方法文章

分析细胞表面粘附重塑回应机械张力使用磁珠

DOI：

10.3791/55330

⸱

2017年3月8日

 ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞表面粘连是在机械传导的中心，因为它们传输机械张力，并开始参与组织稳态和发展的信号通路。这里，我们提出了解剖被响应于张力激活生化途径，使用包被配体 - 磁珠和施力到粘附受体的协议。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

机械敏感细胞表面粘附物使细胞感测与其周围环境的机械性能。最近的研究已经确定了在固定区域既力传感分子和调节谱系特异性基因表达和驱动表型输出力依赖性转录因子。然而，信令网络转换机械张力成生化途径仍然难以捉摸。探索时施加到细胞表面受体的机械张力接合的信号传导途径，可以使用超顺磁性微珠。在这里，我们提出了一个协议利用磁珠力量应用到细胞表面粘附蛋白。使用这种方法，可以通过安装在涂覆配体珠粘附复合物的磁隔离，调查通过各种生物化学方法不仅力依赖性细胞质信号传导途径，而且粘附重塑。这个协议包括配体 - 共聚的制备ated超顺磁珠，和应用程序中定义的拉力接着生物化学分析。此外，我们提供的数据表明应用于基于整合素的粘附张力的代表性样品触发粘附重塑和改变蛋白质的酪氨酸磷酸化。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在后生动物，机械张力通过细胞过程如增殖，分化和存活1,2无数的调节指导组织发育和内环境稳定。机械张力可以从细胞外基质产生，或可通过贴壁细胞，其样品通过拉动到细胞外基质，并通过张力敏感分子探测其刚性的肌动球蛋白收缩机械它们的胞外环境中产生的。为了应对紧张局势，机械敏感粘附蛋白发生触发复杂的信号级联反应的构象变化。反过来，这些信号传导途径编排一个mechanoresponse包含增殖，分化和存活是调节细胞行为到细胞外环境。这样的方法可以在短期时间周期进行结算（数秒至数分钟）快速反馈到机甲的环通过修改机械敏感结构notransduction。例如，基于整联粘连加强在通过的Rho GTP酶-介导的细胞骨架重构3，4，5响应于张力。与此同时，其他的信号通路超过几小时或几天来控制的遗传程序，最终影响细胞的命运6激活。然而，许多研究强调矩阵刚度对细胞确定性和疾病发展1,2的效果，粘附介导的机械传导的精确分子机制仍然不清楚。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.配体偶联磁珠

注意:使用超顺磁性甲苯磺酰基活化的珠用直径2.8微米，进行配体缀合（原液浓度10 8珠/毫升，30毫克珠粒/毫升）。以下协议是基于约2×10 5个细胞，这对应于在一个60mm组织培养板上生长至80％汇合MRC-5细胞的样品。相应地，如果使用不同大小或细胞的板在不同汇流调整的珠粒和试剂的体积。使用顺序的超顺磁珠的量具有每单元2珠。因此，需要用于60毫米板4×10 5珠。

  1. 通过涡旋至少30秒彻底重新悬浮在原始小瓶的珠子。等分试样40微升的再悬浮超顺磁珠（相应于4×10 6珠）至1.5毫升离心管中。
  2. 放置在管上的磁性separati上支架以将磁珠从溶液中分离出来。弃去上清液，从磁性分离底座上卸下管和在1mL的0.1M磷酸钠pH 7.4的重悬珠子。
    1. 用1mL的0.1M磷酸钠pH 7.4的重复洗涤步骤两次。
  3. 最后一次洗涤后，重悬珠子于1mL的0.1M磷酸钠pH 7.4的。
  4. 结合100微克牛纤连蛋白（FN）或任何其他细胞粘附受体配体以含有小珠的1毫升的0.1M磷酸钠pH 7.4的并通过移液混合。
  5. 通过更换FN或用BSA，聚-D-赖氨酸或脱辅基转铁蛋白为阴性对照的任何其他特异性配体重复前面的步骤。
  6. 任选地，....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该技术的原理在图1a中示出。以下的配体缀合，磁珠与细胞孵育20分钟，然后一个永久磁铁用于施加约30-40 PN的拉伸力对各种量的时间。 图1b示出了2.8微米势必MRC5细胞粘附受体的FN包被的磁珠。

细胞裂解后的超顺磁珠洗涤步骤是关键的，并确定纯化的程度。建议三次洗涤最低。 GADPH免疫印迹与长时间曝光可以测试粘附复合物的纯度（图2a）是有用的。

FN包被的珠子被用来研究响应于张力的粘附物随时间发生的机械传导过程。的粘合复合馏分的磁性分离后，将裂解物和粘合复合馏分被分析免疫印迹。正如预期的那样，我们甚至在不存在机械性刺激（图2b）的观察到的密合性复合馏分踝蛋白，纽蛋白和桩，但不是GAPDH。与以前的报告一致的32，33，紧张引发纽招聘粘连.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处所描述的方法构成，以施加张力到细胞表面粘附受体，并允许其随后的纯化一个简单的方法。然而，一些步骤是进行高效粘附纯化的和潜在的优化可以做取决于目标粘附受体的关键。我们目前的用户可能会遇到下面的潜在问题。

我们使用直径2.8微米的磁性珠粒但较大的小珠可用于直径如4.5微米。然而，珠子直径应限制在2-5微米自吞噬可能在30-60分钟温育发生更快速和更大的珠具有更强的粘附性，使得胎圈的位移将根据磁场34,35受到限制。因此，培养时间限制到短周期和使用适当的珠尺寸是重要的。每个细胞培养的小珠的数量将影响f的量由单个细胞奥尔塞体验。而一个人想有效地刺激与张力的细胞，每个细胞过多珠可导致不相关信号途径的激活。我们通常孵育的每单元两个胎为FN包被的珠子的平均，但是该数量可以根据不同的细胞类型和细胞表面受体来调节[每单元1至5小珠。关于磁体，这里所描述的方法中使用的量上的2.8微米的合力已经测量（约30-40 PN磁体通过测量在未经稀释的甘油，牛顿液体与已知粘度

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称没有竞争经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CG是由来自法新社法国国家（ANR-13-JSV1-0008），来自欧盟第七框架计划（居里夫人职业集成n˚8304162），由根据欧盟的地平线欧洲研究委员会（ERC）资助项目2020年研究和创新计划（ERC启动格兰特n˚639300）。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
钕磁铁（在 60 mm 碟形天线的上表面）K&J Magnetics， IncDX88-N52等级 N52 尺寸：1 1/2" 直径 x 1/2" 厚
的钕磁铁（在 60 毫米盘的下表面）K&J Magnetics， IncD84PC-BLK等级N42尺寸：1/2"直径 x 1/4"厚 黑色塑料涂层 
Dynabeads M280 甲苯磺酰基活化Thermofisher14203超顺磁性微珠 
DynaMag-2 磁力架Thermofisher12321D
纤连蛋白 Sigma-AldrichF1141-5MG来自牛血浆的纤连蛋白
Poly-D-赖氨酸Sigma-AldrichP7280-5MG
载脂蛋白转铁蛋白Sigma-AldrichT1428-50MG牛载脂蛋白 载铁蛋白
血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-500G
DMEM 高葡萄糖、GlutaMAX 补充剂、丙酮酸 Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500毫升 
60*15 mm 培养皿Falcon353004
牛

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章