尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。
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摘要
摘要
巨噬细胞是免疫系统固有免疫分支中的专职吞噬细胞。在稳态条件下，静息型巨噬细胞存在于成体组织中，作为抵御感染和组织损伤的第一道防线。尽管其他免疫细胞持续由骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPC）再生，但一类被称为组织驻留巨噬细胞的巨噬细胞谱系已被证实可在不依赖骨髓HSPC输入的情况下实现自我维持。这类谱系的典型代表包括脑内的小胶质细胞、肝脏中的库普弗细胞以及表皮中的朗格汉斯细胞等。肠道和结肠固有层是唯一缺乏HSPC非依赖性驻留巨噬细胞的成体组织。近期研究表明，驻留巨噬细胞起源于胚外卵黄囊造血过程，其前体细胞不同于胎儿造血干细胞（HSC）。在卵黄囊确定型造血过程中，红髓祖细胞（EMP）可分化为红系和髓系细胞，特别是组织驻留巨噬细胞。EMP仅在胚胎发育E8.5至E10.5天之间于卵黄囊中产生，并在循环系统建立后迅速迁移至胎儿肝脏，在此扩增并分化直至至少E16.5天。其子代包括红细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞，但唯有EMP来源的巨噬细胞可持续存在于成体组织中。由于EMP的出现具有短暂性，且其产生时间与HSC生成期部分重叠，使得对这些前体细胞的分析变得困难。我们建立了一种基于巨噬细胞集落刺激因子受体Csf1r启动子表达的他莫昔芬诱导型命运图谱示踪技术，用于鉴定EMP及其衍生细胞 体内 通过流式细胞术。
引言
在发育过程中存在若干波次相继出现但部分重叠的造血祖细胞，其髓系子代细胞可延续至成年。首先，单能性 "原始的" 前体细胞在小鼠卵黄囊中出现 1,2 在E7.5至E8.25之间产生，且不经过任何单核细胞中间阶段而直接生成胚胎巨噬细胞。由原始前体细胞衍生的巨噬细胞是否能在成年大脑中作为小胶质细胞持续存在，目前仍是活跃的研究课题。其次，红髓前体细胞（Erythro-Myeloid Precursors, EMPs）于E8.5时期在卵黄囊中出现，进入血液循环并定植于胚胎。EMPs通过依赖Runx1的内皮-造血转化过程，从卵黄囊的造血内皮中产生。 3,4虽然EMP能在卵黄囊内分化为巨噬细胞，但它们也会从胚胎第9天（E9）起定植于胎肝5 并分化为红细胞、巨核细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和肥大细胞 6源自EMP的巨噬细胞在发育期及成年组织中均表现出增殖能力。由于目前对这些巨噬细胞的分化途径知之甚少，EMP来源的巨噬细胞是否在分化过程中绕过单核细胞阶段仍存在争议。 7,8最后，造血干细胞....
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方案
动物实验操作均依照巴斯德研究所机构动物护理与使用委员会（CETEA）批准的规程进行。
1. 子宫内 脉冲标记在 Csf1r MeriCreMer 蔷薇属 LSL-YFP 胚胎
- 配制4-羟基他莫昔芬（OH-TAM，50 mg/mL）的储备液。
- 在通风橱内，打开25 mg的OH-TAM小瓶，加入250 µL乙醇（100%）。
- 使用截短吸头将OH-TAM溶液转移至2 mL微量离心管中，最大速度涡旋振荡10分钟。
- 在超声波清洗仪中进行超声处理30分钟。
- 在通风橱内加入250 µL PEG-35蓖麻油，得到50 mg/mL的储备液。
注：PEG-35蓖麻油是一种具有两亲性质的溶剂，可结合疏水性分子并使其在水相溶剂中溶解。 - 最大速度涡旋约5分钟，并在超声波清洗仪中继续超声30分钟。
- 每管分装90 µL（含4.5 mg），每管用于一次注射。
- 如前所述13，可在4 °C保存1周，或在-20 °C长期保存。
- 配制黄体酮（10....
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结果
通过在E8.5时向与携带Rosa26-LSL-eYFP报告基因的雄鼠交配的Csf1r-Mer-iCre-Mer雌鼠体内给予OH-TAM，实现遗传谱系示踪。在OH-TAM存在的情况下，终止盒被切除，导致表达Csf1r的细胞永久性表达YFP。我们在E10.5时从小鼠胚胎中采集了两种造血组织（卵黄囊和胎肝）以及一种非造血组织（神经外胚层）。通过酶解和机械解离获得单细胞悬液，并使用荧光标记抗体染色后通过流式细胞术进行分析。在排除死细胞和双联体后，对单细胞悬液进行分析（图1）。所有设门均使用荧光减一对照（FMO）确定。建议同时进行红细胞排除（Ter119+ 细胞），以提高分析的清晰度（图1B）。利用细胞表面标志物Kit（前体细胞标志物）和CD45（造血细胞标志物），我们能够区分出三群目标细胞：Kit+ CD45neg、Kit+ CD45low 和 Kitneg CD4.......
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讨论
在短时间内，不同波次的造血前体细胞存在部分重叠，这使得分析发育性造血各波次对免疫细胞贡献的技术难度非常大。
他莫昔芬诱导型Cre系统提供了以时间可控的方式标记特定细胞的机会，并可在胚胎或成体中进行谱系分析，而无需 离体 或 体外 培养或移植。在他莫昔芬诱导型Cre品系中，将细菌Cre重组酶与人雌激素受体配体结合域的突变体融合（CRE-ER），或改进的单点突变Cre与两个小鼠雌激素受体融合（Mer-iCre-Mer）。Cre与雌激素受体的融合导致Cre被Hsp90隔离于细胞质中，从而阻止其在细胞核内介导重组。他莫昔芬（TAM）经肝脏代谢为其活性代谢产物4-羟基他莫昔芬（OH-TAM），后者与雌激素受体具有高亲和力。OH-TAM与融合型Cre结合后，破坏其与Hsp90的相互作用，使Cre得以转位至细胞核并启动Cre介导的重组。注射TAM或OH-TAM 在子宫内 向怀孕雌性个体给药已被证明可激活发育中胚胎的重组。妊娠期间给予他莫昔芬可能导致流产，从而减少产仔数量；若在妊娠中期后给药，则可能阻止自然分娩，此时需通过剖宫产手术娩出幼仔。为.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Frederic Geissmann 教授和 Christian Schulz 教授富有见地的讨论；感谢 Hannah Garner 博士对稿件的审阅；感谢 Xavier Montagutelli 博士、Jean Jaubert 博士以及巴斯德研究所动物设施工作人员在小鼠饲养方面提供的支持；感谢 Pascal Dardenne 以及 Amgen 学者 Vytaute Boreikaite 提供的技术协助。E.G.P. 实验室的研究工作由巴斯德研究所、法国国家科学研究中心（CNRS）、Cercle FSER（FRM）以及巴斯德研究所和 REVIVE 联盟提供的启动经费资助。L.I. 获得了 REVIVE 联盟提供的博士研究生奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5 直头镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm 直剪 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| 抗小鼠 Kit-PE（克隆 2B8） | BD Pharmingen | 553355 | FACs 缓冲液中 1/200 稀释 |
| 抗小鼠 CD45.2 APC-Cy7（克隆 104） | Sony | 1149120 | FACs 缓冲液中 1/100 稀释 |
| 抗小鼠 AA4.1-APC（CD93，克隆 AA4.1） | eBioscience | 17-5892 | FACs 缓冲液中 1/100 稀释 |
| 抗小鼠 Ter119 PerCP-Cy5.5（克隆 Ter119） | Biolegend | 560512 | FACs 缓冲液中 1/200 稀释 |
| 抗小鼠 F4/80-BV421（克隆 BM8） | BD Pharmingen | 123137 | FACs 缓冲液中 1/100 稀释 |
| 抗小鼠 CD11b PE-Cy7（克隆 M1/70） | BD Pharmingen | 552850 | FACs 缓冲液中 1/200 稀释 |
| 抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 阻断剂，克隆 2.4G2） | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| 胎牛血清 | Fischer Scientific | 11570506 | |
| 胶原酶 D | Roche | 11088882001 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6 孔组织培养板 | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12 孔组织培养板 | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24 孔组织培养板 | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 孔 U 型底组织培养板 | Dutscher Dominique | 353227 | |
| 2 mL 塑料注射器 Plastipak | Dutscher Dominique | 300185 | |
| 尼龙筛网 100 µm 细胞滤器 | Dutscher Dominique | 352360 | |
| 尼龙筛网 70 µm 细胞滤器 | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon 管 | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Millipore Stericup GP 过滤装置，0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-羟基他莫昔芬 25mg | Sigma | H7904-25MG | 配制和使用他莫昔芬及其衍生物时需格外小心。务必使用适当的个人防护装备 |
| 孕酮 | Sigma | P3972 | 务必使用适当的个人防护装备 |
| PEG-35 蓖麻油（Kolliphor/Cremophor EL） | Sigma | C5135 | |
| 葵花籽油 | Sigma | S5007-250ML | |
| 乙醇 | Sigma | 24103-1L-R-D | 务必使用适当的个人防护装备，并在通风橱中操作 |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI，1 mL（1 mg/mL 水溶液） | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 流式细胞仪 | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX 日常质控荧光微球 | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp 抗体捕获微球试剂盒（2×5 mL） | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson Laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | 6148 |
参考文献
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embr....
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