本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。
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本文内容
摘要
摘要
肝脏在调控全身性炎症中起着决定性作用。特别是在慢性肾病中，肝脏会因尿毒症环境、氧化应激、内毒素血症以及循环促炎细胞因子清除能力下降而产生大量急性期反应物。研究炎症及其肝细胞基础作用的实验工具，对于理解肝脏细胞因子在全身急性期反应及持续性促炎状态中的调控机制和贡献至关重要，尤其是在慢性肾病这样复杂的病理背景下。由于在活体（in vivo）条件下研究炎症的复杂机制仍面临挑战，且资源消耗大，通常还需使用转基因动物，因此原代分离的肝细胞成为研究肝脏急性期反应机制的有力工具。由于这种体外（in vitro）技术成本适中、可重复性高，并基于常规技术知识，原代分离肝细胞也可被便捷地用于筛选研究。本文介绍了一种基于酶解法分离原代小鼠肝细胞的方法，并描述了利用酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量实时聚合酶链式反应（qPCR）评估这些细胞中炎症反应的技术流程。
引言
慢性肾脏病（CKD）可被定义为一种急性和慢性炎症状态1。在CKD患者中，为维持血清磷稳态，磷调节激素成纤维细胞生长因子23（FGF23）的血清水平进行性升高2。升高的血清FGF23水平与开始接受血液透析治疗的患者心血管疾病发病率和死亡率独立相关3,4。此外，多项临床研究显示，FGF23水平升高与血清C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）水平之间存在显著相关性5,6。而且，在一项实验研究中，我们最近证实FGF23可直接作用于肝细胞，通过增加肝脏中CRP和IL-6的产生引发炎症反应7。因此，FGF23可能作为一种循环因子，参与CKD中的全身性炎症过程。
20世纪70年代初，人们首次分离并研究了原代肝细胞8。自此以后，原代培养的肝细胞被广泛用于研究代谢过程、激素功能、药物代谢与毒性，以及免疫和炎症反应9,10....
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方案
所有动物实验方案和实验操作均经迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 准备
- 将肝脏灌注培养基和肝脏消化培养基在37 °C水浴中预热。
- 设置灌注泵（30 mL/min）。小心地用肝脏灌注培养基预先充满泵的管路系统，避免系统中产生任何气泡，并准备好体视显微镜。
- 根据制造商说明书，使用I型胶原对细胞培养皿进行包被。
2. 肝脏恢复
- 使用氧气/异氟烷吸入法对供体小鼠进行麻醉（异氟烷 4%/氧气 2 L/min）。
- 通过将异氟烷浓度降低至 2–2.5%，或通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 体重）来维持麻醉状态。优先选择持续使用异氟烷麻醉，因为氯胺酮可导致血压降低并可能引起肝毒性。
- 将麻醉后的小鼠置于吸水垫上，并用胶带固定其四肢。
- 剃除小鼠腹部毛发并进行消毒，使用尖/钝头手术剪从耻骨至肝脏颅侧边界进行腹正中切口。在膈肌尾侧向两侧切开腹壁。
- 将肠道小心移至右侧以暴露下腔静脉（IVC）。使用无菌棉签和弯头镊子仔细剥离下腔静脉周围的脂肪组织。
- 使用尖/尖头精细手术剪在两侧做侧向切口，切开膈肌上部并打开胸腔....
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结果
组织学
原代分离并培养的细胞的代表性光学显微镜图像见图1A。免疫细胞化学分析显示，分离的肝细胞高表达白蛋白（红色）以及成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）（绿色）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色）。（图1B）。
定量实时 PCR
分离培养的原代肝细胞用 FGF23（25 ng/mL）、LPS（100 µg/mL）或 IL-6（50 ng/mL）处理 24 小时，通过定量实时 PCR 检测 CRP 和 IL-6 的 mRNA 水平。FGF23、LPS 和 IL-6 均显著上调了 CRP 和 IL-6 的表达。（图.......
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讨论
从小鼠中分离原代肝细胞是一种快速、经济且可靠的工具，用于在体外研究炎症反应。ex vivo。如果操作正确，可在及时且成本效益高的条件下轻松获得可重复的结果。为确保成功分离，应仔细评估以下要点。
手术切口和下腔静脉插管应在全身麻醉下进行，而非在安乐死后进行。年轻的、缺乏经验的研究人员在初期需要更多时间来熟悉小鼠腹部的解剖结构，并掌握正确的插管技术。在灌注开始前保持供体动物存活，将显著提高分离细胞的存活率。应结扎肝上段下腔静脉，因为这将显著提高分离肝细胞的得率。 alternatively，也可使用显微外科夹夹闭下腔静脉。然而，在开胸后，动物将在数分钟内死亡。因此，所有后续步骤应迅速进行，以确保肝脏在灌注开始前维持足够的血流。对于插管操作，强烈推荐使用可回缩的静脉留置针。插入下腔静脉后，可小心地回撤针芯，从而最大限度降低血管穿孔的风险。最后的关键步骤是将灌注系统连接至留置针。在将针头从留置针中取出后，连接灌注泵前，应观察到血液从留置针末端流出。此步骤可最大限度降低空气栓塞的风险，避免导致分离细胞的数量和质量显著下降。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01HL128714，授予C.F.）和（项目号F31DK10236101，授予K.S）以及美国心脏协会（C.F. 和 A.G.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材 | |||
| 70 μm 尼龙细胞滤网 | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL 聚丙烯离心管 | Falcon | 352098 | |
| 100 根 6 英寸棉签应用棒 | Puritan | 806-WC | |
| 1 cc U-100 胰岛素注射器 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| 组织培养皿 100 x 20 mm 型 | Corning | 353003 | |
| 6 孔细胞培养板 | Costar | 3516 | |
| 5/0 黑色编织外科缝合丝线（100 码） | LOOK | SP115 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| Minipuls 3 灌注泵 | Gilson | F155007 | |
| 血细胞计数仪套装，Propper | VWR | 48300-474 | |
| 血细胞计数仪盖玻片，Propper | VWR | 48300-470 | |
| 手术剪刀 - 尖头/钝头 | F.S.T. | 14001-12 | |
| 虹膜剪刀 - ToughCut 直型 | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 镊子 | F.S.T. | 11203-25 | |
| 学生用组织镊 | F.S.T. | 991121-12 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 试剂 | |||
| 乙酸溶液，2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| 异氟烷，USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| 赛拉嗪 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Williams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| 肝脏灌注培养基 (1x) | gibco | 17701-038 | |
| 肝脏消化培养基 (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| 原代肝细胞解冻与接种添加剂 | Life Technologies | CM3000 | |
| 原代肝细胞维持添加剂 | Life Technologies | CM4000 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Ⅰ型胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| 台盼蓝溶液 | VWR | 45000-717 |
参考文献
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth f....
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重印与许可
