初级纤毛在神经前体细胞增殖、神经元分化以及成年神经元功能中具有根本性的重要作用。本文中，我们描述了一种利用原代神经球培养体系研究神经干细胞/前体细胞及分化神经元中纤毛形成过程以及信号蛋白向纤毛转运的方法。
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本文内容
摘要
摘要
初级纤毛在胚胎期、出生后及成体生命过程中神经干细胞/前体细胞的增殖以及神经元分化中具有根本性的重要作用。此外，大多数已分化的神经元均具有初级纤毛，其内含有信号受体（如G蛋白偶联受体）和信号分子（如腺苷酸环化酶）。初级纤毛决定了多种发育通路的活性，包括在胚胎神经元发育过程中音猬因子（sonic hedgehog）信号通路的调控，同时在成体神经元功能中发挥促进细胞内区室化信号传导的作用。毫不意外的是，初级纤毛的生成与功能缺陷已被证实与脑部发育异常、中枢性肥胖以及学习和记忆障碍相关。因此，迫切需要在神经干细胞/前体细胞和已分化神经元的背景下研究初级纤毛的生成及纤毛内物质运输。然而，原代神经元的培养方法需要较高的专业技术，且不适用于冻融循环。在本实验方案中，我们介绍了利用原代神经球培养混合群体神经干细胞/前体细胞的方法。基于神经球的培养方法兼具多种优势：可进行多次传代和冻融操作，具备向神经元和胶质细胞分化的潜能，并可进行转染操作。重要的是，我们发现来源于神经球的神经干细胞/前体细胞及分化后的神经元在体外培养中均具有纤毛结构，并能将与纤毛功能相关的信号分子定位于这些区室中。利用此类培养体系，我们进一步描述了在神经干细胞/前体细胞及分化神经元中研究纤毛形成和纤毛运输的方法。这些基于神经球的研究方法使我们能够在神经干细胞/前体细胞和分化神经元的背景下，研究由纤毛调控的细胞信号通路，包括G蛋白偶联受体和音猬因子（sonic hedgehog）信号通路。
引言
初级纤毛是一种基于微管的动态亚细胞区室，在协调细胞信号通路（包括胚胎神经元发育过程中的Sonic Hedgehog（Shh）通路1,2）以及成年神经元功能中的区室化亚细胞信号传导3,4中发挥感觉天线的作用。这些通路的信号组分，如Shh受体Patched5、通路激活因子Smoothened（Smo）6，以及负向调控Shh通路的孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）Gpr1617，均以动态方式定位于纤毛中。已有多个GPCR被报道可在脑内神经元的纤毛中定位7,8,9,10,11,12,13,....
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方案
1. 从小鼠成年脑中分离神经球
- 使用过量异氟烷处死一只成年小鼠（约2个月大）。确认小鼠呼吸已停止后，立即进行解剖。
- 使用剪刀沿中线切开颅骨，取出脑组织。
- 将脑组织置于盛有冰冷PBS的10 cm培养皿中，并置于冰上。按照全组织解剖法从侧脑室获取SVZ组织48。
- 将侧脑室放入1.5 mL离心管中，加入500 µL含0.05%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，于37 °C水浴中孵育15分钟。
- 孵育15分钟后，加入500 µL终止培养基，用1 mL枪头轻柔吹打20–30次。吹打过程中避免产生气泡。
注意：此步骤对细胞存活至关重要。 - 以500 × g离心8分钟，弃上清液，加入1 mL PBS，用1 mL枪头轻柔吹打5次重悬细胞。
- 再次以500 × g离心8分钟，用1 mL枪头吸除上清液，加入1 mL基础培养基。
- （可选）若观察到细胞碎片，可通过70 µm细胞筛过滤细胞悬液。
- 使用血细胞计数板计数细胞；通常每SVZ可获得约30,000–60,000个细胞。
- 将一个SVZ来源的细胞接种至10 cm培养皿中，加入10 mL NSC培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养。
- （可选）为避免神经球融合49
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结果
将室管膜下区（SVZ）细胞接种于神经干细胞培养基中培养一周后，观察到悬浮生长的神经球（图2A）。神经球的大小在50至200 µm之间不等。为了检测这些神经球是否来源于神经干细胞/前体细胞，将神经球接种于多聚赖氨酸（PLL）和层粘连蛋白（Laminin）包被的盖玻片上，在神经干细胞培养基中培养2天，随后对神经干细胞/前体细胞标志物Nestin进行免疫染色。培养2天以使神经球充分贴附于盖玻片并以单层细胞形式生长。免疫染色结果显示，该单层细胞呈Nestin阳性（图2B）。为了检测神经球的多向分化潜能，按照第2节所述步骤，将神经球直接接种于PLL和Laminin包被的盖玻片上，置于分化培养基中，不进行消化解离，培养7–10天。分化过程至少需要一周时间。神经球贴附于盖玻片后扩展形成单层细胞。固定细胞后，分别对神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物进行免疫染色。结果显示，贴壁的神经球可分化为β-Tubulin III阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞以及O4阳性的少突胶质细胞（图2C–E
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讨论
本文介绍了一种从成年小鼠侧脑室下区（SVZ）建立并维持神经球培养的方法。关于这些培养物，有以下几点需要注意。首先，神经球的大小通常在50 - 200 µm之间。根据我们的经验，当神经球直径超过300 µm时，已错过传代的最佳时机，这些较大的神经球中心会含有死亡细胞。其次，由于神经球常用于研究神经干细胞/前体细胞，因此使用EGF和基础成纤维细胞生长因子（bFGF）以维持这些细胞的干性至关重要。因此，在神经球的维持过程中必须避免使用诱导分化的因子，如胎牛血清（FBS）。已有研究表明，10% FBS可诱导神经球分化为星形胶质细胞47。第三，神经球向神经元分化的程度可能取决于小鼠的年龄；若希望获得更强的神经元分化能力，可使用更年轻的幼鼠（出生后第0天）。第四，若建立新的培养体系，始终建议检测神经球的分化潜能。第五，本方法还允许将已建立的神经球培养物冻存，并在将来实验中复苏使用。复苏后，细胞通常以贴壁的梭形细胞形式生长，无需使用多聚-L-赖氨酸或多层粘连蛋白。这可能是由于冻融过程对细胞造成了损伤。重要的是，在传代前应持续培养细胞至融合度达到60 - 80%。传代后，细胞通常重新形成神经球，并可连续传.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
S.M. 实验室的工作由 CPRIT（R1220）和 NIH（1R01GM113023-01）的人才引进资助项目提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 mm 圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24 孔板 | Falcon | 353047 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352098 | |
| 95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖 | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm 培养皿 |
| 70 µm 细胞筛 | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure 驴抗兔 IgG（H+L） | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | 驴抗兔 Alexa 488 二抗 |
| Arl13B，克隆 N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 添加剂（50X），无血清 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| 离心机 | Thermo scientific | ST 40R | |
| 冻存管 | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| 一次性乙烯基标本模具 | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm × 10 mm × 5 mm |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 10X，改良型，不含氯化钙和氯化镁，液体，无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 镊子 | Fine science tools | 11254-20 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G 封片液 | Southern Biotech | 0100-01 | 封片液 |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| 羊抗小鼠 IgG1 二抗，Alexa Fluor 555 标记 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | 羊抗小鼠 IgG1，Alexa 555 二抗 |
| 羊抗小鼠 IgG2a 二抗，Alexa Fluor 555 标记 | ThermoFisher Scientific | A-21137 | 羊抗小鼠 IgG2a，Alexa 555 二抗 |
| Gpr161 | 自制 | N/A | |
| 人 bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 0.100 mm 深度 | 改进型 Neubauer 计数板 |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | 异氟烷 |
| Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤基底膜来源层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | 层粘连蛋白 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 添加剂（100X） | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT 包埋剂 | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333-100ML | |
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma | P4707 | |
| 重组人 EGF 蛋白，CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| 剪刀 | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher scientific | 12-550-15 | 载玻片 |
| 吐温 X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液（10X） | Sigma | T4174-100 | 胰蛋白酶 |
| COSTAR 6 孔板，带盖，平底，超低吸附表面聚苯乙烯，无菌 | Corning | 3471 | 超低吸附 6 孔板 |
| β-微管蛋白 III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
参考文献
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet.
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