利用原代神经球培养物研究初级纤毛

摘要

初级纤毛在神经前体细胞增殖、神经元分化以及成年神经元功能中具有根本性的重要作用。本文中，我们描述了一种利用原代神经球培养体系研究神经干细胞/前体细胞及分化神经元中纤毛形成过程以及信号蛋白向纤毛转运的方法。

摘要

初级纤毛在胚胎期、出生后及成体生命过程中神经干细胞/前体细胞的增殖以及神经元分化中具有根本性的重要作用。此外，大多数已分化的神经元均具有初级纤毛，其内含有信号受体（如G蛋白偶联受体）和信号分子（如腺苷酸环化酶）。初级纤毛决定了多种发育通路的活性，包括在胚胎神经元发育过程中音猬因子（sonic hedgehog）信号通路的调控，同时在成体神经元功能中发挥促进细胞内区室化信号传导的作用。毫不意外的是，初级纤毛的生成与功能缺陷已被证实与脑部发育异常、中枢性肥胖以及学习和记忆障碍相关。因此，迫切需要在神经干细胞/前体细胞和已分化神经元的背景下研究初级纤毛的生成及纤毛内物质运输。然而，原代神经元的培养方法需要较高的专业技术，且不适用于冻融循环。在本实验方案中，我们介绍了利用原代神经球培养混合群体神经干细胞/前体细胞的方法。基于神经球的培养方法兼具多种优势：可进行多次传代和冻融操作，具备向神经元和胶质细胞分化的潜能，并可进行转染操作。重要的是，我们发现来源于神经球的神经干细胞/前体细胞及分化后的神经元在体外培养中均具有纤毛结构，并能将与纤毛功能相关的信号分子定位于这些区室中。利用此类培养体系，我们进一步描述了在神经干细胞/前体细胞及分化神经元中研究纤毛形成和纤毛运输的方法。这些基于神经球的研究方法使我们能够在神经干细胞/前体细胞和分化神经元的背景下，研究由纤毛调控的细胞信号通路，包括G蛋白偶联受体和音猬因子（sonic hedgehog）信号通路。

引言

初级纤毛是一种基于微管的动态亚细胞区室，在协调细胞信号通路（包括胚胎神经元发育过程中的Sonic Hedgehog（Shh）通路^1,2）以及成年神经元功能中的区室化亚细胞信号传导^3,4中发挥感觉天线的作用。这些通路的信号组分，如Shh受体Patched⁵、通路激活因子Smoothened（Smo）⁶，以及负向调控Shh通路的孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）Gpr161⁷，均以动态方式定位于纤毛中。已有多个GPCR被报道可在脑内神经元的纤毛中定位^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16}。纤毛及其介导的信号通路缺陷会影响多种组织，统称为纤毛病^17,18,19。纤毛病的疾病谱常包括神经发育缺陷，例如颅面异常^20,21,22。此外，下丘脑神经元中的初级纤毛调控中枢饱腹信号通路，其缺陷可导致中枢性肥胖²³，这与Bardet-Biedl综合征等综合征型纤毛病中的肥胖表现相似²⁴。同时，纤毛内的神经肽受体信号传导也参与调控中枢饱腹通路^11,14。腺苷酸环化酶III（ACIII）和某些GPCR（如海马神经元中的生长抑素受体3）在纤毛中的定位异常会导致新物体识别障碍和记忆缺陷^25,26，并伴随纤毛完整性缺失²⁷。纤毛介导的信号通路在发育过程中的作用与组织稳态密切相关；特别是，纤毛在小脑颗粒前体细胞来源的Shh亚型髓母细胞瘤进展中具有重要作用^28,29。因此，初级纤毛在胚胎期、出生后及成年期的神经元发育与功能中均发挥关键作用。

神经干细胞（NSCs）存在于哺乳动物侧脑室的室下区（SVZ）、海马齿状回的颗粒下区以及下丘脑第三脑室的室管膜区^30,31,32。NSCs具有多向分化潜能，具备自我更新能力，在脑发育和再生医学中具有重要作用³⁰。SVZ中的大多数NSCs处于静息状态，具有单一的初级纤毛，该纤毛在许多情况下会延伸至侧脑室³³。初级纤毛通过多种受体的定位介导信号转导，引发下游细胞反应，尤其涉及Shh、TGFβ以及受体酪氨酸激酶通路^2,34,35,36。由于初级纤毛伸入侧脑室，人们推测其可感知脑脊液（CSF）中的细胞因子，从而激活NSCs³⁷。近期研究表明，Shh信号通路和初级纤毛在多种组织（包括嗅上皮、肺和肾）的修复与再生过程中对干细胞的激活至关重要^38,39,40,41。然而，CSF与NSCs之间的通讯机制以及初级纤毛是否参与其中仍不清楚。培养中的贴壁NSCs具有纤毛，可将Shh通路组分（如Smo和Gpr161）定位于纤毛内，并对Shh产生响应⁴²。因此，NSCs可作为研究Shh通路、纤毛运输及神经元分化通路的重要模型系统。此外，由NSCs分化而来的神经元也可用于纤毛运输检测实验。

神经球是由神经干细胞/前体细胞在特定生长因子和非黏附表面条件下增殖形成的游离细胞簇^43,44神经球具有重要意义 体外 用于研究正常发育与疾病中神经干细胞/前体细胞的培养模型^31,45,46,47在此，我们介绍一种基于神经球的实验方法，用于培养神经干细胞/前体细胞并诱导其分化为神经元和胶质细胞。我们特别关注信号通路组分在神经干细胞/前体细胞及分化后神经元纤毛中的转运过程图1与原代神经元培养相比，原代神经球相对易于培养，可进行多次传代和冻融循环，并能分化为神经元和胶质细胞。重要的是，我们发现神经球来源的神经干细胞/前体细胞及分化后的神经元在培养中均具有纤毛结构，并且与纤毛功能相关的信号分子定位于这些纤毛区室中。基于神经球的培养方法可作为研究神经干细胞及分化神经元中纤毛发生和纤毛转运的理想模型系统。

方案

1. 从小鼠成年脑中分离神经球

1. 使用过量异氟烷处死一只成年小鼠（约2个月大）。确认小鼠呼吸已停止后，立即进行解剖。
2. 使用剪刀沿中线切开颅骨，取出脑组织。
3. 将脑组织置于盛有冰冷PBS的10 cm培养皿中，并置于冰上。按照全组织解剖法从侧脑室获取SVZ组织⁴⁸。
4. 将侧脑室放入1.5 mL离心管中，加入500 µL含0.05%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，于37 °C水浴中孵育15分钟。
5. 孵育15分钟后，加入500 µL终止培养基，用1 mL枪头轻柔吹打20–30次。吹打过程中避免产生气泡。
   注意：此步骤对细胞存活至关重要。
6. 以500 × g离心8分钟，弃上清液，加入1 mL PBS，用1 mL枪头轻柔吹打5次重悬细胞。
7. 再次以500 × g离心8分钟，用1 mL枪头吸除上清液，加入1 mL基础培养基。
8. （可选）若观察到细胞碎片，可通过70 µm细胞筛过滤细胞悬液。
9. 使用血细胞计数板计数细胞；通常每SVZ可获得约30,000–60,000个细胞。
10. 将一个SVZ来源的细胞接种至10 cm培养皿中，加入10 mL NSC培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养。
11. （可选）为避免神经球融合⁴⁹，可将1,000个细胞接种于超低吸附6孔板的一个孔中，每孔预先加入1.5 mL NSC培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下培养。
    注意：培养5–7天后可观察到神经球（图2A）。培养时间可能因小鼠年龄或遗传背景不同而有所差异。
12. 每隔3–4天添加2 mL NSC培养基以维持培养（无需移除原有培养基）。

2. 神经球分化能力分析与纤毛发生检测

1. 为分析分化能力，需在贴壁条件下使用分化培养基对神经球进行分析。
2. 使用前通过高压灭菌或紫外照射对12 mm圆形盖玻片进行灭菌。进行贴壁细胞培养时，在无菌条件下将灭菌后的12 mm圆形盖玻片放入24孔板的孔中。
3. 用500 µL的0.002%多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液将盖玻片孵育10秒，吸除溶液后室温干燥10-15分钟。
4. 加入500 µL层粘连蛋白溶液（5 µg/µL），将盖玻片在37 °C孵育1小时。
5. 吸除层粘连蛋白溶液，加入500 µL分化培养基或NSC培养基（未分化对照）。
6. 进行分化实验时，在显微镜下用200 µL枪头挑取直径100–200 µm的神经球，每孔加入5–10个神经球至24孔板中，并在分化培养基中培养7–10天。
7. 为分析未分化的神经球，将5–10个神经球加入24孔板的每孔中，在NSC培养基中培养1–2天。贴壁的神经球将铺展并以单层形式生长（图2B）。
8. 小心吸除培养基后，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温固定细胞15分钟，随后在室温下用PBS洗涤两次，每次5分钟。培养板可在4 °C保存1–2个月。
   注意：为观察NSC培养基中的神经干细胞/前体细胞及分化培养基中的分化细胞，需进行免疫荧光染色，靶标包括Nestin（神经干细胞/前体细胞标志物）、β–tubulin III（TUJ1单克隆抗体，神经元标志物）、GFAP（胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞标志物）和O4（少突胶质细胞标志物）（图2B-E）。为分析纤毛结构，需对Arl13b（初级纤毛标志物）和Gpr161（纤毛G蛋白偶联受体）进行免疫荧光染色（图3）。
9. 将盖玻片用封片液封固于载玻片上，并倾斜载玻片以去除多余液体。

3. 神经球中纤毛发生的分析

1. 为了通过免疫染色分析完整神经球中的细胞，将含有多个神经球的1 mL培养基转移至1.5 mL离心管中，在500 × g下离心8分钟。弃去上清液后，用4%多聚甲醛（PFA）固定神经球15分钟，并用PBS洗涤。 在500 × g下再次离心8分钟，弃去上清液，然后在4°C下用30%蔗糖孵育神经球过夜（O/N）。 
2. 使用1 mL枪头弃去上清液，并用剪去尖端的1 mL枪头加入500 µL OCT包埋剂。剪去枪头边缘以扩大开口，因为OCT较为黏稠。
3. 将含有神经球的OCT包埋剂转移至一次性塑料冷冻模具（10 mm × 10 mm × 5 mm）中。
4. 将模具置于干冰上冷冻至少15分钟。
5. （可选）暂停实验，将模具储存在-80 °C冰箱中，最长可保存1年。
6. 使用冷冻切片机切割切片，切片厚度应为15–30 µm。
7. 为了观察神经球中的初级纤毛，对Arl13b进行免疫染色（图4）。

4. 神经球和贴壁神经干细胞的培养与传代

1. 当神经球大小在 100–200 µm 之间时进行传代；当神经球过大（300 µm 或以上）时，不适合用于实验。
2. 使用 1 mL 吸头将神经球转移至 50 mL 离心管中，在 500 × g 条件下离心 8 分钟。
3. 用抽吸装置弃去上清液，加入 500 µL 含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 的 PBS 溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟。胰蛋白酶用量根据神经球数量而定。
4. 加入 500 µL 含血清培养基，用 1 mL 吸头轻柔吹打 20 次。
5. 在 500 × g 条件下离心 8 分钟，使用 1 mL 吸头弃去上清液，加入 1 mL 基础培养基。
6. （可选）若观察到细胞碎片或未完全解离的神经球，可通过 70 µm 细胞筛过滤细胞悬液。
7. 将细胞以 10,000 个细胞/cm² 的密度接种于 10 cm 培养皿中，在神经干细胞培养基中进行传代培养；细胞约一周后可进行下一次传代。
8. （可选）如需冻存细胞，加入冻存液制成每毫升含 500,000 至 1,000,000 个细胞的悬液 ，使用程序冻存盒进行冷冻保存；未解离的神经球也可直接冻存。
9. 对于贴壁培养，将细胞稀释至 50,000 个细胞/cm² ，接种于经多聚赖氨酸（PLL）和层粘连蛋白（Laminin）包被的盖玻片上，使用神经干细胞培养基培养 1–2 天。

5. 饥饿处理与纤毛分析

1. 制备饥饿培养基（表1）。
2. 贴壁细胞解离后初次接种1-2天后，将其中一个孔更换为NSC培养基（对照组），另一孔更换为饥饿培养基（实验组）。
3. 将贴壁细胞继续培养24小时。
4. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）在PBS中固定细胞15分钟，随后在室温下用PBS 洗涤两次，每次5分钟。
5. （可选）暂停实验，将含有盖玻片的24孔板置于4 °C的PBS中保存1-2个月。
6. 进行免疫荧光染色实验^7,50。
7. 使用封片液封固盖玻片。在室温避光条件下过夜干燥载玻片 。
8. 在复合显微镜下以所需放大倍数采集图像。使用显微镜、相机和物镜（40X/1.3油镜和63X/1.4油镜），并通过配套软件进行控制。以0.5-0.8 µm的间隔采集足够的z轴连续切片图像（图5）。
9. 对贴壁细胞中纤毛定位进行定量分析时，通过观察DAPI通道，连续采集3-8个视野的图像堆栈（细胞应达到汇合状态）。使用ImageJ/Fiji软件对初级纤毛数量进行量化。通常可在ImageJ插件"Cell counter"工具（位于Plugins>Analyze对话框中）统计表达GPCR阳性纤毛的细胞数量；也可从ImageJ/Fiji导出图像堆栈的最大投影图像。为便于计数和导出，同一实验的所有图像应采用相同的图像亮度和对比度参数。

6. 神经球的转染

1. 将解离的细胞接种到盖玻片上，贴壁培养24小时。通常在24孔板的一个孔中加入500 µL NSC培养基，细胞密度为75,000至150,000个细胞。
2. 在0.5 mL微量离心管中，加入25 µL低血清培养基和1.5 µL转染试剂，涡旋混匀5秒。
3. 在另一个0.5 mL微量离心管中加入25 µL低血清培养基和2.5 µg无内毒素质粒DNA，涡旋混匀5秒。
4. 向含DNA的第二个微量离心管中加入1 µL转染试剂，涡旋混匀5秒。
5. 将含DNA的管中混合液加入第一个微量离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
6. 室温孵育10–15分钟。孵育结束后，将转染混合液逐滴缓慢加入含有NSC培养基（500 µL/孔）的孔中。
7. 转染后24小时更换培养基，替换为对照培养基（NSC培养基）或饥饿培养基（500 µL/孔）。
8. 转染24小时后，更换为4% PFA 固定细胞，随后进行免疫染色；通常该方案的转染效率可达10%。

结果

将室下区（SVZ）细胞接种于神经干细胞（NSC）培养基中培养一周后，观察到悬浮的神经球（图2A）。神经球的大小在50至200 µm之间。为了检测这些神经球是否来源于神经干细胞/前体细胞，将神经球接种于多聚赖氨酸（PLL）和层粘连蛋白（Laminin）包被的盖玻片上，在NSC培养基中培养2天，随后使用神经干细胞/前体细胞标志物Nestin进行免疫染色。培养2天可使神经球充分贴附于盖玻片并扩展为单层细胞。免疫染色结果显示该单层细胞表达Nestin（图2B）。为了检测神经球的多向分化潜能，按照第2节所述步骤，将神经球直接接种于PLL和Laminin包被的盖玻片上，置于分化培养基中培养7–10天，无需预先解离。分化过程至少需要一周时间。神经球贴壁后扩展为单层细胞，固定后使用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物进行免疫染色。我们观察到贴壁的神经球可分化为β-Tubulin III阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞以及O4阳性的少突胶质细胞（图2C–E）。因此，成年小鼠S...

讨论

本文介绍了一种从成年小鼠侧脑室下区（SVZ）建立并维持神经球培养的方法。关于这些培养物，有以下几点需要注意。首先，神经球的大小通常在50 - 200 µm之间。根据我们的经验，当神经球直径超过300 µm时，已错过传代的最佳时机，这些较大的神经球中心会含有死亡细胞。其次，由于神经球常用于研究神经干细胞/前体细胞，因此使用EGF和基础成纤维细胞生长因子（bFGF）以维持这些细胞的干性至关重要。因此，在神经球的维持过程中必须避免使用诱导分化的因子，如胎牛血清（FBS）。已有研究表明，10% FBS可诱导神经球分化为星形胶质细胞⁴⁷。第三，神经球向神经元分化的程度可能取决于小鼠的年龄；若希望获得更强的神经元分化能力，可使用更年轻的幼鼠（出生后第0天）。第四，若建立新的培养体系，始终建议检测神经球的分化潜能。第五，本方法还允许将已建立的神经球培养物冻存，并在将来实验中复苏使用。复苏后，细胞通常以贴壁的梭形细胞形式生长，无需使用多聚-L-赖氨酸或多层粘连蛋白。这可能是由于冻融过程对细胞造成了损伤。重要的是，在传代前应持续培养细胞至融合度达到60 - 80%。传代后，细胞通常重新形成神经球，并可连续传...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 圆形盖玻片	Fisherbrand	12-545-80
24 孔板	Falcon	353047
4% 多聚甲醛（PFA）	Affymetrix	19943
50 mL 离心管	Falcon	352098
95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖	Fisherbrand	FB0875714G	10 cm 培养皿
70 µm 细胞筛	Falcon	352350
Alexa Fluor 488 Affinipure 驴抗兔 IgG（H+L）	Jackson Immunoresearch	711-545-152	驴抗兔 Alexa 488 二抗
Arl13B，克隆 N295B/66	Neuromab	AB_11000053
B-27 添加剂（50X），无血清	ThermoFisher Scientific	17504001	B27
离心机	Thermo scientific	ST 40R
冻存管	Corning	430488
DAPI	Sigma	D9542-10MG
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D5025-15KU	Dnase I
二甲基亚砜	Sigma	D8418-100ML	DMSO
一次性乙烯基标本模具	Sakura Tissue-Tek Cryomold	4565	10 mm × 10 mm × 5 mm
杜氏磷酸盐缓冲液 10X，改良型，不含氯化钙和氯化镁，液体，无菌过滤，适用于细胞培养	Sigma	D1408-500ML	DPBS
Dumont #5 镊子	Fine science tools	11254-20
胎牛血清（FBS）	Sigma	F9026-500ML
Fluoromount-G 封片液	Southern Biotech	0100-01	封片液
GFAP	DAKO	Z0334
羊抗小鼠 IgG1 二抗，Alexa Fluor 555 标记	ThermoFisher Scientific	A-21127	羊抗小鼠 IgG1，Alexa 555 二抗
羊抗小鼠 IgG2a 二抗，Alexa Fluor 555 标记	ThermoFisher Scientific	A-21137	羊抗小鼠 IgG2a，Alexa 555 二抗
Gpr161	自制	N/A
人 bFGF	Sigma	F0291	FGF
血细胞计数板	Hausser Scientific	0.100 mm 深度	改进型 Neubauer 计数板
Isothesia	Henry Schein	NDC 11695-0500-2	异氟烷
Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤基底膜来源层粘连蛋白	Sigma	L2020	层粘连蛋白
L-谷氨酰胺（200 mM）	Sigma	G7513
Lipofectamine 3000 转染试剂	ThermoFisher Scientific	L3000
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0036
N-2 添加剂（100X）	ThermoFisher Scientific	17502001	N2
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
OCT 包埋剂	Sakura Tissue-Tek	4583	OCT
青霉素-链霉素	Sigma	P4333-100ML
聚-L-赖氨酸（PLL）	Sigma	P4707
重组人 EGF 蛋白，CF	R and D systems	236-EG-200	EGF
剪刀	Fine science tools	14060-10
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher scientific	12-550-15	载玻片
吐温 X-100	Bio-Rad	161-0407
胰蛋白酶-EDTA 溶液（10X）	Sigma	T4174-100	胰蛋白酶
COSTAR 6 孔板，带盖，平底，超低吸附表面聚苯乙烯，无菌	Corning	3471	超低吸附 6 孔板
β-微管蛋白 III	Covance	MMS-435P	TUJ1