细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。
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方法文章
利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
机械敏感性细胞表面黏附复合物使细胞能够感知其周围环境的力学特性。近期研究已鉴定出黏附位点上的力感应分子，以及依赖于力学信号的转录因子，这些因子可调控谱系特异性基因表达并驱动表型输出。然而，将机械张力转化为生化信号通路的信号网络仍不明确。为了探索细胞表面受体在受到机械张力时所激活的信号通路，可使用超顺磁性微珠。本文介绍了一种利用磁性微珠对细胞表面黏附蛋白施加力学刺激的实验方案。通过该方法，不仅可以通过多种生化手段研究力依赖性的胞质信号通路，还可通过磁性分离与配体包被微珠结合的黏附复合物，来分析黏附结构的重塑过程。本方案包括配体包被超顺磁性微珠的制备、确定性张力的施加以及后续的生化分析步骤。此外，我们提供了一组代表性数据，证明对整合素介导的黏附施加张力可触发黏附结构重塑，并改变蛋白质酪氨酸磷酸化水平。
引言
在多细胞动物中，机械张力通过调控多种细胞过程（如增殖、分化和存活）来指导组织发育和稳态1,2。机械张力可来源于细胞外基质，也可由黏附细胞产生；这些细胞通过肌动球蛋白收缩装置感知其细胞外环境，牵拉细胞外基质，并利用对张力敏感的分子探测基质的刚性。作为对张力的响应，机械敏感性黏附蛋白会发生构象变化，从而触发复杂的信号级联反应。这些信号通路进一步协调细胞的机械响应，包括增殖、分化和存活，使细胞行为适应其细胞外环境。此类过程可在短时间内（数秒至数分钟）建立，通过修饰机械敏感结构，快速反馈至机械转导循环。例如，基于整合素的黏附结构可在Rho GTP酶介导的细胞骨架重塑作用下，响应张力而增强3,4,5。与此同时，其他信号通路在数小时至数天内被激活，以调控最终影响细胞命运的基因程序6。尽管已有大量研究揭示了基质刚度对细胞命运决定及疾病发展的影响1,2，但黏附介导的机械转导的精确分子机制仍不明确。
已开发出多种方法用于研究细胞自....
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方案
1. 配体与磁珠的偶联
注意：配体偶联使用直径为 2.8 μm 的超顺磁性甲苯磺酰化活化微珠（储存液浓度为 108 个微珠/mL，30 mg 微珠/mL）。以下方案基于约 2 × 105 个细胞的样本，相当于在 60 mm 组织培养皿中生长至 80% 汇合度的 MRC-5 细胞。若使用不同尺寸的培养皿或不同汇合度的细胞，需相应调整微珠和试剂的体积。超顺磁性微珠的使用量应保证每细胞对应 2 个微珠，因此 60 mm 培养皿需要 4 × 105 个微珠。
- 通过涡旋振荡至少30秒，充分重悬原瓶中的磁珠。取40 µL重悬后的超顺磁性磁珠（相当于4 × 106 个磁珠）至1.5 mL微量离心管中。
- 将离心管置于磁力分离架上，使磁珠与溶液分离。弃去上清液，从磁力分离架上取下离心管，用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬磁珠。
- 用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重复洗涤步骤两次。
- 最后一次洗涤后，用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬磁珠。
- 将100 μg牛纤维连接蛋白（FN）或其他任何细胞黏附受体配体加入含磁珠的1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.....
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结果
该技术的示意图如图1a所示。在配体偶联后，将磁珠与细胞孵育20分钟，然后使用永磁体施加约30-40 pN的张力，作用时间长短不一。图1b显示了结合于MRC5细胞黏附受体的2.8 µm纤维连接蛋白（FN）包被磁珠。
细胞裂解后对超顺磁珠的洗涤步骤至关重要，决定了纯化的程度。建议至少进行三次洗涤。通过长时间曝光的GADPH免疫印迹可用于检测黏附复合物的纯度（图2a）。
使用纤维连接蛋白（FN）包被的微珠研究在张力作用下随时间发生的黏附复合体中的力转导过程。在通过磁分离获得黏附复合体组分后，利用蛋白质印迹法分析裂解液及黏附复合体组分。正如预期，我们在黏附复合体组分中检测到talin、vinculin和paxillin，但在无机械刺激的情况下未检测到GAPDH（图2b）。与先前报道一致32,33<.......
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讨论
本文所述方法提供了一种直接施加张力于细胞表面黏附受体并实现其后续纯化的途径。然而，某些步骤对于高效完成黏附受体的纯化至关重要，且可根据目标黏附受体的不同进行潜在的优化。下文列出了用户可能遇到的一些潜在问题。
我们使用了直径为 2.8 μm 的磁性微珠，但也可使用更大的微珠，例如直径为 4.5 μm 的微珠。然而，微珠直径应限制在 2–5 μm 范围内，因为在 30–60 分钟的孵育过程中，过大的微珠可能更快地引发吞噬作用，且较大微珠具有更强的黏附性，从而在磁场作用下限制微珠的位移34,35。因此，将孵育时间控制在较短时间并选用合适的微珠尺寸至关重要。每个细胞孵育的微珠数量将影响单个细胞所受力的大小。尽管希望利用张力高效刺激细胞，但每个细胞上的微珠过多可能激活无关的信号通路。我们通常对纤连蛋白（FN）包被的微珠采用平均每细胞 2 个微珠的孵育量，但该数量可根据细胞类型和细胞表面受体进行调整（每细胞 1 至 5 个微珠）。关于磁铁，本文所述方法采用的磁铁对 2.8 μm.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
C.G. 获得法国国家研究署（Agence National de la Recherche, ANR-13-JSV1-0008）、欧盟第七框架计划（Marie Curie 职业整合项目 n˚8304162）以及欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下资助的启动基金（ERC Starting Grant n˚639300）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钕磁铁（置于60 mm培养皿上表面） | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | 等级N52，尺寸：1 1/2" 直径 × 1/2" 厚 |
| 钕磁铁（置于60 mm培养皿下表面） | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | 等级N42，尺寸：1/2" 直径 × 1/4" 厚，黑色塑料涂层 |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | 超顺磁性微珠 |
| DynaMag-2 磁力架 | Thermofisher | 12321D | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | 来源于牛血浆的纤连蛋白 |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | 牛源脱铁转铁蛋白 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM高糖培养基，含GlutaMAX添加剂和丙酮酸钠 | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60×15 mm 培养皿 | Falcon | 353004 |
参考文献
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol ....
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重印与许可
