此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内 系统结合基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码电压指示剂（GEVI），该指示剂在目标细胞类型中特异性表达。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述的实验方案旨在使研究人员能够在不改变细胞所处环境完整性的情况下研究细胞间通讯。具体而言，这些方案被开发用于分析可兴奋细胞（如脊髓神经元）的电活动。在这种情况下，不仅需要保持脊髓细胞的完整性，还需要维持相关系统的解剖结构和生理形态。事实上，对神经系统及其他复杂系统工作方式的理解必须基于系统性的研究方法。因此，本研究选用活体斑马鱼胚胎作为模型系统，在不干扰胚胎生理条件的前提下，检测脊髓神经元膜电位的变化。
此处描述了一种结合使用斑马鱼胚胎与基于FRET的生物传感器的方法。斑马鱼胚胎具有极为简化的神经系统，且由于其通透性高，非常适合成像应用，可在斑马鱼发育过程中对细胞质膜上的基于荧光的电压指示剂进行检测。这两种组分的协同作用使得能够在不干扰生理状态的情况下，对完整活体生物中的细胞电活动进行分析。最后，这种非侵入性方法可与其他分析手段共存例如， 自发运动记录（如图所示）。
引言
体内系统组分分析使科学家能够以最可靠的方式研究细胞行为。当所研究的活动在很大程度上受到细胞间相互作用（包括依赖接触和非接触依赖的方式）影响时，这一点尤为正确，例如在神经系统中，膜电位的变化驱动着可兴奋细胞之间的通讯。理解这些电信号所编码的信息，是揭示神经系统在生理和疾病状态下工作机制的关键。
为了在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究细胞的电学特性，近年来已开发出多种基因编码的电压指示剂1与前几代光学电压传感器（主要是电压敏感性染料）不同2，GEVIs 能够实现 体内 对完整神经系统的分析，且其表达可局限于特定的细胞类型或细胞群。
斑马鱼胚胎是利用基因编码电压指示剂（GEVI）巨大潜力的首选体内 "底物"。事实上，由于其良好的光学通透性以及结构相对简单但进化上保守的神经系统，斑马鱼模型能够直接识别和操控神经网络中的每一个细胞组分。例如，基于FRET的GEVI探针Mermaid3的应用，已在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的斑马鱼模型中成功识别出运动神经元在症状出现前的行为异常4。
以下体内实验方案描述了如何在完整斑马鱼胚胎中监测特异性表达于神经元的Mermaid标记的脊髓运动神经元的电学特性。此外，该方案还展示了药理学诱导的电学特性变化如何与胚胎自发性卷曲频率的改变相关联，后者是斑马鱼在发育极早期阶段运动行为的典型特征性运动活动。
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方案
1. pHuC_Mermaid 质粒的构建
注意：Mermaid 是一种生物传感器，通过将海鞘（Ciona intestinalis，现为 Ciona robusta）的电压感应磷酸酶（Ci-VSP）中的电压感应结构域（VSD）5 与FRET荧光蛋白对Umi-Kinoko Green（mUKG：供体）和一种单体形式的橙色荧光蛋白Kusabira Orange（mKOk：受体）配对而构建。该生物传感器中，由细胞膜去极化诱导的VSD结构域构象变化会增加供体与受体荧光蛋白之间的空间接近性，从而增强两者之间的能量转移（即提高FRET比率）3。VSD可确保该生物传感器高效定位于细胞质膜。通过将Mermaid的开放阅读框（ORF）克隆至斑马鱼泛神经元启动子HuC的下游，可实现该生物传感器在神经元中的表达（在脊髓中，信号可在中间神经元和运动神经元中均被检测到）6。
- 使用 T3 Universal 引物和 Mermaid SmaI 引物（5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA），以 Pfu（校对）DNA 聚合酶通过聚合酶链式反应（PCR）从 pCS4+ Mermaid 质粒3 中扩增 Mermaid ORF，以便在 Mermaid ORF 上游插入一个 SmaI 限制性酶切位点。
- 使用以下 PCR 混合物：0.5 µL Pfu DNA 聚合酶，7.5 µL 特异性 10x 缓冲液，1 µL 10 mM dNTPs，2.5 µL 二甲基亚砜（DMSO），0.5 µL（50 ng）质粒样品，以及每种引物的 20 µM 储备液各 1 µL，总体积为 50 µL。
- 将 PCR 混合物在 95 °C 下加热 15 秒，50 °C 下退火 15 秒，72 °C 下延伸 4 分钟，共进行 35 个循环。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对特异的平末端 PCR 产物进行凝胶纯化。
- 按照制造商的说明书，将 DNA 片段克隆至 pCMV-SC 平末端载体中。
- 使用 SmaI 限制性内切酶线性化 Mermaid 阳性质粒（命名为 pCMV-SC_Mermaid），以便后续插入 HuC 启动子。
- 设置如下限制性酶切反应：0.5 µL（10 U）SmaI 限制性内切酶，2 µL 试剂盒提供的 10x 缓冲液，以及 5 µg 质粒 DNA，总体积为 20 µL。在 25 °C 下孵育反应 1 小时。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对酶切后的质粒进行凝胶纯化。
- 以 Pfu DNA 聚合酶和斑马鱼基因组 DNA 为模板，使用一对 HuC 特异性引物（HuCprom-forw1_SalI：5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA 和 HuCprom-rev1：5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG），通过 PCR 扩增 HuC 启动子（pHuC），扩增区域为 ATG 起始密码子上游 3,150 bp 的片段。
- 按照以下方案配制 PCR 混合物：0.5 µL Pfu DNA 聚合酶，7.5 µL 特异性 10x 缓冲液，1 µL 10 mM dNTPs，2.5 µL DMSO，200 ng 基因组 DNA，以及每种引物的 20 µM 储备液各 1 µL，总体积为 50 µL。
- 先在 95 °C 下预变性 2 分钟，随后在 95 °C 下变性 15 秒，50 °C 下退火 15 秒，72 °C 下延伸 4 分钟，共进行 35 个循环。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对特异的平末端 PCR 产物进行凝胶纯化。
- 将纯化的 pCMV-SC_Mermaid（步骤 1.5）和 pHuC DNA（步骤 1.7）等摩尔混合，加入 1 µL T4 DNA 连接酶和 1 µL 特异性 10X 缓冲液，总体积为 10 µL，于 4 °C 孵育 16 小时。
- 按照制造商的说明，取 5 µL 连接反应产物（步骤 1.8）转化感受态细胞。
- 通过 SalI-EcoRV 双酶切筛选启动子正确插入方向的 pHuC 阳性克隆（pHuC_Mermaid）（SalI 限制性酶切位点已在步骤 1.6 中插入启动子片段上游，而 EcoRV 限制性酶切位点位于 pCMV-SC 质粒的多聚腺苷酸化区域 PolyA 的下游）。
- 设置如下限制性酶切反应：SalI 和 EcoRV 限制性内切酶各 0.5 µL（10 U），2 µL 试剂盒 10X 缓冲液，以及 1 µg pHuC_Mermaid DNA，总体积为 20 µL。在 37 °C 下孵育 1 小时，将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。
2. 胚胎显微注射
- 使用塑料移液管将从野生型（AB品系）或Sod1-G93R成年斑马鱼4获得的受精卵转移至直径10 mm的培养皿中。
- 用冷（4 °C）鱼水冲洗胚胎，并立即使用显微注射仪将200 pg的pHuC_Mermaid质粒注射到卵黄中（关于显微注射操作的总体及详细描述，请参见参考文献7和8）。
- 使用塑料移液管将胚胎转移至培养皿中，置于28 °C鱼水中孵育，直至达到后续分析所需的发育阶段（受精后20–24小时，hpf）。
3. 自发性尾部卷曲分析
注意：在20-24小时受精龄（hpf）的胚胎中，评估其在有或无药物利鲁唑处理下自发的尾部卷曲行为。
- 将胚胎转移至一个盛有含0.2% DMSO（利鲁唑溶剂）鱼水的90 mm圆形培养皿中，使用尖头镊子手动去除卵膜。将胚胎孵育5分钟。
- 在体视显微镜下用数字相机进行1分钟视频录制，于室温下检测尾部卷曲行为。以每秒30帧的时间分辨率采集时间序列图像。
- 通过计算单位时间内弯曲次数（包括对侧和同侧弯曲），确定自发性尾部卷曲的频率。
- 为评估药物利鲁唑的作用，用塑料巴斯德吸管轻轻将胚胎转移至另一个盛有含5 µM利鲁唑鱼水的90 mm培养皿中。
- 孵育胚胎5分钟后，录制1分钟视频，并按上述方法进行行为分析。
4. 活体胚胎中Mermaid生物传感器成像的实验设置：供体与受体信号的同步检测
- 将受精后20-24小时的胚胎置于35 mm玻璃底成像培养皿中，用37 °C的鱼水中含1%低熔点琼脂糖进行包埋。将胚胎侧向放置。待琼脂糖在室温下凝固后即可。
- 将成像培养皿转移至倒置共聚焦显微镜的载物台上。使用20倍物镜（数值孔径0.7，NA），通过488 nm氩离子激光激发mUKG，并采集495至525 nm范围内的发射光，以鉴定表达生物传感器的运动神经元。
- 进行FRET测量时，使用488 nm激光线激发FRET对中的供体mUKG。同时，采用以8,000 Hz频率在双向模式下运行的共振扫描器，检测供体发射的荧光（495–525 nm）以及受体mKOk发射的荧光（550–650 nm，FRET通道）。如有条件，可使用473 nm激光。
注意：供体的激发效率会略有降低（使用473 nm激光线时为85%，而使用488 nm时为93%），但受体的交叉激发也会相应减少（使用488 nm激光线时为17%，而使用473 nm时降至9%）。 - 为减少光毒性和荧光染料漂白，应通过降低激光线功率（在 光束路径窗口 采集软件的
- 优化激发参数，以匹配实验开始时设定并在整个实验过程中保持恒定的增益和偏移参数。设置偏移时，将图像颜色转换为强度值（使用Q伪彩查找表），在激光关闭的情况下进行扫描，调节偏移旋钮（smart offset），使背景像素的强度略高于零。使用相同的查找表，在扫描时打开激光，调节增益旋钮（smart gain），以最大化信噪比，同时注意避免像素信号饱和。
- 使用开放的针孔（2个艾里单位），采集16位图像，以提供足够的动态范围用于定量分析。避免使用平均化，以提高采集速度并最小化光漂白。
- 在软件采集窗口中，从下拉菜单选择512 × 64像素的图像视野大小（像素尺寸：605 nm）。
- 从采集模式窗口中选择 xyt （单个xy平面的时间推移）f从下拉菜单中选择，通过获取单个xy平面来记录胚胎脊髓神经元电压的变化，设置采集参数为每30 ms记录一幅图像，持续1分钟。
- 为评估利鲁唑给药对同一神经元膜去极化的影响，在加入含5 µM利鲁唑的鱼水后5分钟，采集一组新的数据。
- 用于FRET分析时，使用ImageJ宏Biosensor_FRET（用于表达单链FRET生物传感器）。
- 在时间 t 评估每个神经元的基底膜 FRET 比值1 其中FRET效率计算公式为((FRET均值 - FRET背景值)/(供体均值 - 供体背景值))，FRET均值和供体均值分别为在围绕细胞所划定的同一感兴趣区域（ROI）内，针对各采集通道计算得到的平均荧光强度；FRET背景值和供体背景值则为在视野中无荧光样品区域的感兴趣区域（ROI）内计算得到的平均荧光强度。
注意：有关该插件使用的详细逐步说明，可参见 www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret 网站 - 使用绘图软件比较不同实验范式下去极化频率、振幅和持续时间的差异。采用非配对 t 检验比较两组间差异。 t- 当 P < 0.05 时，检验并认为平均值之间具有统计学差异 <0.05.
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结果
通过显微注射法，将携带基于FRET的Mermaid生物传感器编码序列的表达载体导入单细胞受精卵中，该载体受pHuC全神经元启动子调控，可在神经系统中特异性驱动蛋白合成，从而获得瞬时转基因胚胎（图1， 左图）。掌握显微注射技术后，Mermaid阳性胚胎的比例接近100%。在这些胚胎中，仅选择在细胞膜上表达适量Mermaid生物传感器的个体用于FRET分析/图像采集。
自发性卷曲是一种仅由全身收缩组成的运动反应，表现为尾尖卷向头部9,10，在受精后20-24小时（hpf）阶段的常规鱼类培养液中记录到（图1，中间图面板及视频1），在5 µM利鲁唑孵育后也进行了记录（视频2）。...
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讨论
本文所述方案使我们能够探究斑马鱼胚胎脊髓运动神经元的电学特性与自发卷曲行为之间的关联。自发卷曲行为是胚胎发育过程中最早出现的刻板运动活动，约在胚胎发育17小时（hpf）时出现，并持续至24小时（hpf）10。
我们的方法为研究人员提供了一种工具，用于研究完整胚胎的神经系统，充分保留了发育中的功能性网络内细胞间相互作用的复杂性。体内成像斑马鱼胚胎的操作仅需将其浸入低熔点琼脂糖中固定即可完成。利用生物传感器研究细胞膜电位变化是该方法的主要优势之一。传统的电生理学方法需要通过去除包被组织来直接接触神经元11，这类操作可能会改变被检测细胞的电学特性。此外，基于FRET的生物传感器方法可在无需使用麻醉剂（例如，三卡因，一种钠通道阻滞剂）的情况下研究细胞的电学特性，从而避免了化学物质（例如 本实验中使用的利鲁唑）给药可能带来的干扰，这在实验设计中可能至关重要。该方法使我们能够专注于调控自发性尾部卷曲行为的电活动及其频率，而这种行为反应在大多数情况...
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
作者谨向 Simona Rodighiero 致以诚挚感谢，感谢她在 FRET 成像分析中提供的宝贵支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| 利鲁唑 | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA 聚合酶 | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 通用引物 | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统 | Promega | A9280 | |
| 通用 SmaI 引物 | Eurofins | ||
| StrataClone 哺乳动物表达载体系统 / pCMV-SC 平端载体 | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm 玻璃底成像培养皿 | Ibidi | 81151 | |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | M10 F | |
| 数码相机 | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 软件 | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player，版本 10.4 | Apple | ||
| 共聚焦显微镜（倒置） | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 显微注射仪 | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ 宏 Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
参考文献
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- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
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