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方法文章

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

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DOI：

10.3791/55319

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2017年3月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Family Drug Discovery Center and Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Anatomy, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。

摘要

肝脏在调控全身性炎症中起着决定性作用。特别是在慢性肾病中，肝脏会因尿毒症环境、氧化应激、内毒素血症以及循环促炎细胞因子清除能力下降而产生大量急性期反应物。研究炎症及其肝细胞基础作用的实验工具，对于理解肝脏细胞因子在全身急性期反应及持续性促炎状态中的调控机制和贡献至关重要，尤其是在慢性肾病这样复杂的病理背景下。由于在活体（in vivo）条件下研究炎症的复杂机制仍面临挑战，且资源消耗大，通常还需使用转基因动物，因此原代分离的肝细胞成为研究肝脏急性期反应机制的有力工具。由于这种体外（in vitro）技术成本适中、可重复性高，并基于常规技术知识，原代分离肝细胞也可被便捷地用于筛选研究。本文介绍了一种基于酶解法分离原代小鼠肝细胞的方法，并描述了利用酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量实时聚合酶链式反应（qPCR）评估这些细胞中炎症反应的技术流程。

引言

慢性肾脏病（CKD）可被定义为一种急性和慢性炎症状态1。在CKD患者中，为维持血清磷稳态，磷调节激素成纤维细胞生长因子23（FGF23）的血清水平进行性升高2。升高的血清FGF23水平与开始接受血液透析治疗的患者心血管疾病发病率和死亡率独立相关3,4。此外，多项临床研究显示，FGF23水平升高与血清C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）水平之间存在显著相关性5,6。而且，在一项实验研究中，我们最近证实FGF23可直接作用于肝细胞，通过增加肝脏中CRP和IL-6的产生引发炎症反应7。因此，FGF23可能作为一种循环因子，参与CKD中的全身性炎症过程。

20世纪70年代初，人们首次分离并研究了原代肝细胞8。自此以后，原代培养的肝细胞被广泛用于研究代谢过程、激素功能、药物代谢与毒性，以及免疫和炎症反应9,10。以往的实验方案主要描述了从人肝组织中通过酶法分离原代肝细胞的方法11,12。尽管这是一个优秀的模型，但它无法用于研究基因操作对复杂的肝细胞信号转导机制的影响，以及对不同类型刺激所产生的功能后果。下文所述为小鼠原代肝细胞的分离方法。值得注意的是，肝脏急性期反应的多种介质（如脂多糖（LPS）、IL-6和FGF23）的作用可由此方法以简便、快速且可重复的方式进行分析13。

本文介绍了一种从成年小鼠中酶法分离肝细胞的实验方案，并证明了已知的炎症诱导因子（如LPS和IL-6）以及新型炎症介质（如FGF23）均可直接刺激培养肝细胞中炎症细胞因子（如CRP和IL-6）的表达与分泌。

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方案

所有动物实验方案和实验操作均经迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 准备

  1. 将肝脏灌注培养基和肝脏消化培养基在37 °C水浴中预热。
  2. 设置灌注泵（30 mL/min）。小心地用肝脏灌注培养基预先充满泵的管路系统，避免系统中产生任何气泡，并准备好体视显微镜。
  3. 根据制造商说明书，使用I型胶原对细胞培养皿进行包被。

2. 肝脏恢复

  1. 使用氧气/异氟烷吸入法对供体小鼠进行麻醉（异氟烷 4%/氧气 2 L/min）。
    1. 通过将异氟烷浓度降低至 2–2.5%，或通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 体重）来维持麻醉状态。优先选择持续使用异氟烷麻醉，因为氯胺酮可导致血压降低并可能引起肝毒性。
  2. 将麻醉后的小鼠置于吸水垫上，并用胶带固定其四肢。
  3. 剃除小鼠腹部毛发并进行消毒，使用尖/钝头手术剪从耻骨至肝脏颅侧边界进行腹正中切口。在膈肌尾侧向两侧切开腹壁。
  4. 将肠道小心移至右侧以暴露下腔静脉（IVC）。使用无菌棉签和弯头镊子仔细剥离下腔静脉周围的脂肪组织。
  5. 使用尖/尖头精细手术剪在两侧做侧向切口，切开膈肌上部并打开胸腔。使用外科缝线（5/0）结扎胸段下腔静脉。
  6. 使用带护套的静脉导管插管肾下段下腔静脉，小心拔出针芯，连接灌注泵并开始肝脏灌注。若操作正确，肝脏应立即开始变白并肿胀。
  7. 使用精细手术剪切断门静脉，以便血液和灌注液充分引流。
  8. 用约 30 mL 肝脏灌注液灌注肝脏，随后更换为肝脏消化液（30 mL）。灌注完成后关闭灌注泵并移除导管。
  9. 轻柔暴露肝脏中央区域，找到连接肝叶的结缔组织。夹住中央连接纤维，仔细分离所有固定肝脏的组织，并轻柔取出肝脏。
  10. 立即将肝脏转移至含有 15 mL 肝脏消化液的 50 mL 聚丙烯锥形管中。
    注意： 此步骤无特定时间要求。灌注完成后，肝脏在消化液中保存并运送至无菌细胞培养操作台。 所有后续步骤均应在无菌环境中进行。

3. 细胞的分离与处理

  1. 在细胞培养罩内，将含有消化液的50 mL聚丙烯圆锥管中的肝脏转移至无菌组织培养皿中。
  2. 使用无菌镊子轻轻撕裂肝脏的四个叶。若操作得当，由于肝细胞从肝脏中分离，消化液将变得浑浊。
  3. 使用25 mL无菌移液管尖端，将浑浊的消化液通过70 µm尼龙细胞滤器过滤至新的50 mL聚丙烯圆锥管中，以去除未消化的组织颗粒和细胞碎片。
  4. 使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重复步骤3.2和3.3。这有助于清除肝脏中残留的肝细胞。
  5. 在4 °C下以50 × g离心2分钟。吸除含有过量细胞碎片的上清液，并将细胞轻柔重悬于25 mL冷的1× Williams' 培养基E中。
  6. 使用25 mL无菌移液管尖端，将重悬液通过新的70 µm尼龙细胞滤器过滤至50 mL聚丙烯圆锥管中，以获得更纯净的细胞悬液。
  7. 使用冷的1× Williams' 培养基E重复步骤3.5和3.6，再进行三次洗涤，以获得更澄清的细胞悬液。
  8. 最后一次洗涤后，吸除上清液以去除过量细胞碎片。将细胞重悬并用25 mL温的1× Williams' 培养基E（含原代肝细胞解冻与接种补充剂）通过新的70 µm尼龙细胞滤器过滤至50 mL聚丙烯圆锥管中。
  9. 使用血细胞计数板对25 mL细胞悬液中的细胞进行计数。平均每成人肝脏可获得1500万至2000万个细胞。使用台盼蓝染色法测定细胞活力。
  10. 将细胞接种于含原代肝细胞解冻与接种补充剂的2 mL 1× Williams' 培养基E中，接种至胶原包被的6孔细胞培养板（每孔9×105个细胞）。
  11. 4小时后，更换为含原代肝细胞维持补充剂的1× Williams' 培养基E。
  12. 24小时后，使用无血清的1× Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）对细胞进行血清饥饿处理6小时。
  13. 在无血清培养基中，以PBS作为溶剂对照，或加入FGF23（25 ng/mL）、LPS（100 µg/mL）或IL-6（50 ng/mL）处理细胞，并孵育24小时。

4. RNA 的提取

  1. 根据制造商说明书，使用商用离心柱试剂盒制备RNA。

5. 通过逆转录从分离的RNA生成cDNA

  1. 向PCR管中加入200 ng的分离RNA样品。
  2. 向步骤5.1中的PCR管中加入14 µL无核酸酶的H2O。
  3. 向步骤5.1中的PCR管中加入4 µL逆转录酶。
  4. 轻轻重悬内容物以使混合物均匀；短暂离心。
  5. 将含有混合物的PCR管放入热循环仪中。运行逆转录程序：25 °C（5分钟）、42 °C（30分钟）、85 °C（5分钟）各1个循环，然后保持在4 °C。最终产物即为所需的cDNA。

6. 通过定量实时 PCR（qPCR）对细胞进行分析

  1. 准备 96 孔板。
    1. 将 qPCR 反应的所有组分置于冰上：1 µL cDNA、0.25 µM 正向引物、0.25 µM 反向引物、5 µL SYBR Green、3.5 µL PCR 级水，总体积为 10 µL。使用 SYBR Green 配制主混合液，以对所有样品进行三复孔检测。
    2. 主混合液配制完成后，涡旋振荡使其均匀。将 9 µL qPCR 主混合液分装至 96 孔板的每个孔中。随后，小心向每孔加入 1 µL cDNA。总反应体积为 10 µL。
    3. 加样完成后，用光学粘性封膜密封 96 孔板，并短暂离心（50 × g，1 分钟）。
  2. 在实时 PCR 仪器中运行样品。将密封的 96 孔板放入实时 PCR 仪器中，并按照仪器制造商的建议运行样品。以下提供了标准循环和快速循环的示例。
    1. 对于标准循环参数，使用以下条件：94 °C 初始变性 120 秒，然后进行 40 个循环（94 °C 15 秒，60 °C 60 秒），之后可选择在 4 °C 保存。
    2. 对于快速循环参数：使用以下条件：94 °C 初始变性 30 秒，然后进行 40 个循环（95 °C 5 秒，58 °C 15 秒，72 °C 10 秒）。
  3. 请参考仪器说明书以获取数据分析的指导。

7. 通过 ELISA 分析细胞上清液

注意：所有步骤均按照制造商的说明书进行。

  1. 样品制备
    1. 将398 µL稀释液分别加入不同的离心管中。用移液器将2 µL细胞上清液样品加入含398 µL稀释液的离心管中。此操作可实现200倍的稀释倍数。
    2. 对每个待测样品重复步骤7.1.1。
  2. 操作步骤
    1. 将100 µL经200倍稀释的样品和标准品分别加入96孔板的孔中。
    2. 将96孔板置于微孔板振荡器上，在25 °C下以150 rpm振荡孵育45分钟。
    3. 用1×洗涤缓冲液洗涤各孔5次。最后一次 洗涤完成后，用吸水纸彻底去除残留的洗涤液。
    4. 向每个孔中加入500 µL HRP标记的试剂。
    5. 重复步骤7.2.2至7.2.3。
    6. 向96孔板的每个孔中加入100 µL四甲基联苯胺（TMB）试剂。
    7. 将96孔板置于微孔板振荡器上，在25 °C下以150 rpm轻柔振荡混合20分钟。向每孔直接加入100 µL终止液以终止反应，并轻柔混匀。加入终止液后，溶液颜色应变为黄色，表明终止液已充分混匀。
    8. 使用酶标仪，在加入终止液后的前5分钟内测定450 nm处的光密度值。
  3. 结果计算
    1. 计算每个样品和每个标准品的平均吸光度值（A450）表格。
    2. 通过将每个标准品的A450均值对其标准浓度（单位：ng/mL）作图，绘制标准曲线。以横轴表示浓度，纵轴表示A450值。
    3. 根据每个稀释样品的A450均值，利用标准曲线确定目标蛋白的浓度（单位：ng/mL）。
    4. 将样品浓度乘以稀释倍数，从而计算出细胞上清液样品中目标蛋白的实际浓度。
    5. 将样品所得数据表绘制成折线图。若OD450值超出标准曲线范围，应对样品进行适当稀释后重新检测。
    6. 将结果归一化至500,000个细胞。

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结果

组织学

原代分离并培养的细胞的代表性光学显微镜图像见图1A。免疫细胞化学分析显示，分离的肝细胞高表达白蛋白（红色）以及成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）（绿色）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色）。（图1B）。

定量实时 PCR

分离培养的原代肝细胞用 FGF23（25 ng/mL）、LPS（100 µg/mL）或 IL-6（50 ng/mL）处理 24 小时，通过定量实时 PCR 检测 CRP 和 IL-6 的 mRNA 水平。FGF23、LPS 和 IL-6 均显著上调了 CRP 和 IL-6 的表达。（图...

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讨论

从小鼠中分离原代肝细胞是一种快速、经济且可靠的工具，用于在体外研究炎症反应。ex vivo。如果操作正确，可在及时且成本效益高的条件下轻松获得可重复的结果。为确保成功分离，应仔细评估以下要点。

手术切口和下腔静脉插管应在全身麻醉下进行，而非在安乐死后进行。年轻的、缺乏经验的研究人员在初期需要更多时间来熟悉小鼠腹部的解剖结构，并掌握正确的插管技术。在灌注开始前保持供体动物存活，将显著提高分离细胞的存活率。应结扎肝上段下腔静脉，因为这将显著提高分离肝细胞的得率。 alternatively，也可使用显微外科夹夹闭下腔静脉。然而，在开胸后，动物将在数分钟内死亡。因此，所有后续步骤应迅速进行，以确保肝脏在灌注开始前维持足够的血流。对于插管操作，强烈推荐使用可回缩的静脉留置针。插入下腔静脉后，可小心地回撤针芯，从而最大限度降低血管穿孔的风险。最后的关键步骤是将灌注系统连接至留置针。在将针头从留置针中取出后，连接灌注泵前，应观察到血液从留置针末端流出。此步骤可最大限度降低空气栓塞的风险，避免导致分离细胞的数量和质量显著下降。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01HL128714，授予C.F.）和（项目号F31DK10236101，授予K.S）以及美国心脏协会（C.F. 和 A.G.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
耗材
70 μm 尼龙细胞滤网Falcon352350
BD Insyte AutoguardBD381412
50 mL 聚丙烯离心管Falcon352098
100 根 6 英寸棉签应用棒 Puritan806-WC
1 cc U-100 胰岛素注射器 28 G 1/2Becton Dickinson329420
组织培养皿 100 x 20 mm 型Corning353003
6 孔细胞培养板Costar3516
5/0 黑色编织外科缝合丝线（100 码）LOOKSP115
名称公司目录编号备注
设备
Minipuls 3 灌注泵GilsonF155007
血细胞计数仪套装，PropperVWR48300-474
血细胞计数仪盖玻片，PropperVWR48300-470
手术剪刀 - 尖头/钝头F.S.T.14001-12
虹膜剪刀 - ToughCut 直型F.S.T.14058-11
Dumont SS-45 镊子F.S.T.11203-25
学生用组织镊F.S.T.991121-12
名称公司目录编号备注
试剂
乙酸溶液，2.0 NSigma    A8976-100ML
异氟烷，USP 250 mLPiramal Healthcare   66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)VEDCO    50989-161-06
赛拉嗪 100 mg/mLAnaSed Injection139-236
Williams' Medium E (1x)gibco12551-032
肝脏灌注培养基 (1x)gibco17701-038
肝脏消化培养基 (1x)Life Technologies17703034
原代肝细胞解冻与接种添加剂Life TechnologiesCM3000
原代肝细胞维持添加剂Life TechnologiesCM4000
磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4ThermoFisher scientific10010031
Ⅰ型胶原蛋白Corning354236
台盼蓝溶液VWR45000-717

参考文献

  1. Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
  2. Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
  3. Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
  4. Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
  5. Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
  6. Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).
  7. Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
  8. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  9. Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
  10. Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
  11. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
  12. Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
  13. Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
  14. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  15. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  16. Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
  17. Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
  18. Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).

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