斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。
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本文内容
摘要
摘要
成年斑马鱼中穆勒胶质细胞启动内源性再生程序 （斑马鱼））视网膜在神经元损伤和死亡后，穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，产生神经祖细胞，这些神经祖细胞经历多轮细胞分裂，并分化为缺失的神经元类型。穆勒胶质细胞和神经祖细胞的细胞核在视网膜的不同位置进行DNA复制并发生有丝分裂， 即 它们分别在内核层（INL）基底部和外核层（ONL）之间迁移，这一过程被称为核间期迁移（Interkinetic Nuclear Migration, INM）。INM 主要是在发育中的视网膜中被研究。为了详细观察成年斑马鱼视网膜再生过程中 INM 的动态变化，需要对荧光标记的穆勒胶质细胞/神经前体细胞进行活细胞成像。本文提供了分离和培养背侧视网膜的条件 Tg[gfap:nGFP]mi2004 暴露于持续强光下35小时的斑马鱼。我们还显示，这些视网膜培养物可用于活细胞成像实验，利用多光子显微镜连续获取视网膜外植体全厚度范围内的z轴层扫图像，持续时间长达8小时，以监测细胞迁移行为 gfap:nGFP阳性细胞。此外，我们详细描述了成像后分析的具体步骤，以确定顶端和基底INM的移动速度。综上所述，我们建立了在成年神经元再生模型中研究INM动态过程的实验条件。这将有助于深入理解这一关键的细胞过程，并使我们能够揭示调控INM的分子机制。
引言
与人类不同，斑马鱼（Danio rerio）在视网膜神经元发生细胞死亡后表现出强烈的再生反应1,2,3,4。视网膜神经元死亡时释放的信号分子肿瘤坏死因子α可诱导位于视网膜内核层（INL）基底部的穆勒胶质细胞增殖5，并产生神经前体细胞；这些前体细胞在分化为已死亡的神经元类型之前会持续增殖2,3,4。在再生反应的增殖阶段，穆勒胶质细胞及其衍生的神经前体细胞的细胞核会随着细胞周期发生重复性的迁移运动（即核间期迁移，INM）6,7。位于内核层基底部的细胞核首先在该区域复制其DNA，随后迁移至外核层（ONL），在该层完成分裂，新生的细胞核再返回至内核层的基底部。这一过程最早通过组织学方法在神经上皮发育过程中被描述，而后续的活细胞成像研究进一步证实了Sauer提出的解释8
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方案
注：斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本论文所述方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会批准，并符合视觉与眼科研究协会关于动物在视觉研究中使用的声明。
1. 溶液
- 准备70%乙醇，用于对组织培养超净台及转入组织培养超净台的所有设备/试剂进行消毒。
- 将2 mL 2-苯氧乙醇加入1 L系统用水中（1:500 2-苯氧乙醇）。
- 配制0.1 mM NaHCO3，pH 8.0。在无菌组织培养超净台中，使用10 mL 注射器和孔径0.2 µm的注射器滤器对溶液进行除菌。
注意：NaHCO3 可用于有效铺展细胞和组织黏附剂于荧光培养皿的盖玻片表面（见步骤3.2）。 - 配制1.0 M CaCl2和1.0 M MgCl2。在无菌组织培养超净台中，使用10 mL注射器和孔径0.2 µm的注射器滤器进行除菌。
- 配制Hank's平衡盐溶液（HBSS）时，将无菌CaCl2和无菌MgCl2 加入不含Ca2+/Mg2+、不含酚红的1x HBSS中，终浓度均为1 mM。操作需在无菌环境中进行。
- 配制培养基时，在无菌环境中将以下成分混合：50%不含酚红的1x最低必需培养....
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结果
根据图1示意图中所述步骤分离视网膜，可在5% CO2/空气环境中对光损伤的成年Tg[gfap:nGFP]mi2004斑马鱼的展平背侧视网膜进行至少24小时的培养。这些平铺的视网膜外植体可用于对深层组织层面进行成像。例如，在光损伤视网膜中，利用Müller胶质细胞特异性启动子gfap（胶质纤维酸性蛋白）驱动GFP标记的Müller胶质细胞/神经前体细胞核在有丝分裂期间位于外核层（ONL）（图2A - D, 3）。为进一步验证该方法适用于观察不同视网膜细胞层，我们从未经损伤的Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19斑马鱼眼球中急性分离视网膜外植体，该品系在视紫红质（rhodopsin）启动子驱动下于视杆光感受器中表达EGFP。图2E - H显示，可成功获取GFP阳性视杆光感受器及其内节的图像。由于视杆内节延伸于视锥光感受器之间并朝.......
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讨论
研究成年斑马鱼视网膜损伤后再生机制的工作主要采用免疫细胞化学方法5,25,26,27,28,29,30。建立视网膜外植体培养条件，并对诸如核内有丝分裂（INM）等现象进行活细胞成像，使我们能够获得详细的空间和时间信息。该技术可用于确定细胞核迁移速度、有丝分裂前期核膜破裂的时间与位置，以及细胞分裂的长度和位置。此外，还可确定分裂平面以及子代细胞的命运及其后续定位。最终，这一强大方法将揭示在视网膜再生过程中，穆勒胶质细胞与神经前体细胞在INM行为上是否存在差异。利用转基因斑马鱼品系，可在视网膜再生反应的不同阶段特异性标记增殖细胞，有助于解析这些差异性行为
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 William Archer 及圣母大学综合成像中心提供的支持。特别感谢圣母大学弗赖曼生命科学中心的技术人员，感谢他们持续的帮助以及对斑马鱼的悉心照料和饲养管理。本研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所对 DRH 的资助（项目编号：R01-EY018417、R01-EY024519）以及圣母大学斑马鱼研究中心（位于美国印第安纳州圣母大学）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont 镊子 #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont 镊子 #5，45° 角 | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas 剪刀 | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ-1B | 类似型号的解剖用体视显微镜亦可使用 |
| 生物安全柜 A2 级 | Labconco | 同等类型可使用 | |
| 组织培养孵箱 | Thermoscientific | HEPA-100 级 | 同等类型可使用 |
| Sylvania 荧光灯管 OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm 孔径 Acrodisc 注射式滤器 | VWR | 4192 | |
| 10 mL 鲁尔锁式注射器 | VWR | BD309604 | |
| 60 mL 鲁尔锁式注射器 | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+、不含酚红的 HBSS，Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| 不含酚红的 MEM，Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| 马血清，经热灭活 | ThermoScientific | 26050-070 | |
| 青霉素/链霉素 | VWR | 16777-164 | |
| 超纯低熔点琼脂糖 | ThermoScientific | 16520-100 | |
| 乙醇，纯品 | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-苯氧基乙醇 | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak 细胞和组织粘合剂 | VWR | 354240 | |
| 折射率匹配液 | Cargille Lab | 1803Y | |
| 配备 MaiTai 红外激光器的 Nikon A1 多光子显微镜 | Nikon | 同等系统可使用 | |
| 40X Apo 长工作距离水浸物镜（数值孔径 1.15） | |||
| 配备 35 mm 培养皿插件的环境培养室 | Okolab | 同等系统可使用 | |
| NIS 分析软件 | Nikon |
参考文献
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time....
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重印与许可
