小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

摘要

我们展示了一种技术 体内 在SJL/J小鼠多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中进行视神经炎和脑炎的活体生物发光与近红外成像。

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）在SJL/J小鼠中是复发-缓解型多发性硬化症（RRMS）的模型。描述运动功能缺陷的临床EAE评分是脊髓免疫介导炎症的基本读数。然而，评分和体重无法提供 体内 评估脑部炎症和视神经炎。后者在约2/3的多发性硬化症患者中是一种早期且常见的表现。本文展示了利用生物发光和近红外活体成像技术，在活体小鼠中评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）诱发的视神经炎、脑部炎症以及血脑屏障（BBB）破坏的方法。 体内 成像系统。由氧化酶激活的生物发光底物主要显示视神经炎。该信号具有特异性，可实现对药物效应和疾病进程的可视化，且与临床评分相一致。采用在血管内停留较长时间的聚乙二醇化荧光纳米颗粒评估血脑屏障（BBB）完整性。近红外成像在疾病高峰期检测到BBB渗漏，信号在眼部周围最强。使用基质金属蛋白酶的近红外底物评估EAE诱导的炎症反应。自发荧光干扰了信号检测，需通过光谱分离进行定量分析。总体而言，生物发光成像是一种可靠的方法，可用于评估EAE相关的视神经炎及药物效应，在信号特异性、稳健性、定量便捷性和成本方面均优于近红外成像技术。

引言

多发性硬化症是由自身免疫介导的对脑和脊髓中髓鞘的攻击与破坏所引起的¹。该病在女性中的年总发病率为每10万人中约3.6例，在男性中约为2.0例，是继创伤性损伤之后导致青壮年神经功能障碍的第二大常见原因^2,3。多发性硬化症的疾病病理机制受到遗传和环境因素的共同影响⁴，但目前尚未被完全阐明。自身反应性T淋巴细胞进入中枢神经系统，触发炎症级联反应，导致脑、脊髓和视神经白质区域出现局灶性浸润。在大多数情况下，这些浸润最初是可逆的，但随着复发次数的增加，病变持续存在的可能性也随之上升。目前已开发出多种啮齿类动物模型用于研究该疾病的病理过程。其中，SJL/J小鼠的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型和C57BL6小鼠的原发进展型EAE模型是最常用的两种模型。

临床EAE评分（描述运动功能缺损程度）和体重是评估EAE严重程度的金标准。这些临床表现与脊髓中免疫细胞浸润和髓鞘破坏的程度相一致，并可在一定程度上预测药物治疗在人类中的疗效。⁵然而，这些体征主要反映的是脊髓腹侧纤维束的损伤。目前尚无一种简便、无创、可靠且可重复的方法来评估 体内 活体小鼠脑部浸润和视神经炎

方案

1. SJL/J 小鼠中 EAE 的诱导

1. 小鼠
   1. 使用11周龄的雌性SJL/J小鼠，每组n = 10只，置于实验室内适应约7天。
   2. 为评估药物效果，自免疫后3或5天开始，通过饮水或食物颗粒持续给予实验组药物，对照组给予安慰剂（每组n=10）。在疾病高峰期，通过牛奶或含3%蔗糖水浸泡的玉米片给予药物或安慰剂。
2. 免疫材料
   1. 使用EAE诱导试剂盒，其中包含抗原（髓鞘蛋白脂质蛋白肽段PLP139-151，1 mg/mL乳剂），该抗原与完全弗氏佐剂（CFA，含热灭活的结核分枝杆菌H37 Ra）乳化，并配有2瓶冻干百日咳毒素（PTX，每瓶5 µg）。
   2. 将紫杉醇（PTX，2 µg/mL）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS； 即， 向每个PTX管中加入1.5 mL PBS，充分混匀，用同一枪头移出，并加入含有1 mL PBS的50 mL管中；充分混匀。
3. 免疫接种
   1. 在尾根部皮下分两处注射PLP/CFA，每处100 µL。避免注射至颈部背部，因为上背部或颈部皮肤的任何免疫反应将干扰头部和脊髓的成像。
   2. 在免疫后1-2小时及24小时，每只小鼠腹腔注射（i.p.）PTX 100 µL，共两次。
   3. 对照小鼠注射不含PLP的C....

结果

视神经炎生物发光的时间进程

炎症探针的生物发光信号在眼睛周围最强，且仅出现在患有视神经炎的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中。未患EAE的小鼠或未注射炎症探针的小鼠均未出现信号。当小鼠恢复时，该信号消失。因此，该信号对视神经炎具有特异性，且信号峰值与临床EAE评分的峰值相一致。图1展示了SJL/J小鼠在诱导EAE后第10天和第14天成像的两个示例。生物发光信号在第10天达到最高，随后小鼠开始恢复时信号消失。临床评分的时间进程与生物发光信号的消失相吻合（示例-1），或早于评分的下降（示例-2）。

讨论

本视频展示了生物发光和近红外荧光的技术方法 体内 在SJL/J小鼠中进行EAE成像。我们显示，利用对炎症敏感的探针进行生物发光成像主要可检测到视神经炎，其定量结果与EAE严重程度的临床评估及药物治疗效果相一致。然而，该生物发光成像方法未能检测到腰段脊髓的炎症，而腰段脊髓是EAE表现的主要部位¹⁷，这可能是因为信号被脊柱吸收所致。

近红外成像灵敏度更高，但会受到较强自发荧光干扰，而生物发光则不存在这一问题。近红外成像的曝光时间（1 - 2 s）远短于生物发光成像（2 - 5 min），因此在信号强度快速变化的时间序列实验中，近红外成像是首选方法。

方案中的关键步骤及技术局限性

免疫接种部位的信号会干扰EAE中的脊髓成像，但通过将两个注射部位均置于尾根部，可避免这一问题，该注射位置的效果不逊于推荐的注射部位（颈部和尾根部）。然而，必须使用黑色布料遮盖注射部位。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	成像探针，聚乙二醇化纳米颗粒，用于血脑屏障完整性的成像
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	成像探针，可被基质金属蛋白酶激活，用于炎症成像
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	成像探针，可被氧化酶激活，用于炎症成像
PLP139-151/CFA 乳剂	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE 诱导试剂盒
百日咳毒素	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE 诱导试剂盒
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		生物发光与红外成像系统
LivingImage 4.5 软件	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS 分析软件
异氟烷	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	麻醉剂