一种用于根和下胚轴发育长期共聚焦成像的简易培养室

摘要

本文介绍了一种简单的方法，利用高数值孔径物镜和全氟十氢化萘作为浸没介质，对根和下胚轴发育进行长达3天的高分辨率共聚焦延时成像。

摘要

植物发育的多个方面（例如侧根形态建成）发生在数天的时间尺度上。为了研究其背后的细胞和亚细胞过程，需要采用能够维持生理条件的高分辨率延时显微成像策略。植物组织必须获得充足的营养和水分供应，并持续进行气体交换；然而，当组织被浸没并固定在盖玻片下时，极易发生缺氧。一种已被成功应用的策略是使用灌流系统，以持续提供氧气和营养物质。然而，这类装置可能结构复杂、操作繁琐，并需要专用设备。本文介绍了一种替代方案，即使用全氟十氢萘作为浸没介质的简易成像系统。该系统搭建简便，所需设备极少，可轻松安装在显微镜载物台上，支持多个成像室并行设置与观察。在此系统中，前两天侧根的生长速率与琼脂平板上的标准条件无显著差异，且侧根生长在之后至少一天内仍以较慢速率持续进行。植物组织通过琼脂块获得营养供应，该琼脂块也可用于施加多种药理学化合物。该系统最初建立用于监测侧根发育，但可轻易调整用于成像其他植物器官，如下胚轴和主根。

引言

为了研究植物发育过程中涉及的细胞及亚细胞活动，人们对高分辨率、长时间的延时成像技术的需求日益增长。此类成像实验中的一个关键挑战是维持生理条件的稳定，包括充分的气体交换以及水分和养分的持续供应^1,2,3。为了利用高数值孔径物镜实现最佳光学分辨率，样品应尽可能贴近盖玻片，并与之平行放置。在成像过程中，样品在x、y和z方向上的移动应尽可能最小化。

尽管幼苗通常被置于水或水溶液中进行短期成像，但水对CO₂和O₂的溶解能力较低（在20 °C、0.1 MPa条件下分别为1.54 mg/mL和0.04 mg/mL）⁴，因此不适合长时间的延时成像实验。维持恒定氧气和营养水平的灌流系统是解决该问题的一种方案，目前已开发出适用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）^1,2,3和光片显微镜（LSM）⁵的此类系统。RootChip²和RootArray³等系统专为根系发育过程的延时成像而设计，其通过在定制的多样本装置中萌发种子来实现。这些装置可最大程度减少机械干扰，并支持多个幼苗的并行分析，但并未针对亚细胞结构的成像进行优化。Calder及其同事设计了一种更为复杂的基于灌流的成像室，适用于亚细胞结构的成像，其中样品由网格固定，以便使用高倍浸没物镜¹。

本文介绍了一种解决该问题的替代性简单方案，该方案不依赖灌注系统，而是利用全氟十氢萘（PFD）——一种 recently 广泛用作成像封片介质的全氟碳化合物。 拟南芥 成像^6,7,8在这些应用中，PFD 具有高溶解 CO 的能力₂ 和 O₂ （1.9 g/mL，用于O₂ 在PFD中相较于水中的0.04 mg/mL）⁹，可使浸没的组织进行气体交换。此外，PFD 无荧光性，其折射率为 1.313，与水的折射率（1.333）相近，且比空气（1.000）更接近细胞质的折射率（约 1.4）⁶据报道，全氟碳化合物对多种植物及植物组织的生理影响极小⁶，萝卜种子在浸入PFD后能 readily 发芽，并在供水条件下表现出至少两天的正常生长和发育¹⁰. 类似观察结果也见于萌发的 拟南芥 种子⁶基于受激拉曼散射直接成像PFD的分布 拟南芥 浸润后叶片组织的结果表明，Littlejohn 及其同事得出结论：PFD 可能不会被活细胞吸收⁸PFD 之前主要被用于成像地上组织，由于其表面张力低，可轻易渗透气隙，从而显著增加成像深度。⁶在此，采用PFD进行发育中侧根的长期共聚焦成像。该配置中，将一株或多株幼苗置于以琼脂固化的培养基平板上，并浸入PFD中。PFD可实现成像室内的气体交换，防止缺氧。由于PFD具有高挥发性，因此通过聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）胶垫进行密封，该胶垫同时具有高气体通透性（1.5 × 10^-12 pmol m^-1 s^-1 Pa^-1 用于 CO₂)¹¹营养物质和水分由添加琼脂凝固的培养基块提供。同时，琼脂块可轻柔地将根压向盖玻片，从而固定其在成像室中的相对位置，便于使用高分辨率的水浸物镜进行观察。此外，可通过琼脂块施加多种药理学处理，包括地塞米松（dexamethasone）、oryzalin 和异噁唑苯（isoxaben）。成像室可利用标准显微载玻片和极少的设备大量组装。该成像室最初开发并用于研究侧根发育，但也可适用于其他幼苗器官的成像，如主根尖端和下胚轴。

方案

1. 制备反应室

1. 使用玻璃切割器，从1 mm厚的显微镜载玻片的一端切下3 mm宽的玻璃条。使用氰基丙烯酸酯快干胶或双面胶带，将这些玻璃条以约45 mm的间距粘贴在另一张载玻片的宽度方向上（图1A）。每个培养室需要一张载玻片，另需额外的载玻片用于浇注琼脂平板（一张载玻片可制备2–3个琼脂平板）。载玻片可重复使用。
2. 在玻璃条之间，用透气的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）胶体制作一个与玻璃条等高的垫圈。将一团聚二甲基硅氧烷胶体置于载玻片上（图1B），用少量100%无水乙醇润湿另一张载玻片，然后用该载玻片压平聚二甲基硅氧烷胶体团，直至其高度与玻璃条齐平（图1C）。
   1. 如有必要，用剃刀刀片修剪多余的聚二甲基硅氧烷胶体，并重复压平操作。
3. 使用合适的切割工具或经无水乙醇润湿的剃刀刀片，去除聚二甲基硅氧烷胶体的内部部分，形成用于后续放置幼苗和琼脂平板的空腔（图1D）。
4. 用剃刀刀片小心修整凝胶，使垫圈最终的壁厚约为2 mm（图1E）。气体透过聚二甲基硅氧烷屏障的渗透性在厚度超过50 µm时与厚度无关¹¹。

2. 制备琼脂固化的培养基平板

1. 在载玻片上带有两条玻璃条的位置，放置盖玻片（22 mm × 50 mm），使其两端分别搭在两条玻璃条上。
2. 将含有1%（w/v）蔗糖和1.5%（w/v）琼脂的熔融半强度Murashige和Skoog培养基（½ MS）用移液器注入盖玻片下方形成的空隙中，直至完全充满（总体积约1 mL），静置至琼脂凝固（约5分钟）。
   注意：可通过在倒制琼脂块前将适当浓度的药理学化合物加入液体培养基中，从而将化合物引入琼脂块。该方法已成功用于地塞米松¹²、异噁唑苯、2,6-二氯苯腈（DCB）、oryzalin和Latrunculin B。

3. 完成腔室装置的设置

1. 通过在离心管中振荡少量 PFD 使 PFD 与空气平衡⁷。向凝胶垫圈的孔中加入少量（约 200 µL）与空气平衡的 PFD，但不要完全充满腔室。此 PFD 有助于在将琼脂块放入腔室时避免其下方截留气泡。
2. 从琼脂块上取下盖玻片（如上文步骤 2.2 所述），并使用刀片切下一小块所需大小和形状的琼脂块。然后将其放入凝胶垫圈的孔中（图 1F）。琼脂块与垫圈四周应保持 2–4 mm 的间隙。
3. 用与空气平衡的 PFD 完全充满腔室。
4. 将一株或多株 A. thaliana 幼苗（用于 2–3 天成像时最多 3 株幼苗）放置于琼脂块上，使子叶和下胚轴悬垂于边缘，并漂浮在 PFD 中（图 1G）。
5. 为获得幼苗，先用 70% 乙醇对种子进行表面灭菌，然后将其接种于添加 1% 蔗糖和 0.8% 琼脂的 ½ MS 培养基上，于 4 °C 下春化处理 2–4 天，随后将培养皿垂直放置，在 22 °C、16 小时光照/8 小时黑暗条件下培养。若需观察侧根，应在转移至成像腔室前培养 7–10 天。
6. 为封闭腔室，选用与物镜光学参数匹配的盖玻片，用玻璃载玻片的边缘轻轻按压盖玻片，直至其两端均落在两侧玻璃条上（图 1H）。
7. 如需要，可在两端使用沿长度方向对半剪开的 1.25 cm 宽微孔手术胶带条固定盖玻片（图 1I）。成像前让样品静置约 30 分钟，以减少成像过程中的样品移动。
8. 使用正置显微镜进行成像，以维持稳定的生长基质。建议使用 20X/0.7NA 或 63X/1.2NA CS2 物镜。

结果

在成像培养皿中，侧根以生理速率生长。

在成像室中生长的植物侧根长度以每小时为间隔进行测量（图2A，左图，视频1，n = 23），并将生长速率与在含有相同琼脂固化培养基的标准培养皿中生长的侧根进行比较（图2A，右图，视频2，n = 23）。不同侧根之间的生长速率可能存在显著差异，其中根的长度是一个决定性因素，因为较长的根具有更长的生长和增殖区域¹³。因此，在成像室和琼脂平板上均选择了一系列具有不同初始长度（范围从50 µm到1150 µm）的侧根。实验开始时，两组侧根的平均长度相近（成像室和培养皿分别为439 µm和442 µm）。在27小时的分析时间段内，成像室和培养皿中的侧根生长均近似呈线性，培养皿上的平均生长速率为52 µm/h（R² = 0.997），成像室中的平均生长速率为51 µm/h（R² = 0.993）（图2B）。单个侧根的生长速率在培养皿和成像室中均表现出高度变异性（图2C），在成像室中为17 µm/h至82 µm/h，在培养皿中为13 µm/h至87 µm/h。尽管生长速率总体上随根长度增加而提高，但长度相近的根之间仍存在显著差异，且成像室与培养皿之间的变异程度相似。

侧根在成像室中增殖，可使用高数值孔径物镜进行成像。

通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）¹⁰以每小时一次的时间间隔对共表达质膜标记NPSN12-YFP¹⁴和微管标记UBQ1::mRFP-TUBULIN BETA6（RFP-TUB6）¹⁵的侧根进行成像，以记录成像室中细胞增殖期间的微管行为（图2D，影片3）。在这些成像室中，侧根在x、y和z轴上的位置高度稳定，从而能够在数小时内连续获取时间序列共聚焦图像堆栈。分生组织细胞持续增殖，表现为前前期带的形成（图2D，绿色箭头）、有丝分裂纺锤体（图2D，白色箭头）以及成膜体（图2D，蓝色箭头）。与培养在培养皿中的幼苗类似，成像室中完全伸长的根细胞开始形成根毛（图2A、图2D，箭头末端），进一步表明在成像室中根的发育进程正常。为了获得较宽的视野，图2D中的图像使用20x/0.7 NA物镜获取。同时，也可使用高数值孔径的63x/1.2 NA水浸物镜对侧根进行高分辨率成像（图2E）。

在成像培养皿中，侧根的生长可持续长达三天。

为了探究成像小室支持侧根以生理速率生长的时间长度，分别在0 h、24 h、48 h和72 h时对成像小室（n = 27）和培养皿（n = 33）中的侧根长度进行了定量分析。所选侧根在0 h时长度均短于200 µm，成像小室中侧根平均长度为117 µm，培养皿中为121 µm。由于较短的根平均生长速度较慢（图2C），它们较少生长至琼脂块边缘，因而更易于成像。在前48 h内，成像小室与培养皿中所有侧根的平均生长速度无显著差异（图3A）。然而，在48 h至72 h期间，成像小室中侧根的平均生长速度显著降低（图3A）。尽管成像小室中侧根的生长速率在48 h后总体呈现下降趋势，但个体间的生长速率仍表现出高度变异性（图3B、3C），这表明在完整的72 h生长周期内，存在一个相当比例的侧根子集，其在培养皿和成像小室中的生长速率相当。在培养皿中生长的33条侧根中，有23条（69.7%）在72 h时达到的长度处于平均长度一个标准差范围内（介于927至3,163 µm之间，图3B，红色）。而在成像小室中的27条侧根中，有10条（37.0%）达到该区间内的长度（图3B，红色）。

成像室可轻松适用于较老的侧根、主根和下胚轴。

原始成像腔设计的一个局限性在于，尽管刚性琼脂块提供了一定的机械阻力，但具有向地性生长特性的根最终会穿透琼脂块，导致图像质量下降（图4B），并超出高数值孔径物镜的工作距离，即使是工作距离相对较长（0.3 mm）的63X/1.3 NA CS2物镜也无法避免。幼嫩的侧根缺乏含有平衡石的柱细胞，而这些细胞是向地性生长所必需的¹⁷，因此它们在成像腔中最初沿盖玻片平行生长（图2E）。随着侧根的伸长以及柱细胞和平衡石的形成，其正向地性逐渐增强；而主根从萌发开始就表现出强烈的向地性反应。这使得主根可用于成像的时间被限制在数小时内，同时也严重限制了能够连续成像48小时或更长时间的侧根的初始长度。为克服这一限制，对成像腔进行了改进，通过在琼脂块表面设置一层纤维素赛璐玢膜作为穿透屏障，使根的生长保持与盖玻片平行（图4A）。最初使用1.5%琼脂块的尝试导致根在前24小时内的生长受到抑制，可能归因于机械应力。随后测试了较低浓度的琼脂，结果发现，在含有0.8%琼脂和纤维素膜的成像腔中，幼嫩侧根在前48小时内的生长速率与传统成像腔中的生长速率无显著差异。在0–24小时期间，纤维素膜腔和传统腔中的平均根生长分别为242 µm和262 µm（p = 0.78，Student's t-Test）；在24–48小时期间分别为330 µm和355 µm¹（p = 0.67，Student's t-Test）；n值分别为12和11。该设计有效防止了侧根偏离盖玻片向琼脂内部生长，同时也实现了主根长达48小时的稳定成像（图4C）。

为了测试成像室是否可适用于根以外的器官，选择了拟南芥（Arabidopsis）下胚轴进行实验。下胚轴明显比根更厚，因此在传统的成像室中，最上层的细胞会被挤压到盖玻片上，导致形变。为此，开发了一种替代设计，使用中央带有椭圆形凹槽的凹面载玻片（图4D）。在此配置中，将一块1 mm厚的琼脂（制备方法同上文2.2）放置于载玻片凹槽内，使其一端突出几毫米进入凹槽（图4D）。将下胚轴置于载玻片凹槽上方，而根部则置于水平部分上方。这样可确保幼苗通过根部固定在空间中，同时避免下胚轴被压扁。尽管成像室与培养皿中的生长速率未进行系统量化比较，但在成像室中的下胚轴仍表现出已被充分描述的纵向生长波向上迁移的现象（图4E、4F）¹⁶。

图1：成像腔室的组装。所有细节均在正文中描述。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：在成像室的生理条件下侧根生长。（A）成像室（左）和培养皿（右）中拟南芥（Arabidopsis）侧根在25小时内的发育情况（持续光照，水平培养，同步成像）。比例尺 = 200 µm。（B）显示（A）中所示侧根在27小时内侧根长度的变化（每1小时测量一次）。单个根的长度以灰色线条表示（n = 23，培养皿和成像室组），平均长度以红色圆圈表示。误差线 = 1个标准差（SD）。红线为平均长度的线性拟合。（C）显示（B）中所有侧根的平均生长速率与其初始长度的关系图。（D）对表达NPSN12-YFP和RFP-TUB6的侧根在连续时间点采集的三维共聚焦图像进行最大强度投影。插图：方框区域的放大图。绿色箭头：前期带；白色箭头：有丝分裂纺锤体；蓝色箭头：成膜体；箭头指示：根毛。（E）使用63X/1.2 NA物镜并按奈奎斯特采样（像素尺寸77 nm × 77 nm）对（D）中转基因株系的幼嫩侧根在0小时和16小时采集的高分辨率图像的最大强度投影；星号标记各时间点的相同细胞；箭头指示在0小时至16小时之间发生分裂的细胞。比例尺 = 50 µm（A–C）；20 µm（E）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：成像室中侧根的长期发育情况。（A）在成像室与培养皿中，连续三个24小时时间段内的平均绝对根生长量对比图。n.s. 表示 p >0.05；*** 表示 p <0.001（学生t检验）。n = 33（培养皿）和 n = 27（成像室）。（B）所有用于（A）中的根在连续时间点的侧根长度图。红色：最终长度在培养皿上所有侧根平均值±1个标准差范围内的侧根（介于927至3163 µm之间）。（C）在72小时内连续时间点获取的侧根中质膜标记物NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像的最大强度投影图。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4成像室可适用于其他植物器官。 (A-C用于主根的成像培养皿适配器。A成像室设计示意图。此设计与标准设计相同（图1) 有两个修改之处：MS 培养基平板含有 0.8% 琼脂而非 1.5% 琼脂，并在琼脂与植物之间放置一层纤维素膜（红色），以防止植物长入琼脂中。B) 7天龄幼苗主根中质膜标记物NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像堆栈在常规成像腔室中于0小时和48小时拍摄的XY（顶部）和XZ（底部）最大强度投影。注意，由于向重力性反应，根生长进入琼脂中。C) 七天龄幼苗主根中质膜标记蛋白NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像堆栈的XY（顶部）和XZ（底部）最大强度投影，分别在成像室中含纤维素膜条件下0 h和48 h拍摄。使用前，纤维素膜经80%乙醇灭菌，并浸泡于液体½ MS培养基中。注意根的向重力性生长被阻止进入琼脂。D-F) 下胚轴成像用培养皿的改造。D) 下胚轴成像室设计示意图。在载玻片上两片黄色玻璃条之间制造一个聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）橡胶垫圈（灰色），形成凹腔。将一块厚度均匀的1.5%琼脂块（米色）放置在载玻片上，部分伸入凹腔内。成像室中充满PFD（蓝色）。将幼苗置于琼脂块上，使下胚轴位于凹腔内琼脂块的下斜区域，而根部置于琼脂块的水平部分。最后用盖玻片密封成像室。E) 对两日龄幼苗下胚轴中质膜标记蛋白NPSN12-YFP，在48小时内连续时间点采集的代表性三维共聚焦图像序列进行最大强度投影。F) 子叶下轴（如E所示，在0 h沿轴的相对位置）中单个细胞沿基部到顶端轴方向在两个连续时间间隔内的纵向生长（如图所示）E）。注意此前描述的生长波沿下胚轴向上迁移的现象¹⁶比例尺 = 100 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

视频 1： 请点击此处下载该视频。

视频 2： 请点击此处下载该视频。

视频 3： 请点击此处下载该视频。

讨论

本文介绍了一种对发育中的侧根进行高分辨率共聚焦成像的简单策略，可连续成像两天至最多三天。在长达48小时的成像期间，未观察到成像系统对侧根发育产生任何不利影响。48小时后，侧根的平均生长速度开始减缓，尽管仍有相当一部分根（37%）的生长速率与在培养板上生长的根的平均速率相当。因此，通过成像足够数量的根，可以排除那些在48小时后生长减缓的根。目前尚未对成像室在超过72小时以上的使用情况进行系统性测试，但如果需要更长的成像时间，建议采用其他替代策略。只要提供适当的环境条件，成像室可连续放置在显微镜载物台上，也可移至植物生长设施中培养，并定期送回显微镜进行成像。该方法可实现多个成像室的并行成像。

此处所述培养室的一个优势在于侧根位置固定，可使用高分辨率水浸物镜进行成像。空间稳定性在很大程度上取决于支撑琼脂块中所用琼脂的浓度。最初测试了从0.8%到2%的一系列不同浓度，结果表明，该范围内的高浓度琼脂虽能稳定固定根系位置，但根的生长速度更快减缓，且部分根表现出机械应力的迹象，包括细胞伸长受抑制。相比之下，低浓度琼脂无法提供所需支撑，根在成像过程中会在x、y和z方向发生漂移。1.5%的琼脂浓度为最佳选择，可在不产生不良机械效应的前提下固定样品位置。在此条件下，根系在初始约30分钟内稳定后，可在数小时内保持稳定，从而支持过夜数据采集。在采集4D数据期间，z轴扫描范围通常额外增加5–10 µm，但这主要是为了适应侧根的平面外生长，而非补偿z轴漂移或晃动。尽管标准浓度的琼脂对穿透具有一定阻力，向重力性生长的根最终仍会穿透琼脂。然而，通过轻微改造成像室，可使根的生长维持与盖玻片平行，从而实现对较老的侧根和主根的成像。此外，该基本成像室也可轻松改装用于下胚轴的观察。在此系统中，下胚轴更易自由漂浮，因此成像时z轴扫描范围通常增加至约20 µm。本研究全程使用正置显微镜，便于控制基质特性。该成像室或可适配倒置显微镜系统，但需评估刚性盖玻片对穿插器官随时间变化的影响。

Littlejohn 及其同事指出，PFD 本身不易溶解生物分子，因此不能直接用于递送药理学化合物⁷。这一问题通过在琼脂块所依托的凝固生长培养基薄层中提供此类化合物得以解决。尽管灌流系统仍将是洗脱实验的首选方法，但该成像室已成功用于地塞米松¹²及其他化合物的施加。需要说明的是，在本文撰写期间，von Wagenheim 及其同事¹⁸报道了一种用于光片显微镜下观察侧根发育的成像室。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全氟十氢萘	F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK	FLUTEC PP6
聚二甲基硅氧烷生胶	Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA	商品编号 # 132700	Carolina Observation Gel
凹面载玻片	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	10118-600	凹面直径为13 mm，深度为0.2–0.4 mm。任何类型的凹面载玻片可能均适用
氰基丙烯酸酯胶水	Loctite	604753	任何适用于玻璃的“瞬间胶”可能均适用
纤维素赛璐玢膜	AA Packaging Limited, Preston, UK		325P 纤维素薄膜；直径80 mm圆片