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方法文章

滞后链DNA合成的动力学 体外 由T7噬菌体复制蛋白

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DOI：

10.3791/55312

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2017年2月25日

 , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

我们描述了一种基于凝胶的高灵敏度非连续检测方法，用于研究T7噬菌体复制蛋白在滞后链起始过程中的动力学。

摘要

本文提供了滞后链DNA合成动力学研究的实验方案 体外 由T7噬菌体复制蛋白介导。T7复制体是目前已知最简单的复制系统之一，仅由四种蛋白质组成，这一特性使其成为生化实验的理想选择。本研究特别关注T7引物酶-解旋酶合成核糖核苷酸引物的过程，这些引物由DNA聚合酶用于启动DNA合成。由于DNA复制机制在进化过程中高度保守，因此这些实验方案不仅适用于本系统，也可为使用其他模式系统的科研人员提供概念上的参考。此处描述的实验方案灵敏度高，经验丰富的研究人员可在约一天内完成实验并获得可用于分析的数据。实验所需的唯一特殊设备是快速淬灭流动仪，但该设备相对常见，并可从多家商业供应商处获得。然而，这些检测方法的主要缺点包括放射性物质的使用以及通量相对较低。

引言

DNA 复制是所有细胞生命形式中保守的特征。尽管复制组分的种类和数量差异很大，但其基本机制在进化过程中是共通的1。本文描述了一种基于凝胶的、使用放射性底物的非连续动力学实验方法，旨在体外研究T7复制体组分在滞后链DNA合成过程中的动力学特性。大肠杆菌噬菌体T7的复制机器非常简单，仅由四种蛋白质组成（DNA聚合酶gp5及其持续合成因子E. coli硫氧还蛋白、具有引物酶-解旋酶双重功能的gp4蛋白，以及单链DNA结合蛋白gp2.5）2。这一特性使其成为研究DNA复制中保守生化机制的理想模型系统。

本研究特别关注T7 DNA引物酶催化形成核糖核苷酸引物的过程，这是DNA合成起始的关键步骤。此外，通过在反应体系中加入T7 DNA聚合酶或其他复制蛋白，还可以进一步研究这些引物的利用情况。T7引物酶-解旋酶gp4可在特定的DNA序列（称为引物识别位点，即PRS，序列为5'-GTC-3'）处催化合成DNA复制所需的引物。PRS中的胞嘧啶具有隐匿性：它对位点识别至关重要，但本身不会被复制到产物中3。gp4合成引物的第一步是形成二核苷酸pppAC，随后延伸为三核苷酸，并最终根据模板序列生成功能性的四核苷酸引物pppACCC、pppACCA或pppACAC4。这些引物可被T7 DNA聚合酶用于启动DNA合成，而该过程同样受到gp4的辅助5,6。在此过程中，引物酶结构域通过与模板结合，稳定极短的四核糖核苷酸，防止其解离，并以有利于将引物/模板复合物固定在聚合酶活性位点的方式招募DNA聚合酶7。这些步骤（RNA引物合成、引物向聚合酶的传递及延伸）需多次循环进行，以完成滞后链的复制，并必须与前导链的复制过程协调进行。

本文所述的检测方法具有高度敏感性，且可在较短时间内完成。然而，这些方法的通量相对较低，且在使用和处置放射性材料时必须格外谨慎。根据反应进行的速度，可采用快速淬灭装置，以在稳态或预稳态条件下，获得适合于反应进程有意义分析的时间尺度样本。最近，我们利用本文所述的检测方法，提供了证据表明引物从gp4引物酶结构域释放对于冈崎片段起始具有重要意义。此外，我们还发现了T7单链DNA结合蛋白gp2.5在促进引物高效形成与利用方面具有调控作用的证据8。

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方案

注意：请遵守所有关于放射性物质安全使用和处置的机构规定，包括但不限于使用个人防护装备，如手套、护目镜、实验服以及适当的丙烯酸防护罩。

注意：标准缓冲液包含 40 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、50 mM 谷氨酸钾、5 mM DTT、0.1 mM EDTA（该缓冲液预先配制成 5 倍浓度）以及每种 dNTP 各 0.3 mM。T7 复制蛋白的纯化方法如文献8,9,10所述。含有单个 T7 引物酶识别位点（5'-GGGTC-3'、5'-GTGTC-3'、5'-TGGTC-3'）的单链 DNA 可从多家 DNA 合成公司购买获得（ssDNA 的长度可能取决于所选酶的种类；对于 T7 引物酶，五核苷酸是合成全长引物所需的最小模板长度11，因为隐含的 C 至关重要；然而，若引物需由聚合酶进一步延伸，则模板的 3' 端必须含有额外的核苷酸）。反应通过加入终浓度为 10 mM MgCl2 启动，并在 25 °C 下孵育。对于 5 秒或更长时间的时间点，手动取样效果良好。若需要更短时间点的数据，建议使用快速淬灭流动仪以获得准确结果。

1. 通过手动取样进行多轮次引物合成反应

  1. 实验开始前，将 2 µL 甲酰胺染料缓冲液（93% (v/v) 甲酰胺，50 mM EDTA，0.01% 茴香青和 0.01% 溴酚蓝）分装至 8 个 1.5 mL 聚丙烯管中。通常，管子的数量等于所分析的时间点数量。
  2. 配制 20 µL 混合液，包含 1x 缓冲液、0.1 mM ATP 和 CTP、0.25 mCi/mL [α-32P] CTP、0.1 µM 单链 DNA 模板以及 0.1 µM gp4（以六聚体浓度表示——0.6 µM 单体）。
  3. 将混合液在室温下孵育 5 分钟。
  4. 使用移液器取出 2 µL 混合液，并与第 1.1 步中准备的 1.5 mL 管中的 2 µL 甲酰胺染料缓冲液混合，作为无反应对照（时间零点）。
  5. 向反应混合物中加入 2 µL 0.1 M MgCl2（终浓度为 10 mM）。
  6. 使用移液器手动每隔 10 秒从反应混合物中取出 2 µL 样品，并与第 1.1 步中预先分装在 1.5 mL 管中的甲酰胺染料缓冲液混合。
  7. 将样品在 95 °C 的加热块中加热 5 分钟。
  8. 将样品的等分试样加样到变性凝胶上。T7 引物酶合成的小四核糖核苷酸引物产物可在 0.4 mm 厚的 25% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）、3 M 尿素、1x TBE（100 mM Tris-硼酸盐，1 mM EDTA）凝胶上良好分离。
  9. 将整块凝胶置于层析纸上，并用塑料膜覆盖。使用凝胶干燥仪干燥凝胶。
  10. 对剩余的反应混合物制备一系列稀释液，并将与凝胶加样量相同的体积点样到层析纸上，即，如果样品加样量为 4 µL，则点样 4 µL 稀释液。
    注意： 这将作为标准曲线，用于确定反应过程中生成产物的浓度。例如，使用 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）进行五倍稀释效果良好，稀释范围为 1:25 至 1:15,625（52-56），但应根据反应活性水平调整稀释倍数。
  11. 使用磷屏成像仪曝光干燥后的凝胶和标准样品。定量稀释系列中的放射性信号，并按照文献 8,12 所述构建标准曲线。
    注意： 在反应体系中加入 T7 DNA 聚合酶，可研究该酶对四核糖核苷酸引物的利用情况。理想情况下，聚合酶浓度应达到饱和，以简化数据解释。0.4 µM 或更高的聚合酶浓度可获得良好结果。此外，也可通过此方法研究其他蛋白质（如单链 DNA 结合蛋白）对引物合成或滞后链起始的影响。

2. 使用快速淬灭仪进行多轮转引物合成反应

  1. 反应混合物的制备
    1. 配制 400 µL 溶液 A，其中含有 1x 缓冲液、0.2 µM gp4 六聚体、0.2 µM 单链 DNA 模板、0.6 mM dNTPs、0.2 mM ATP 和 CTP（包括 0.5 mCi/mL [α-32P] CTP
    2. 配制 400 µL 溶液 B，其中含有 1x 缓冲液和 20 mM MgCl2.
  2. 快速淬灭流动仪器的操作
    1. 打开快速淬灭流动仪器；主菜单出现后，在仪器键盘上输入 7，使注射器驱动器移动到初始位置。
    2. 打开缓冲液注射器位置 "加载".
  3. 上样缓冲液注射器
    1. 将装有缓冲液的10 mL注射器连接至驱动注射器接口。将注射器旋钮调至相应位置 "加载".
    2. 使用10 mL注射器，将仪器缓冲液储液槽A和B中加入10 mM Tris（pH 7.5）、1 mM EDTA，注射器C中加入淬灭溶液（250 mM EDTA和0.2% SDS）。通过推拉活塞排出气泡。
    3. 调整旋钮位置至 "火灾"2. 调整注射器驱动杆的位置。按压 "调整至下方" 按下按钮以降低注射器，直至缓冲液从出口环路流出：（7-持续下降；8-大幅下降；9-小幅下降）。类型 "ESC" 返回主菜单。
  4. 清洗管路
    1. 将出口管路连接至真空。切换样品旋钮 "冲洗"关闭缓冲液注射器，将旋钮调至水平位置。开启真空，将2个冲洗环浸入H2O₂ 吹扫 10 秒，然后浸入甲醇中 10 秒。通过抽吸空气干燥接种环，约 15 秒，或直至完全干燥。
  5. 加样
    1. 将样品旋钮位置更改为 "加载"将溶液A加入1 mL注射器中，将注射器插入其中一个样品加载口。对溶液B重复上述操作，并将其注入相对的样品加载口。
  6. 时间点的采集
    1. 在主菜单中输入 1 以进行淬灭-流动实验。输入反应时间（s）并按压， "进入"将显示要使用的反应环编号。切换至所需的反应环。重复步骤2.2.4中的洗涤程序。
    2. 转动样品旋钮至 "加载"将反应混合物加入样品环中，直至接近中央混合室的外缘。将所有旋钮转至 "FIRE"确认所有旋钮均处于正确位置。
    3. 将1.5 mL离心管置于出口环末端，按压 "GO" 以运行反应。重复步骤 2.2.4 中的洗涤程序。重新加载缓冲液注射器 A 和 B，直至其到达驱动器位置。
    4. 对每个所需的时间点重复步骤 2.2.6.2–2.2.6.3。例外：不要加入含有启动试剂的溶液即，MgCl2 在此情况下，淬灭零时间点对照时。
    5. 当完成样本采集后，输入 "ESC" 返回主菜单。按 "7" 将缓冲液注射器驱动器返回至初始位置。
  7. 仪器清理
    1. 移除反应混合物注射器。将样品加载旋钮转至 "加载" 位置。在真空条件下，用10 mL 0.2 N NaOH冲洗每个样品环，随后用10 mL 0.3 N H3PO4 和10 mL甲醇。
    2. 旋转注射器旋钮 "加载" 位置。按压全部3个注射器的推杆，以吸取反应液和淬灭缓冲液。用5 mL H2至少两次。
    3. 再次用5 mL H填充注射器2O 并转动旋钮以 "FIRE" 位置。调节旋钮位置并打开真空以除去 H2O. 按照步骤 2.2.4 进行冲洗。关闭仪器。
      注意： 按照步骤1.7-1.12所述方法对产物进行分析。此外，可在反应体系中加入T7 DNA聚合酶及其他复制相关蛋白，以分析其对引物合成或延伸的影响。

3. 单次转换引物合成反应

注意：单次转换引物合成/延伸实验的操作方法与多次转换反应类似，但存在几个主要差异：这些实验需追踪放射性标记的ATP转化为引物或延伸产物的过程，然而底物和蛋白质的浓度显著更高。此外，为了获得毫秒级分辨率以分析引物合成反应，必须使用快速淬灭流动装置。

  1. 反应混合物的制备。
    1. 配制400 µL溶液A，其中包含1×缓冲液、3 µM gp4六聚体、6 µM单链DNA模板、0.6 mM dNTPs、1 mM CTP和2 nM [γ-32P] ATP。另配制400 µL溶液B，其中包含1×缓冲液和20 mM MgCl2。
  2. 快速淬灭流动操作
    1. 按照步骤2.2所述进行反应。如需要，可分别加入终浓度为15 µM的T7 DNA聚合酶或20 µM的T7单链DNA结合蛋白。在此情况下，延伸产物的积累时间范围允许手动取样反应液。

4. 数据分析

  1. 使用具备最小二乘法拟合和/或数值积分功能的商业软件，将产物生成进程曲线拟合至非线性最小二乘模型。具体操作因所用软件而异，但以下为用于数据拟合的通用方程形式。
  2. 通过将多轮转引物合成反应的进程曲线拟合至线性方程，确定产物生成速率。若曲线存在显著弯曲，则采用初始速率法13,14，将数据拟合至单指数函数：y=A(e-kt)，其中 y 为产物浓度，A 为反应幅度，k 为观测到的速率常数，t 为时间（单位：秒）。t=0 时切线的斜率即为初始速率。
    注意：将稳态前引物合成反应的曲线拟合至线性方程，或拟合至稳态前爆发方程 y=A(e-kburstt)+ratesst，其中 A 为反应幅度，kburst 为稳态前爆发的观测速率常数，ratess 为稳态速率（ratess=kcat[酶]），t 为时间（单位：秒）。将单轮转引物合成反应的进程曲线拟合至单指数函数 y=A(e-kt)。对于 gp4，应使用商业软件，通过数值积分15 将数据拟合至包含三个 NTP 缩合步骤的模型，其中每个中间体均与酶处于平衡状态。

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结果

所示结果 图1A 如所述获得 第1步 方案的 即，通过在多轮催化条件下手动取样由gp4催化的引物合成反应。在此，使用标记了CTP的样品经凝胶电泳后可观察到一系列产物 32引物合成反应中α位的P（磷）图1A）。标记的前体CTP迁移速率最高，位于凝胶底部，随后是迁移较慢的产物，对应gp4合成的二、三和四核糖核苷酸。根据孵育时间及模板序列环境的不同，还可观察到对应更高寡聚体（五核糖核苷酸、 等等。可以观察到反应进程曲线的绘制方法是：首先确定每个时间点全长引物（即四核糖核苷酸和五核糖核苷酸）的浓度，然后将合成引物的浓度随时间的变化绘制成图。

尽管稳态、多周转实验的数据获取相对容易，但其数据的信息含量却较为有限，因为这些数据在很大程度上由底物结合和产物释放过程决定，即，这些过程通常主导或...

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讨论

进行这些实验最重要的因素是获得高活性的纯化酶。例如，在我们使用gp4的研究中发现，将纯化的酶在含有50%甘油的缓冲液（20 mM磷酸钾，pH 7.4，0.1 mM EDTA，1 mM DTT）中于-20 °C保存数月后，其比活性会显著下降。因此，我们现在将纯化的gp4分装成小份，溶于25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、1 mM TCEP和10%甘油中，用液氮迅速冷冻，并在-80 °C下保存。使用快速淬灭流动仪时，尤其是在采集前几个样品期间，必须在启动反应前让反应物达到反应温度（室温）。此外，每次时间点取样后，必须彻底清洗管路（方案中的步骤2.2.4），因为管路中残留的淬灭试剂会严重抑制酶活性，导致错误结果。另一个需要考虑的因素是聚丙烯酰胺凝胶的组成及其操作方式。gp4催化的引物合成反应产物在丙烯酰胺浓度低于20%的凝胶中无法有效分离。事实上，在15%的凝胶中，核苷酸底物及所有反应产物会迁移为一片模糊的放射性区域。因此，若需分析较小的核糖核苷酸产物，强烈建议相应调整丙烯酰胺的浓度。使用高浓度丙烯酰胺凝胶的一个主要缺点是其与滤纸的粘附性较差，因此在将凝...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 C.C.R. 实验室成员的评论意见以及 S. Moskowitz 在图示准备方面的协助。本工作得到美国国立卫生研究院基金资助：F32GM101761（A.J.H.）和 GM54397（C.C.R.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris 预制晶体
pH 7.5		SIGMAT4128
Tris 碱SIGMA93362
L-谷氨酸钾盐一水合物SIGMAG1501 
氯化镁六水合物Mallinckrodt Chemicals5958-04
1,4-二硫苏糖醇J.T. BakerF780-02
十二烷基硫酸钠MP Biomedicals811030
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Mallinckrodt Chemicals4931-04
[α-32P] CTPPerkinElmerBLU508H具有放射性，需采取防护措施
[γ-32P] ATPPerkinElmerBLU502A具有放射性，需采取防护措施
100 mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP Affymetrix77100四种 dNTP 为套装组分
100 mM ATP 和 CTPEpicentreRN02825核苷三磷酸（NTP）套装组分
单链 DNA 构建体Integrated DNA TechnologiesN/A定制序列 
甲醇 Macron Fine Chemicals3017-08
甲酰胺Thermo Scientific17899
溴酚蓝SIGMAB8026 
二甲苯青 SIGMAX4126 
丙烯酰胺SIGMAA9099有毒
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺SIGMAM7279 有毒
尿素Boston BioproductsP-940
硼酸Mallinckrodt Chemicals2549
快速淬灭-流动仪 Kintek Corp.RQF-3 
Kintek ExplorerKintek Corp.N/A
Kaleidagraph Synergy SoftwareN/A

参考文献

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  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).
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