本方案描述了泄殖腔按摩技术，这是一种用于采集鸟类精液的非侵入性手动方法，以及利用商业试剂盒并加以改进从鸟类精子中提取DNA的技术。
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本文内容
摘要
摘要
精液采集在多种研究中具有重要用途，包括涉及精子质量、精子端粒动态以及表观遗传学的研究。鸟类被广泛用于生物学研究，是进行重复精子取样研究的理想对象。然而，目前可供希望学习如何采集鸟类精子并从中提取DNA的研究人员参考的资源十分有限。本文介绍了泄殖腔按摩法，这是一种温和、非侵入性的手动技术，用于采集鸟类精子。尽管该技术在文献中已有记载，但仅凭现有描述往往难以掌握。我们还提供了使用商业化试剂盒并结合改进步骤从鸟类精液中提取DNA的具体方法。泄殖腔按摩法可便捷地应用于任何处于繁殖状态的小型至中型雄性鸟类。采集后的精液可立即用于精子活力检测，或按照本文所述方案冷冻保存以备后续DNA提取。本DNA提取流程针对鸟类精子进行了优化，已成功应用于多种雀形目鸟类（Passer domesticus、Spizella passerina、Haemorhous mexicanus 和 Turdus migratorius）以及一种鸠鸽科鸟类（Columba livia）的样本。
引言
鸟类是研究精子质量与竞争1、精子端粒动态2、表观遗传学3以及类似课题的理想对象，因其在生物学研究中被广泛应用，且可通过泄殖腔按摩法轻松采集精子。泄殖腔按摩是一种温和、非侵入性的手动采精技术4,5,6。该方法易于获取重复样本，且无需特殊工具，适合在野外或实验室中操作。尽管泄殖腔按摩已使用数十年，但仅凭现有的文字描述难以掌握。本出版物旨在缩短学习该技术所需的时间并减少学习过程中的不确定性。
通过泄殖腔按摩法采集的鸟类精液可立即用于活力评估4,7或人工授精8，也可冷冻保存以用于其他用途，如高级成像和DNA提取。雀形目鸟类的精液样本量较少，但含有高度密集的精子。为简化操作，可使用商业DNA提取试剂盒提取DNA，并对操作步骤进行适当修改，以克服精子特有的保护结构9。提取DNA后，可采用qPCR技术测定精子端粒长度10。
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方案
本方案涉及脊椎动物实验对象，并已获得北达科他州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 利用泄殖腔按摩法从雀形目鸟类采集精液
注意：泄殖腔按摩仅对具有生殖活性的鸟类是一种有效的精液采集技术，但在适当的圈养条件下，也可在繁殖季节之外成功实施。在使用泄殖腔按摩技术前，应先确定目标物种的生殖活动状态。该技术可用于捕获后的野生鸟类，也可用于圈养鸟类。
- 以雄鸟（处于繁殖状态）开始，用非惯用手以持鸟手法握住，然后将其转移到惯用手，使鸟的腹侧接触掌心（图1）。
- 确保鸟的头部靠近掌心的外侧边缘，用小指、无名指和中指轻轻固定头部和身体，使鸟的泄殖腔和尾部暴露出来。
- 鸟的双腿可保持松散或用掌心轻微固定。
图1：泄殖腔按摩操作手法。 用惯用手轻轻握住鸟类，使其腹面贴住掌心，小指固定头部。请点击此处查看此图的放大版本。
- 用优势手的食指和拇指分别置于泄殖腔上端两侧，轻轻捏合手指，同时向尾部施加轻微压力（图2）。泄殖腔将外翻，露出泄殖腔黏膜（粉红色内壁）。
注意：若鸟类当前未产生精液，泄殖腔突起可能较小，泄殖腔不易外翻。随着经验积累，可轻易区分生殖活跃期与非活跃期雄性个体的泄殖腔形态5,11。
图 2：手指位置与泄殖腔突起。 通过对手指上方末端施加轻微压力使泄殖腔外翻（A）。在生殖活跃期的雄性鸣禽中，泄殖腔突起明显且坚实（B）。请点击此处查看此图的放大版本。
- 用非优势手将食指指腹置于尾部基部背侧以固定手部，然后将拇指指尖置于外翻泄殖腔下方。
注意：短而光滑的指甲有利于进行泄殖腔按摩，并可防止鸟类意外受伤。 - 用非优势手的拇指在泄殖腔下方施加中等压力，反复向深部和头侧方向移动。持续操作直至鸟类射精。根据个体差异，通常需要1次至数十次按摩动作。
- 一旦鸟类射精，立即用微量血细胞比容管收集精液。可重复泄殖腔按摩以获取多次射精样本。
注意：鸣禽精液呈浅棕色，通常具有一定的黏稠度。从泄殖腔排出的白色或深色物质并非精液，可能污染精液样本。泄殖腔或精液中出现少量血液通常是由按摩时压力过大所致。 - 用于DNA提取时，将精液放入含20 µL 1×PBS（pH 7.4）的微量离心管中。注意：保存在1×PBS中的精液不适合人工授精，但若储存于-80 °C条件下，可用于日后DNA提取。PBS可为室温或预冷状态，但在加入精液样本时应保持液态。
- 取少量稀释后的样本在复式显微镜下观察，以确认样本中存在精子（图3）。
- 将稀释后的精液储存于-80 °C直至进行提取。
2. 从鸟类精液中提取DNA
注意：本实验方案已使用多种商业化的DNA提取试剂盒进行测试，但仅在使用某一种DNA试剂盒时获得成功12。相对于试剂盒说明书所修改的步骤以 * 标注。
- 配制1 M的二硫苏糖醇（DTT）水溶液，并用涡旋振荡器混匀。*
- 分装DTT溶液，并于-20℃保存20 °C 直至使用前立即取出。每个待提取的样本均需 10 µL 1 M DTT 溶液的
- 配制含有 20 mM Tris-Cl，pH 8.0；20 mM EDTA；200 mM NaCl；以及 4% SDS 的缓冲液。每个待提取的样品均需 90 µL 此缓冲液。*
- 将缓冲液置于室温保存。若出现沉淀，可将其升温至 56 °C 以溶解。*
- 将含有摇床或振荡器的培养箱预热至 65 °C.*
- 开始提取前立即混合 10 µL DTT 溶液与 90 µL 步骤2.2中制备的缓冲液，每份待提取样品需加入 例如 900 µL 缓冲液加 100 µL 若提取10个样本，则使用DTT溶液。该混合液称为DTT缓冲液。*
- 添加 70 µL 用涡旋振荡器将1x PBS与全部稀释后的精液样本充分混匀。*
- 添加 100 µL DTT缓冲液和 10 µL 向样品中加入蛋白酶K溶液。涡旋振荡20秒，然后在预热的培养箱中于摇床或振荡器上孵育1小时。*
- 添加 200 µL 缓冲液 AL 和 200 µL 新鲜乙醇（100%）涡旋20秒。*
- 将全部样品转移至离心柱中，6,000 x g 离心1分钟。弃去收集管。
- 将柱子置于新的离心管上并加入 500 µL 加入缓冲液 AW1，6,000 × g 离心 1 分钟。弃去收集管。
- 将柱子置于新离心管上并加入 500 µL 加入缓冲液AW2。在6,000 × g条件下离心1分钟。弃去穿流液，将吸附柱重新放回收集管中。
- 离心3分钟，20,000 × g。弃去收集管，将柱置于1.5 mL 微量离心管上。
- 移液器 35 µL 将AE缓冲液直接加入到离心柱膜上，在室温下孵育5分钟。*
- 离心1分钟，14,000 × g。弃去离心柱，将提取的样品储存于 -80 °C.
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结果
采用所述方案，已对多种雀形目鸟类及一种鸠鸽科鸟类进行泄殖腔按摩取精及DNA提取（表1）。通过泄殖腔按摩采集的精液样本中是否存在精子，已使用复合显微镜在400倍放大倍率下观察少量稀释样本予以确认（图3）。按照本文所述方案从家麻雀精液样本中提取DNA后，将八个样本与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳分析（图4中可见三个样本）。在全部八个样本的泳道中均观察到清晰条带且无拖尾现象，表明成功分离出高质量DNA。使用该方案提取的其余所有样本均采用分光光度计测定DNA浓度（见表1）。
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讨论
我们介绍一种简单且可靠的方法，用于采集处于繁殖活跃状态的小型和中型鸟类的精液，并从禽类精子中提取DNA。
所述精液DNA提取方案在试剂盒方法基础上进行了简化，但针对鸟类精液进行了优化。精子对标准提取试剂具有较强的抗裂解性9,13，且从雀形目鸟类采集的精液样本量通常较小（一般仅为几微升）。这些因素带来的挑战可通过使用适当浓度的DTT并在65 °C下孵育得以有效克服。采用该方法，我们 consistently 获得了可用于qPCR分析精子端粒长度的DNA量（通常为40 - 250 ng/µL，具体取决于射精体积）。
二硫苏糖醇（DTT）此前已被用于结合苯酚/氯仿反应从鸟类精子中提取DNA13。苯酚/氯仿反应在分离DNA方面效果良好，但耗时较长、危险性较高，且需要在通风橱中操作。本提取方案的一个显著局限性在于，其成功仅限于使用某一特定品牌和类型的提取试剂盒，这可能与起始...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
感谢 Jose Noguera 在泄殖腔按摩技术方面的早期协助，以及 Jeffrey Kittilson 提供的实验室支持。本研究工作由 ND EPSCoR 授予 BJH 的 FAR0022429 项目资助。论文发表费用由北达科他州立大学生物科学系慷慨支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微量血细胞比容毛细管 | Fisherbrand | 22-362566 | 可使用任意供应商的产品。对于采集少量精液样本（例如来自体型非常小的雀形目鸟类，如树雀鹀）而言，较小的毛细管可能更为有效。 |
| 微量离心管 | 任意 | ||
| 1× PBS | 任意 | 用于DNA提取前精液样本的储存。 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | 10708976001 | 可使用任意供应商的产品。 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | 可使用任意供应商的产品。 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | 可使用任意供应商的产品。 |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | 可使用任意供应商的产品。 |
| QIAamp DNA micro试剂盒 | Qiagen | 56304 | 特别推荐使用Qiagen公司的QIAamp DNA micro试剂盒。本DNA提取方案曾尝试使用其他商业试剂盒，但效果不佳。具体原因尚不明确。 |
参考文献
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重印与许可
