约为 20 分钟（在较高温度下持续时间较短）29，可以浏览每次交配的前15分钟。
  7. 记录所有交配时间后，统计每只果蝇的交配次数（参见代表性结果）。
  8. 使用提供的代码生成行为谱图。有关代码、操作说明和示例数据，请参见补充材料2。
  9. 使用 CO2 或使用低温麻醉果蝇，然后将其移除。

5. 利用热遗传学操控在二维饱腹感检测中逆转饱腹状态

注意：本方案用于检测对特定神经元群体进行热遗传学刺激是否能够克服饱食状态。实验果蝇在特定神经元群体中表达热敏感型阳离子通道 TrpA1（UAS-TrpA1）。以下步骤适用于多巴胺能神经元（TH-Gal4）的刺激，已有研究表明此类神经元可促进交配驱动力25。这些步骤也可与其他神经元特异性驱动子联合使用，以发现其他能够促进交配驱动力的神经元群体。

  1. 为了在已饱食的果蝇中通过热遗传学方法诱导交配行为，在完成完整的4.5小时二维饱食实验后，将培养箱的温度升高（例如，从23 °C升至28.5 °C）。
  2. 当培养箱达到目标温度后，继续进行1小时的热刺激，并记录雄蝇的交配行为（即交配行为）（见代表性结果）。
    注意：刺激的温度和持续时间可能因基因型而异，因此有必要优化实验条件，以避免神经元过度激活，同时仍能产生显著的表型。

6. 利用求偶行为和运动能力验证饱食状态

注意：本节介绍可用于验证二维饱腹实验结果的三种可选方法。这些方法并非每次实验所必需。

  1. 利用求偶行为实验验证饱食状态。
    1. 将一只雄性果蝇和一只处女雌性果蝇分别吸入交配行为观测装置的32个腔室中。
    2. 使用标准的消费级摄像机对果蝇进行约20分钟的录像。
    3. 评分求偶指数（CI）以量化求偶行为25；这是指执行求偶行为（如鸣唱、跟随）所花费的时间比例， 等等）以及交配（即 在5分钟的时间窗口内记录交配行为。该时间窗口从首次出现求偶行为时开始计算。如果雄性果蝇在前15分钟内未开始求偶，则其求偶指数（CI）为0。未经训练的野生型（WT）果蝇的CI应大于0.9，而完全饱食的果蝇CI应低于0.2。也可考虑其他求偶相关指标23,33.
  2. 二维饱腹状态交配行为评分检测
    1. 记录雄性果蝇在2-D饱食实验的时间段内用于求偶的时间量例如，第一个小时）。求偶行为定义为雄性执行仪式中的任何步骤（鸣唱、跟随、 等等。）。与第6.1.3节不同，此步骤不包括雄性交配所花费的时间。
    2. 将上述求偶时间除以雄性未交配的总时间即 在同一时间段内未交配的时间。例如，如果一只雄性果蝇在第一小时内求偶15分钟，交配20分钟，则比值为15分钟 / (60分钟 - 20分钟) = 0.375。该比值表示为 "求偶过程中非交配时间的比例" 在代表性结果中。
  3. 利用运动能力检测评估疲劳程度
    1. 将32室实验区的各个部件（对比板除外）进行部分组装。
    2. 将一只雄蝇（不要雌蝇）吸入交配行为观测装置的32个腔室中，每个腔室各一只。
    3. 使用标准的消费级摄像机对果蝇进行约10分钟的录像。
    4. 使用 ImageJ 中的 MTrack2 插件（http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html）追踪果蝇。

7. 二维饱食实验后恢复交配驱动力

  1. 按照第4节所述进行二维饱食实验，但在实验结束时吸出雄性果蝇。
  2. 将雄性果蝇在23 °C下隔离培养所需天数。
  3. 对回收的雄性果蝇进行二维饱食实验，并仅在1小时内记录其交配行为（即 交配次数）（见代表性结果）。

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结果

为了表征 果蝇 交配驱动力，使用3日龄的野生型Canton-S雄蝇在二维饱食实验中进行测试。在实验过程中（4.5小时），雄蝇平均交配次数为4.8 ± 0.3次（均值 ± 均值标准误，SEM）。交配行为主要发生在前2小时内（占78%）（图6A，6B）并且随着检测的进行而变得越来越少图6A，6B）。这种减少并非由于缺乏交配对象（在整个实验过程中，74%的雌性保持未交配状态）或体力疲劳所致（图6F）。相反，这种效应可能是由于在检测过程中雄性求偶行为的减少所致，从 42.6 ±8.0%（均值 ±SEM）（1st h）到非交配时间的 2.0 ± 0.7%（均值 ± 标准误）（最后一小时）图6C）。当雄性在求偶行为实验中与新的雌性进行测试时，也观察到求偶行为的下降。图6D、6E，且在雄性与雌性隔离 3 d 后恢复图6G，6H这些结果表明，雄性果...

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讨论

动机状态可以被满足、维持和恢复34。我们提出了一种二维饱足实验方法，能够快速且稳健地测量果蝇交配驱动力的上述各个方面。该实验方法为利用先进的果蝇遗传操作技术来研究动机行为的分子和神经环路机制提供了可能。

饱食度检测依赖于雄性果蝇成功求偶和交配，并在适当时间终止交配的能力。尽管性欲低下（hyposexual）的果蝇求偶行为较少，但求偶水平低的果蝇并不一定属于性欲低下；例如，它们可能难以识别或追踪雌性35。因此，饱食度检测最适合用于检测性欲亢进（hypersexuality）表型，而这种表型在标准求偶检测中难以可靠观察，因为未经交配的野生型雄性求偶指数接近1。在饱食度检测中，性欲亢进应相对于雄性果蝇的年龄来评估——根据我们的经验，较年长的雄性交配频率往往略高于本实验所用的3日龄雄性。

我们利用多巴胺能神经元的热遗传学刺激，来示范在此系统中可用于研究动机相关组分的神经遗传学操控方法。此外，研究人员还可以在整个二维饱食实验过程中使用热遗传学...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Mike Crickmore、Dragana Rogulja 和 Michelle Frank 对手稿提出的建议。Pavel Gorelik 为行为实验装置的制造提供了技术支持。本研究在 Mike Crickmore 实验室完成，并得到 Whitehall 基金会资助（主要研究者：Dragana Rogulja）。S.X.Z. 是哈佛医学院 Stuart H.Q. 与 Victoria Quan 奖学金研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1/16 英寸透明亚克力McMaster-Carr8589K12用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。
1/8 英寸透明亚克力McMaster-Carr8589K42用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。
3/16 英寸透明亚克力McMaster-Carr8560K219用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。
1/32 英寸黑色聚甲醛（Delrin）McMaster-Carr8575K132用于制作实验区域；实验设计详见补充材料1。
六角螺钉，1 英寸长（50个）McMaster-Carr92314A115 用于制作实验区域。32腔实验装置可改用3/4英寸螺钉（92314A113，McMaster-Carr）。
手拧螺母（25个）McMaster-Carr92741A100用于制作实验区域。可用普通六角螺母（90480A005，McMaster-Carr）替代。
摄像机CanonVixia HF R700可用任何消费级摄像机替代。

参考文献

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