此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内 系统结合基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码电压指示剂（GEVI），该指示剂在目标细胞类型中特异性表达。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述的实验方案旨在使研究人员能够在不改变细胞所处环境完整性的情况下研究细胞间通讯。具体而言，这些方案被开发用于分析可兴奋细胞（如脊髓神经元）的电活动。在这种情况下，不仅需要保持脊髓细胞的完整性，还需要维持相关系统的解剖结构和生理形态。事实上，对神经系统及其他复杂系统工作方式的理解必须基于系统性的研究方法。因此，本研究选用活体斑马鱼胚胎作为模型系统，在不干扰胚胎生理条件的前提下，检测脊髓神经元膜电位的变化。
此处描述了一种结合使用斑马鱼胚胎与基于FRET的生物传感器的方法。斑马鱼胚胎具有极为简化的神经系统，且由于其通透性高，非常适合成像应用，可在斑马鱼发育过程中对细胞质膜上的基于荧光的电压指示剂进行检测。这两种组分的协同作用使得能够在不干扰生理状态的情况下，对完整活体生物中的细胞电活动进行分析。最后，这种非侵入性方法可与其他分析手段共存例如， 自发运动记录（如图所示）。
引言
体内系统组分分析使科学家能够以最可靠的方式研究细胞行为。当所研究的活动在很大程度上受到细胞间相互作用（包括依赖接触和非接触依赖的方式）影响时，这一点尤为正确，例如在神经系统中，膜电位的变化驱动着可兴奋细胞之间的通讯。理解这些电信号所编码的信息，是揭示神经系统在生理和疾病状态下工作机制的关键。
为了在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究细胞的电学特性，近年来已开发出多种基因编码的电压指示剂1与前几代光学电压传感器（主要是电压敏感性染料）不同2，GEVIs 能够实现 体内 对完整神经系统的分析，且其表达可局限于特定的细胞类型或细胞群。
斑马鱼胚胎是利用基因编码电压指示剂（GEVI）巨大潜力的首选体内 "底物"。事实上，由于其良好的光学通透性以及结构相对简单但进化上保守的神经系统，斑马鱼模型能够直接识别和操控神经网络中的每一个细胞组分。例如，基于FRET的GEVI探针Mermaid3的应用，已在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的斑马鱼模型中成功识别出运动神经元在症状出现前的行为异常4。
以下体内实验方....
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方案
1. pHuC_Mermaid 质粒的构建
注意：Mermaid 是一种生物传感器，通过将海鞘（Ciona intestinalis，现为 Ciona robusta）的电压感应磷酸酶（Ci-VSP）中的电压感应结构域（VSD）5 与FRET荧光蛋白对Umi-Kinoko Green（mUKG：供体）和一种单体形式的橙色荧光蛋白Kusabira Orange（mKOk：受体）配对而构建。该生物传感器中，由细胞膜去极化诱导的VSD结构域构象变化会增加供体与受体荧光蛋白之间的空间接近性，从而增强两者之间的能量转移（即提高FRET比率）3。VSD可确保该生物传感器高效定位于细胞质膜。通过将Mermaid的开放阅读框（ORF）克隆至斑马鱼泛神经元启动子HuC的下游，可实现该生物传感器在神经元中的表达（在脊髓中，信号可在中间神经元和运动神经元中均被检测到）6。
- 使用 T3 Universal 引物和 Mermaid SmaI 引物（5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA），以 Pfu（校对）DNA 聚合酶通过聚合酶链式反应（PCR）从 pCS4+ Mermaid 质粒3 中扩增 M....
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结果
通过显微注射法，将携带基于FRET的Mermaid生物传感器编码序列的表达载体导入单细胞受精卵中，该载体受pHuC全神经元启动子调控，可在神经系统中特异性驱动蛋白合成，从而获得瞬时转基因胚胎（图1， 左图）。掌握显微注射技术后，Mermaid阳性胚胎的比例接近100%。在这些胚胎中，仅选择在细胞膜上表达适量Mermaid生物传感器的个体用于FRET分析/图像采集。
自发性卷曲是一种仅由全身收缩组成的运动反应，表现为尾尖卷向头部9,10，在受精后20-24小时（hpf）阶段的常规鱼类培养液中记录到（图1，中间图面板及视频1），在5 µM利鲁唑孵育后也进行了记录（视频2）。.......
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讨论
本文所述方案使我们能够探究斑马鱼胚胎脊髓运动神经元的电学特性与自发卷曲行为之间的关联。自发卷曲行为是胚胎发育过程中最早出现的刻板运动活动，约在胚胎发育17小时（hpf）时出现，并持续至24小时（hpf）10。
我们的方法为研究人员提供了一种工具，用于研究完整胚胎的神经系统，充分保留了发育中的功能性网络内细胞间相互作用的复杂性。体内成像斑马鱼胚胎的操作仅需将其浸入低熔点琼脂糖中固定即可完成。利用生物传感器研究细胞膜电位变化是该方法的主要优势之一。传统的电生理学方法需要通过去除包被组织来直接接触神经元11，这类操作可能会改变被检测细胞的电学特性。此外，基于FRET的生物传感器方法可在无需使用麻醉剂（例如，三卡因，一种钠通道阻滞剂）的情况下研究细胞的电学特性，从而避免了化学物质（例如 本实验中使用的利鲁唑）给药可能带来的干扰，这在实验设计中可能至关重要。该方法使我们能够专注于调控自发性尾部卷曲行为的电活动及其频率，而这种行为反应在大多数情况.......
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
作者谨向 Simona Rodighiero 致以诚挚感谢，感谢她在 FRET 成像分析中提供的宝贵支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| 利鲁唑 | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA 聚合酶 | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 通用引物 | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统 | Promega | A9280 | |
| 通用 SmaI 引物 | Eurofins | ||
| StrataClone 哺乳动物表达载体系统 / pCMV-SC 平端载体 | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm 玻璃底成像培养皿 | Ibidi | 81151 | |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | M10 F | |
| 数码相机 | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 软件 | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player，版本 10.4 | Apple | ||
| 共聚焦显微镜（倒置） | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 显微注射仪 | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ 宏 Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
参考文献
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
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重印与许可
