胰管灌注是一种重要的技术，可用于谱系示踪、基因导入以及细胞系特异性靶向。本文介绍了一种向胰腺细胞递送药物和病毒的胰管灌注技术。
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摘要
摘要
胰腺是一个具有内分泌和外分泌双重功能的器官。多种病理状况可影响胰腺，包括糖尿病、胰腺炎和胰腺癌。这三种疾病均为当前活跃的研究领域，不仅旨在开发即时治疗方法，也致力于更深入地理解其病理生理机制。目前可用于推进这些研究领域的工具较少。胰管灌注是一种重要的技术，可用于谱系示踪、基因导入以及细胞系特异性靶向。该技术需要精细地解剖十二指肠第二段及壶腹部，随后阻断胆管并对胰管进行插管。尽管该技术在初期操作上具有较高难度，但其应用前景广泛。不同研究团队在操作细节上的差异凸显了建立标准化操作流程的必要性。本研究描述了在通过胰管灌注表达绿色荧光蛋白（GFP）的病毒载体或进行假手术后，胰腺内GFP的表达情况。灌注所导致的基因表达特异性局限于胰腺组织，其他任何组织类型中均无表达。
引言
胰腺是一个具有内分泌和外分泌双重功能的器官。多种病理状况可影响胰腺，包括糖尿病、胰腺炎和胰腺癌1。这三种疾病均为当前活跃的研究领域，不仅旨在开发即时治疗方法，也致力于更深入地理解其病理生理机制。
靶向治疗递送方法将具有显著优势。我们已开发出一种胰管灌注技术，可有效且选择性地向胰腺细胞递送药物和病毒。在此模型中，选择性地插管胰管并阻断胆总管，从而实现仅向胰腺进行递送。
该技术可用于特定细胞类型的谱系示踪，从而进一步阐明胰腺发育及病理过程中重要的发育通路2,3。病毒载体中的不同启动子可实现对特定细胞系的靶向，并将基因导入这些细胞系4,5。本研究展示了在通过胰管灌注表达绿色荧光蛋白（GFP）的病毒载体后，胰腺内GFP的表达情况，并与假手术组进行对比。
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方案
所有动物实验均经匹兹堡儿童医院动物研究与护理委员会以及匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 术前准备
- 通过鼻罩给予异氟烷吸入麻醉（维持浓度为1 - 3%，诱导时最高可达5%），直至达到适当的麻醉深度。使用镊子夹捏脚趾以监测麻醉效果；若无反应则视为麻醉充分，注意避免用药过量，以防发生呼吸抑制。
- 将动物仰卧位放置在解剖显微镜载物台上，使腹部位于物镜视野中央。使用手术胶带固定动物。在动物眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 在腹部均匀涂抹一层厚实的脱毛膏，保持3分钟。检查一小块区域以确认脱毛效果。用浸有70%乙醇的纱布轻轻擦去脱毛膏及毛发。
- 先用浸有70%乙醇的纱布擦拭动物腹部，再用浸有聚维酮碘（betadine）的纱布擦拭，以清洁并消毒皮肤。整个手术过程中应保持无菌条件。
2. 正确曝光
- 使用手术刀从剑突至脐部沿中线切开皮肤。用有齿镊提起腹膜，用剪刀在中线处剪一个小孔。
- 将腹膜切口沿中线（白线）延长至与皮肤切口等长。
注意：此操作可完成上腹部正中剖腹术。 - 用钝性拉钩抬起肝脏，暴露胆总管。用弯型动脉瘤夹夹闭胆总管。
注意：此操作可防止液体灌注至肝脏。
3. ....
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结果
通过练习和精细的手术技术，这些小鼠的存活率应高于95%。输注后一周，胰腺中应可观察到预期效果。实验选用10至12周龄的小鼠进行胰管输注。本实验中，我们使用带有CMV启动子的腺相关病毒8型（AAV8）来表达绿色荧光蛋白（GFP），并与假手术组进行对比。输注后7天处死小鼠并取其胰腺组织。胰腺、脾脏和十二指肠组织切片使用胰岛素抗体和Hoescht染色。图1显示，在接受AAV8胰管输注的小鼠中，胰腺内广泛表达GFP，而假手术组小鼠则无此表达。这些小鼠的肝脏、脾脏和十二指肠中均未检测到GFP表达，表明该输注具有选择性。这些结果可通过多种其他方法进一步验证，包括DNA和RNA表达谱分析。
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讨论
本研究详细描述了胰管灌注技术的方法学，这是一种可将基因及其他分子特异性且高效地递送至胰腺的有效小鼠模型。不同研究团队在操作细节上的不一致凸显了建立标准化操作流程的必要性8,9,10。
该操作有几个关键步骤，首先需要选择年轻且健康的小鼠。十二指肠的穿孔即使微小且可控，对小鼠而言仍是一种创伤性事件，不可避免地会引发炎症性细胞因子及其他尚未完全明确的因素的募集。因此，精细的解剖操作至关重要，同时应尽可能制造最小的十二指肠切口以插入导管。整个操作中最关键的步骤是通过递送系统对胰管进行插管。
过度破坏胰腺乳头可能导致强烈的全身炎症反应，从而引发困难。胰腺是一个精细的器官；在外科领域，人们通俗地将其描述为一个不应"随意处理"的器官。操作成功率仅随操作者技能水平略有差异。只要胆管被正确阻塞，灌注将完全特异性地局限于胰腺本身。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者无致谢。本研究获得浙江省卫生和计划生育委员会基金（项目编号 20146242）和温州市科学技术局基金（项目编号 Y20140248）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠（25 - 30 g，8 - 12 周龄） | 杰克逊实验室 | ||
| Ketofen | Henry Schein 公司 | 5487 | |
| 乙醇（70%） | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| 无菌生理盐水溶液 | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| 防护装备 | |||
| 脱毛产品 | 剃须或修剪器 | ||
| 2英寸 x 2英寸纱布垫 | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| 针头（30.5G 和 25G） | Becton Dickinson and Co. | 305106 和 305122 | |
| 用于 Ketofen 和生理盐水的注射器 | Becton Dickinson 公司 | 309657 | |
| 用于泵的注射器 | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| 输液泵 | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 输注导管 | 世界精密仪器公司 | CMF31G | |
| 弯头 bulldog 钳（2 个） | Roboz | RS-7439 | |
| 阿鲁加镊 | Roboz | RS-5163 | |
| Adson 镊子 | Roboz | RS-5234 | |
| 持针器 | Roboz | RS-7882 | |
| 剪刀 | Roboz | RS-5982 | |
| 棉签 | 医师销售与服务 | 22-9988 | |
| 体视显微镜 | |||
| 缝合 | 欧文斯与迈诺尔 | SXMD1B402 |
参考文献
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are disti....
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