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方法文章

利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

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DOI：

10.3791/55330

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2017年3月8日

 ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。

摘要

机械敏感性细胞表面黏附复合物使细胞能够感知其周围环境的力学特性。近期研究已鉴定出黏附位点上的力感应分子，以及依赖于力学信号的转录因子，这些因子可调控谱系特异性基因表达并驱动表型输出。然而，将机械张力转化为生化信号通路的信号网络仍不明确。为了探索细胞表面受体在受到机械张力时所激活的信号通路，可使用超顺磁性微珠。本文介绍了一种利用磁性微珠对细胞表面黏附蛋白施加力学刺激的实验方案。通过该方法，不仅可以通过多种生化手段研究力依赖性的胞质信号通路，还可通过磁性分离与配体包被微珠结合的黏附复合物，来分析黏附结构的重塑过程。本方案包括配体包被超顺磁性微珠的制备、确定性张力的施加以及后续的生化分析步骤。此外，我们提供了一组代表性数据，证明对整合素介导的黏附施加张力可触发黏附结构重塑，并改变蛋白质酪氨酸磷酸化水平。

引言

在多细胞动物中，机械张力通过调控多种细胞过程（如增殖、分化和存活）来指导组织发育和稳态1,2。机械张力可来源于细胞外基质，也可由黏附细胞产生；这些细胞通过肌动球蛋白收缩装置感知其细胞外环境，牵拉细胞外基质，并利用对张力敏感的分子探测基质的刚性。作为对张力的响应，机械敏感性黏附蛋白会发生构象变化，从而触发复杂的信号级联反应。这些信号通路进一步协调细胞的机械响应，包括增殖、分化和存活，使细胞行为适应其细胞外环境。此类过程可在短时间内（数秒至数分钟）建立，通过修饰机械敏感结构，快速反馈至机械转导循环。例如，基于整合素的黏附结构可在Rho GTP酶介导的细胞骨架重塑作用下，响应张力而增强3,4,5。与此同时，其他信号通路在数小时至数天内被激活，以调控最终影响细胞命运的基因程序6。尽管已有大量研究揭示了基质刚度对细胞命运决定及疾病发展的影响1,2，但黏附介导的机械转导的精确分子机制仍不明确。

已开发出多种方法用于研究细胞自身产生的力或外力对细胞行为的影响，包括流动系统、荧光共振能量转移（FRET）张力传感器7,8、可变形基底9、磁镊、光镊10以及原子力显微镜（AFM）11。本文介绍一种利用超顺磁性微珠的方法，用于表征在特定黏附受体上施加张力时所激活的力传导通路。超顺磁性微珠是一类在磁场中可逆磁化的颗粒。当其表面包被特定受体的配体后，这些微珠便成为研究细胞外施加力学力效应的有力工具。该方法已被多项研究验证3,5,12-17，并具有显著优势，可极大促进对贴壁细胞的生化分析。早期研究通过使用类似胶原蛋白包被的磁性微珠并结合生化分析，发现张力可导致蛋白酪氨酸磷酸化水平升高以及RhoA的激活5,18,19。下文所述方法也已应用于纤连蛋白（FN）包被的微珠，以表征张力作用于整合素后下游的信号通路3。在该研究中，Guilluy 等人表明，张力通过招募两个鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）——LARG 和 GEF-H1——至整合素黏附复合物，从而激活 RhoA。此后，其他研究也通过不同方法证实，细胞自身产生的张力可诱导 GEF-H1 被招募至黏附复合物20,21，进一步证明了本文所述方法的可靠性。结果表明，活化的 RhoA 可通过细胞骨架重塑促进黏附强化。该系统还被用于探索作用于细胞-细胞黏附受体的张力。将包被有 E-钙黏蛋白（E-cadherin）胞外结构域的磁性微珠施加力学力后，可诱导黏着斑蛋白（vinculin）的募集增加，其模式类似于整合素相关的黏附复合物12。Collins 及其同事观察到，对 PECAM-1 施加张力可促进整合素和 RhoA 的活化13。另一种基于磁性微珠的实验方法是研究作用于分离细胞核的张力。通过使用包被抗核膜蛋白 nesprin-1 抗体的微珠，研究人员纯化了核膜复合物，并证明这些复合物会动态响应机械张力而被调控22。这些结果支持了该方法在力传导通路研究中的强大能力。此外，与流动系统或牵引力系统会广泛激活细胞整体过程不同，磁性微珠可通过使用特定受体配体3或针对细胞表面受体的单克隆抗体13,15，实现对特定细胞黏附受体的精准靶向。

该方法的另一个优势在于通过简单的配体亲和纯化步骤即可分离黏附复合物。众所周知，将包被配体的微珠加入细胞后，可与黏附受体结合并诱导多种黏附相关蛋白的募集23。进一步对包被配体的磁性微珠施加外力，可使这些黏附复合物转变为介导多种张力依赖性信号通路的大型分子平台4,24。通过细胞裂解后利用磁铁富集微珠，即可实现对黏附平台的分离。已有其他方法用于在贴壁细胞中纯化黏附复合物，这些方法通常结合化学交联以维持蛋白质-蛋白质相互作用，并通过去垢剂、剪切流或超声处理进行细胞裂解20,21,25,26,27,28，最终收集含有黏附复合物的腹侧质膜部分。与这些方法不同，磁性微珠可通过特异性靶向某一类黏附受体，实现更高纯度的细胞黏附复合物分离。此前已有研究利用磁性微珠纯化非贴壁细胞中附着于配体包被微珠的黏附复合物29,30。下文所述方法模拟了在生理条件下外力短暂持续作用（数秒至数分钟）的生物学情境，因此为研究纯化后黏附复合物的分子组成及其下游的机械敏感性信号通路提供了有力工具。

本文介绍了一种利用磁珠对黏附表面蛋白施加张力的详细实验方案。将一块永磁钕磁铁置于培养皿表面顶部，磁极面高度设置为6 mm，以确保单个2.8 μm磁珠所受的力保持恒定（约30–40 pN）31。张力刺激的持续时间由操作者根据目标分子及其激活的时间尺度决定。最后裂解细胞，利用磁铁分离磁珠以纯化黏附复合物，并进行生化分析。本方案包括配体包被的超顺磁性磁珠的制备、通过磁铁施加张力以及后续的生化分析步骤。此外，我们还提供了一组代表性数据，证明对整合素介导的黏附结构施加张力可诱导黏附重塑，并改变蛋白质酪氨酸磷酸化水平。

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方案

1. 配体与磁珠的偶联

注意：配体偶联使用直径为 2.8 μm 的超顺磁性甲苯磺酰化活化微珠（储存液浓度为 108 个微珠/mL，30 mg 微珠/mL）。以下方案基于约 2 × 105 个细胞的样本，相当于在 60 mm 组织培养皿中生长至 80% 汇合度的 MRC-5 细胞。若使用不同尺寸的培养皿或不同汇合度的细胞，需相应调整微珠和试剂的体积。超顺磁性微珠的使用量应保证每细胞对应 2 个微珠，因此 60 mm 培养皿需要 4 × 105 个微珠。

  1. 通过涡旋振荡至少30秒，充分重悬原瓶中的磁珠。取40 µL重悬后的超顺磁性磁珠（相当于4 × 106 个磁珠）至1.5 mL微量离心管中。
  2. 将离心管置于磁力分离架上，使磁珠与溶液分离。弃去上清液，从磁力分离架上取下离心管，用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬磁珠。
    1. 用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重复洗涤步骤两次。
  3. 最后一次洗涤后，用1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重悬磁珠。
  4. 将100 μg牛纤维连接蛋白（FN）或其他任何细胞黏附受体配体加入含磁珠的1 mL 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，通过移液混匀。
  5. 作为阴性对照，可重复前述步骤，将FN或其他特异性配体替换为牛血清白蛋白（BSA）、聚-D-赖氨酸或多聚赖氨酸或无转铁蛋白（apo-transferrin）。
  6. 可选：如需进行凝胶分析，取10 μL配体溶液用于交联效率分析，并加入适量体积的浓缩Laemmli上样缓冲液混匀。
  7. 将磁珠与含配体的溶液在37 °C下于旋转仪中孵育12–24小时。
  8. 若反应完成后出现磁珠聚集体，可进行超声处理（连续39 W功率），时间不超过10–20秒。
  9. 使用磁力分离架分离磁珠，吸除残留溶液，加入1 mL PBS/0.2% BSA（pH 7.6）溶液，在37 °C下于旋转仪中孵育1小时。
  10. 用磁力架以1 mL PBS/0.2% BSA（pH 7.6）溶液洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于1 mL PBS/0.2% BSA（pH 7.6）溶液中。
  11. 若出现聚集体，可对磁珠进行超声处理，时间不超过20–30秒。
  12. 可选：取10 μL样品用于通过Western blot分析偶联效率（与适量体积的浓缩Laemmli上样缓冲液混合）。
  13. 可直接进行细胞实验，或将磁珠在4 °C保存最多1个月。
  14. 可选：进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，以分析FN与磁珠的交联情况。

2. 在细胞背侧表面黏附受体结合的配体包被微珠上施加张力

  1. 在适当的生长培养基（通常为含10%胎牛血清的DMEM，葡萄糖浓度为4.5 g/L）中，将贴壁细胞接种于60 mm组织培养皿中，培养至细胞融合度达到80%。
  2. 配制非变性非离子型裂解缓冲液（20 mM Tris HCl pH 7.6，150 mM NaCl，2 mM MgCl2，0.1% NP-40），并将微量离心管预冷。
  3. 从第1.10节中收集配体包被的磁珠，用1 mL PBS/0.2% BSA（pH 7.6）重悬，取100 μL磁珠悬液加入5 mL预温的培养 基中，涡旋混匀。
  4. 吸除60 mm培养皿中的培养基，加入5 mL含磁珠的预温生长培养基。 
  5. 在细胞培养条件（37 °C，5% CO2）下孵育20分钟，使磁珠沉降并黏附于细胞表面。注意孵育时间不可超过20分钟，以免磁珠被细胞通过吞噬作用内化。
  6. 可选步骤：使用10X或20X物镜在光学显微镜下观察磁珠，轻轻晃动培养皿以区分已黏附与漂浮的磁珠。
  7. 保持培养皿处于培养箱内，将普通皿盖更换为顶部固定有直径38 mm钕磁铁的专用皿盖。该磁铁通过两个位于盖子底面的小型13 mm钕磁铁固定在位。 由于磁铁磁性极强，操作时需格外小心。
  8. 在细胞培养条件（37 °C，5% CO2）下，对施加张力的细胞进行不同时间点的孵育。 
  9. 处理结束后，将培养皿置于冰上，小心吸除全部培养基。
  10. 加入300 μL细胞裂解缓冲液，冰上孵育10分钟。用细胞刮刀收集裂解液，转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。
  11. 使用磁力分离架沉淀磁珠，将总细胞裂解液转移至新的预冷1.5 mL微量离心管中。此组分可于-20 °C保存，用于后续分析。
  12. 用1 mL预冷裂解缓冲液洗涤磁珠3次。向磁珠沉淀中加入50 μL Laemmli上样缓冲液，用移液器吹打混匀，使用干式金属浴在95 °C加热5分钟。此组分含有分离得到的黏附复合物，可直接用于生化分析或于-20 °C保存。
  13. 从磁珠分离后获得的总细胞裂解液（约300 μL）中取出50 μL用于Western印迹分析。
    注意：剩余的250 μL可用于其他生化实验，如蛋白质-蛋白质相互作用研究（免疫共沉淀、GST pull-down实验）或GTP酶活性检测（根据目标GTP酶的不同，可能需要调整裂解缓冲液）。

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结果

该技术的示意图如图1a所示。在配体偶联后，将磁珠与细胞孵育20分钟，然后使用永磁体施加约30-40 pN的张力，作用时间长短不一。图1b显示了结合于MRC5细胞黏附受体的2.8 µm纤维连接蛋白（FN）包被磁珠。

细胞裂解后对超顺磁珠的洗涤步骤至关重要，决定了纯化的程度。建议至少进行三次洗涤。通过长时间曝光的GADPH免疫印迹可用于检测黏附复合物的纯度（图2a）。

使用纤维连接蛋白（FN）包被的微珠研究在张力作用下随时间发生的黏附复合体中的力转导过程。在通过磁分离获得黏附复合体组分后，利用蛋白质印迹法分析裂解液及黏附复合体组分。正如预期，我们在黏附复合体组分中检测到talin、vinculin和paxillin，但在无机械刺激的情况下未检测到GAPDH（图2b）。与先前报道一致32,33<...

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讨论

本文所述方法提供了一种直接施加张力于细胞表面黏附受体并实现其后续纯化的途径。然而，某些步骤对于高效完成黏附受体的纯化至关重要，且可根据目标黏附受体的不同进行潜在的优化。下文列出了用户可能遇到的一些潜在问题。

我们使用了直径为 2.8 μm 的磁性微珠，但也可使用更大的微珠，例如直径为 4.5 μm 的微珠。然而，微珠直径应限制在 2–5 μm 范围内，因为在 30–60 分钟的孵育过程中，过大的微珠可能更快地引发吞噬作用，且较大微珠具有更强的黏附性，从而在磁场作用下限制微珠的位移34,35。因此，将孵育时间控制在较短时间并选用合适的微珠尺寸至关重要。每个细胞孵育的微珠数量将影响单个细胞所受力的大小。尽管希望利用张力高效刺激细胞，但每个细胞上的微珠过多可能激活无关的信号通路。我们通常对纤连蛋白（FN）包被的微珠采用平均每细胞 2 个微珠的孵育量，但该数量可根据细胞类型和细胞表面受体进行调整（每细胞 1 至 5 个微珠）。关于磁铁，本文所述方法采用的磁铁对 2.8 μm...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

C.G. 获得法国国家研究署（Agence National de la Recherche, ANR-13-JSV1-0008）、欧盟第七框架计划（Marie Curie 职业整合项目 n˚8304162）以及欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下资助的启动基金（ERC Starting Grant n˚639300）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
钕磁铁（置于60 mm培养皿上表面）K&J Magnetics, IncDX88-N52等级N52，尺寸：1 1/2" 直径 × 1/2" 厚
钕磁铁（置于60 mm培养皿下表面）K&J Magnetics, IncD84PC-BLK等级N42，尺寸：1/2" 直径 × 1/4" 厚，黑色塑料涂层 
Dynabeads M280 TosylactivatedThermofisher14203超顺磁性微珠 
DynaMag-2 磁力架Thermofisher12321D
纤连蛋白 Sigma-AldrichF1141-5MG来源于牛血浆的纤连蛋白
多聚-D-赖氨酸Sigma-AldrichP7280-5MG
脱铁转铁蛋白Sigma-AldrichT1428-50MG牛源脱铁转铁蛋白
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-500G
DMEM高糖培养基，含GlutaMAX添加剂和丙酮酸钠 Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60×15 mm 培养皿Falcon353004

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细胞黏附配体包被蛋白质印迹磁分离蛋白酪氨酸磷酸化整合素信号转导力施加
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