成年转基因斑马鱼视网膜外植体培养由多光子显微镜活细胞成像

与人类不同，斑马鱼（Danio rerio）显示出在视网膜神经元^{1，2，3，4}的细胞死亡的健壮再生反应。肿瘤坏死因子α，即从濒死的视网膜神经元释放的信号传导分子诱导驻留在基底内核层的视网膜（INL）在米勒胶质细胞，增殖⁵并产生神经元祖细胞继续分化成神经元细胞之前增殖即死²种^，3，4。在再生反应的增殖期，米勒胶质细胞的细胞核和其衍生的神经元祖细胞阶段进行的重复洄游图案与细胞周期（Interkinetic核迁移^{，INM）6 >，7。}定位在基底INL细胞核迁移到外核层（ONL），他们划分而产生的核基部返回到INL之前之前复制它们的DNA。这个过程的神经上皮发育期间利用组织学方法首先描述，而活细胞成像的方法后来被绍尔^{8，9，10，11，12}证实了解释。两个组织化学和活细胞成像的方法已被用来确定底层INM及其发展神经上皮包括视网膜^{9，11，12，13}的功能的机制。然而，管理在成人视网膜再生的INM机制尚未研究了很多细节外部参照"> ^6，7，活细胞成像将推动我们在成人视网膜再生控制INM的信号通路知识的宝贵途径。

直到最近，在视网膜INM的活细胞成像限于任一活斑马鱼的胚胎或胚胎鸡或产后小鼠视网膜植^{9，10，11，12，14，15，16。}而从各种物种的成年动物，包括小鼠，大鼠和斑马鱼视网膜植已被用于不同的细胞生物学方法^{17，18，19，20，}利用视网膜植公顷活细胞成像实验已经被限制向大家介绍的时间段，并没有被数小时^21,22连续执行。在这里，我们描述了一个详细的协议，以文化的光损伤成年斑马鱼视网膜利用多光子显微镜⁶进行活细胞成像实验监测INM。调查控制INM机制时，作为INM的动态， 例如，速度可能会受到影响，而不是有丝分裂的位置，这将潜在地不使用免疫细胞化学来检测活细胞成像的方法是通过免疫组织化学方法是有利的。

在将来，这种方法有也可能被修改，以研究视网膜再生期间其它动态过程，如垂死由米勒胶质或小胶质细胞的行为的光感受器的吞噬作用。

注:斑马鱼中提出并维持在Freimann生命科学中心在巴黎圣母院斑马鱼设施。在这个手稿中描述的方法是通过巴黎圣母院动物护理和使用委员会批准的大学，并符合在视觉与眼科视觉研究中使用动物的研究协会的声明。

1.解决方案

1. 制备70％的乙醇消毒的组织培养罩和任何设备/被转移到组织培养罩试剂。
2. 添加2mL的2-苯氧基乙醇的1升系统水（1:500 2-苯氧基乙醇）。
3. 制备0.1mM的_碳酸氢钠 ，pH值8.0。使用一个10毫升的注射器和一个0.2微米的孔径的注射器过滤器进行消毒在无菌组织培养罩的溶液。
   注: _碳酸氢钠被用于有效地分布在fluorodishes的盖玻片表面的细胞和组织粘合剂（见步骤3.2）。
4. 制备的1.0M的CaCl ₂和1.0M的MgCl _2。用10毫升的注射器和0.2微米孔径的注射器过滤器在无菌组织培养罩消毒。
5. 为了制备Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，在每1 1mM的终浓度添加无菌的CaCl ₂和无菌的MgCl ₂至1×HBSS不含Ca ²⁺ / Mg ^2+离子 ，无酚红。在无菌的环境中工作。
6. 为了准备培养液，混合50％1X最低基本培养基（MEM）无酚红，25％含有_氯化钙和_氯化镁 HBSS（参见1.4节），25％马血清（HS），10单位/ ml青霉素，和10微克/毫升链霉素。在无菌的环境中工作。
   注:避免含有酚红培养基，因为它autofluoresces，从而影响信噪比。 ²³
7. 制备10毫升在1×MEM 1％低熔点琼脂糖的无酚红。熔融琼脂糖/ 1X MEM一个microwAVE。制备琼脂糖（ 例如，10毫升），为重复的再加热的小体积将发生变化，由于流体蒸发离子浓度。
8. 以培养前，高压灭菌1.5毫升离心管。

2.光损伤范式

1. 暗适应
   1. 放置2 - 3 的Tg [GFAP:nGFP] ^mi2004斑马鱼（或其它感兴趣的转基因斑马鱼）6 - 14月龄的成用于14天缺乏轻的环境。对于进一步的细节见参考文献^{2，6，24，25。}
2. 在系统中的水可释放2800勒克斯^{2，6，24，25}的光日光灯二支3之间的暗适应转基因斑马鱼-含2坦克的位置。 斑马鱼暴露恒强光35小时。在曝光，保证水温维持31之间 - 33°C。

3.准备培养（视网膜隔离的日子）

1. 用70％的乙醇，灭菌组织培养罩和部件/被转移到组织培养罩的工具（ 例如，含有MEM和HBSS，移液器，无菌吸头， 等等烧瓶）。
2. fluorodishes的制备
   1. 涂布一层FluoroDish中用于细胞和组织粘合剂视网膜每一个（见材料表 ）。
   2. 稀释在0.1毫米的NaHCO ₃中的细胞和组织粘合剂至70微克/毫升的终浓度，加入50μL的每个FluoroDish中，并用200微升枪头传播穿过FluoroDish中的中心的溶液（约1 - 1.2厘米直径的）。
   3. 孵育涂fluorodishes 1 - 在室温3小时（或者，孵育O / N在4°C）。
   4. 除去溶液，并用500μL的1×MEM的每次洗涤漂洗3次。为了避免干燥涂层fluorodishes，维护他们MEM直到视网膜外植体安装。
3. 如步骤1.6说明准备培养基。培养基可存放在4℃长达1周℃。

4.视网膜外植体的分离和培养

注意:下面概述的协议是用于背侧视网膜，这是主要是由所描述的光损伤范例损伤视网膜区域的隔离。因此，损伤诱导的增殖和interkinetic核迁移相关的事件发生在视网膜背。然而，分离步骤可以调节根据研究者/研究问题的具体要求，以产生视网膜的区域。

1. 安乐死一盏灯损坏的转基因斑马鱼一た时间在1:500 2-苯氧基乙醇。
2. 从一个FluoroDish中与1000微升吸管除去MEM使得仅流体遗体的薄膜。
3. 转移斑马鱼到干纸巾，具有弯曲一对杜蒙钳（钳子＃5，45°角）的去除眼睛，并将其转移到FluoroDish中。
4. 利用体视显微镜，东方与眸到FluoroDish中的盖玻片使眼睛与视神经背面是可见的（ 图1D）。
5. 有一对麦弗逊式Vannas剪刀除去视神经，切割靠近眼睛的后部。此外，除去结缔组织衬眼睛的外部。
6. 持其鼻和颞侧之间的眼用一对＃5钳子而用通过筛板1剪刀刀片刺入并沿着鼻和眼睛的颞两侧切割使得在视柄切口（ 见图1E ，分段李NE）。
7. 使用两对的＃5镊子，一个用于保持视网膜的背侧，另一对向腹侧从背视网膜分离，拉组织。
   注意:这是可取使得透镜和神经节细胞层面临盖玻片而巩膜朝上定向背侧视网膜。
8. 带有一对＃5镊子除去从背视网膜巩膜，同时保持连接到视网膜与第二对＃5镊子（ 图1H，Ⅰ）的透镜。
9. 若要取下镜头，使用麦弗逊式Vannas剪刀切镜头后面不破坏视网膜（ 图1I，J）。有时，透镜在步骤4.7中分离。在这种情况下，通过用第二对＃5钳子保持在视网膜在切割边缘仔细移除巩膜用钳子。
10. 除去玻璃体而不会损坏视网膜取下镜头。弄平朝向盖玻片的神经节细胞层中的视网膜所述FluoroDish中的（ 图1L中，M）。
11. 围绕用1％低熔点琼脂糖10μL的视网膜和让琼脂糖固化。
12. 手表液体琼脂糖不解除视网膜，因为即使有轻微的升高可能会影响到重点深入到组织的能力。如果观察到吊装，用吸管去除琼脂糖。尝试添加更多的之前，让残留的琼脂糖集。
13. 重复步骤4.12几次加入1％低熔点琼脂糖覆盖整个FluoroDish中之前。一旦琼脂糖凝固，加入1.5毫升的培养基。
14. 保持在大约12小时设定在32℃的5％CO ₂ /空气环境中的视网膜外植体培养，以允许视网膜从由隔离过程产生的应力恢复。设定温度为32℃，以保持在相同的温度下的光处理的斑马鱼视网膜（参见步骤2.3）。

5.多光子显微镜

材料表 ），40倍的Apo长距离水浸泡的目的（NA 1.15）多光子显微镜，检流计扫描仪和进行优化环境室，其中包含四张35 25mm培养皿的插入物。的图像与非退扫描检测器（R-NDD）获得的。

1. 成像之前，平衡的环境室，以达到5％的CO ₂ /空气的气氛。确保空培养皿插入保持器，以避免气体的漏入房间。
2. 打开显微镜系统。
3. 一旦环境室平衡，增加折射率液体到40X阿波长距离水浸泡的目的（NA 1.15）。
   注意:与水相似的光学性质的折射率液体被用来避免长期成像期间的水蒸发。
4. 地方感视网膜植入腔室orodishes。使用明场光，将试样放置到光路和使背视网膜中区成为焦点的平面。
5. 使用GFP啶光集中于GFAP:nGFP阳性穆勒神经胶质细胞的细胞核（ 图2A，C）。
   注:如果植体未安装平面或外植下琼脂糖积累，这将是困难的聚焦在GFAP:nGFP阳性核或他们将朦胧荧光。
   1. 检查是否移动到不同的区域相同的视网膜内植克服聚焦问题。否则移动到不同的视网膜外植体。
6. 在图像采集软件，打开"A1 MP界面"中，"TiPad"中，"A1紧凑的GUI"和"ND采集"窗口。对于多光子成像，确保"IR NDD"选项中选择的是"A1紧凑型图形用户界面"。
7. 在'设置搜索G'字段中，选择IR-DM为1 ^日分色镜，并选择带通滤波器五十零分之五百二十五获得绿色荧光。
8. 交换机上标有"A1MP GUI"窗口中的红外激光。这将需要几分钟的激光做好准备。波长设置为910 nm的激发GFP荧光，并通过点击"A1 MP GUI"窗口中的"自动对齐"按钮调整激光。
9. 确保室和装备灯被关闭或在"A1 MP GUI'打开快门，以避免光电倍增管的过度曝光之前覆盖。为了降低噪音水平，安置在黑暗的环境显微镜。
10. 获得的视图的300×300像素，场的图像在两变焦和4.8微秒/像素的像素住宅时间。大致由"A1MP GUI"，并在"A1紧凑型GUI"窗口中的增益改变了"收购区"设立了激光功率。
11. 设置的Z轴堆叠
    1. 聚焦神经节细胞层上设置ND采集"窗口"的内Z'-子窗口"中的z堆栈顶部焦平面。一些GFAP:nGFP阳性细胞通常位于神经节细胞层，这有助于识别视网膜（ 图2A中的D）的基极限。
    2. 通过ONL的水平移动焦平面（ 图2A，B），其特点是模糊地标记GFAP的存在:圆形和扩大相对对口的INL（ 图2A，C）是nGFP阳性细胞。
    3. 设置该平面的z堆栈的底部。确保整个ONL将被成像（ 图2A，B）。
    4. 而当经历焦平面的变化在成像时期，需要重新调整，在"Z"子窗口的中间位置双击将其指定为"家"的位置。切换到"对称模式下定义"单击"相对"。
    5. 0.7之间的z步长设置为1微米。
12. Z-强度校正:
    1. 应用Z-强度修正，以补偿像素亮度的损失，由于光散射时，在组织深层成像。
    2. 要设置校正，打开"Z-强度校正"窗口。要设置"Z-堆栈范围"，选择"从ND"。
    3. 在'的z强度校正'窗口（在'A1MP GUI'采集区域"）和增益（A1紧凑的GUI点击底部焦平面（在这种情况下，对应于神经节细胞层），并设置激光强度）。
    4. 点击"Z-强度校正"窗口旁边的"Z值"的箭头，以确认在为所选焦平面'Z-强度校正"窗口下的"设备设置"随后显示的设置。
    5. 重复这个过程中间第二顶面，增加了激光功率和增益。附加焦平面可以根据需要添加。请参阅表1对图2的实验特定的激光和增益设置- 4。
    6. 坐落在"A1 MP GUI"窗口中的"购置面积"。避免选择采集面积大于15，并在成像规避漂白的开始的增益高于126和增加的噪声水平。
       注:由于激光和光电倍增管显微镜系统，测试激光增益设置有所不同，以获得成立，同时避免漂白显微镜最佳成像条件。
    7. 在"Z-强度校正"窗口中，选择"相对强度校正"。
13. 在"ND收购"窗口中的"时间序列"子窗口，设置持续时间8小时，间隔以"无延迟"。然后，请务必点击T中的"运行Z-校正"在"ND收购"窗口按钮，他"Z堆栈"子窗口收购3-D时间序列。
14. 29°C在整个图像采集的时间 - 在27的温度维持视网膜外植体。
15. 整个图像采集期间，如有必要，重新调节功率水平和增益，以维持对成像后分析图像质量。对于调整执行步骤5.11.2 - 5.11.4。
16. 如果焦平面变化，暂停或停止运行，并再次执行步骤5.11。
    注意:如果'相对z校正"之所以选择在步骤5.12.7并进行一步5.11.4它不应该是必要的调整功率和增益水平，除非发生大规模漂白。

6.速度分析

1. 提取时间，设定在图像上"感兴趣区域"。使用"时间测量"工具和时间值导出到电子表格。
2. 裁剪包含二的区域viding GFAP:nGFP阳性核。
3. 选择裁剪的区域，使得它至少包含一个核，这并不以设置参考点随后测量出分割核相对于基底的INL迁移的距离进行INM。注意:要选择留在基底INL核，它有助于准备时间序列的三维重建。
4. 或者，如果一个GFAP:在ONL观察整个采集期间nGFP阳性细胞，可使用固定长度从ONL细胞核到基底INL跨越的垂直线，以便确定一个参考点。
5. 使用"显示切片视图"功能，生成正交投影。随后，从改变'片'到'最大强度投影"的模式。
6. 关闭正交投影最大的"XY"视图。取决于在该迁移/除以核最好是可见的，一个方向LSO关闭无论是"xz'-或"yz'视图。
7. 单击其余图像上用鼠标右键，并提取创建一个从这个观点新文档"功能的"XZ"或"与yz'映像系列"。如果需要的话，旋转图像。
8. 在保留在基底INL和不经历INM核的底部水平使用'手工测量"功能，绘制在图像的水平线（=基准点; 图4A - E，红色水平线）。
9. 测量基准线和所述转移核，使用在分析软件的"在线测量"工具（ 见图4A - E）的时间序列的基点之间的距离。
10. 一旦核膜分解，测量胞体的基底位置，如果它是可识别的GFP扩散到整个细胞以下。
11. 使用电子表格软件，绘制距离NUcleus迁移针对传递（ 图4F）的时间。
    1. 要确定心尖移动速度（V _A），图的距离走过了核膜破裂前的时期出现（ 图4G）。
    2. 选择图表中的数据系列，右击鼠标并插入一个线性回归曲线，包括相应的函数'表达式y = mx + C'。在函数的斜率的"m"代表速度v _一个 （ 图4G）。
    3. 快速基底迁移的第一阶段重复步骤6.11.1和6.11.2来确定基底的移动速度，V _B（ 图4H）。

根据图1中的示意性概述的过程的视网膜的隔离允许扁平背侧视网膜培养从光受损成人的Tg [GFAP:nGFP]在5％CO历时至少24小时的mi2004斑马鱼2 /空气环境。这些平面安装视网膜植可用于在深部组织的层次图像焦平面。一个例子是米勒胶质/标记与来自穆勒特定胶质启动子GFAP（胶质纤维酸性蛋白）的GFP神经元祖细胞的细胞核被在光损坏视网膜有丝分裂期间位于ONL（ 图2A - D，3）。 nt19斑马鱼眼睛下视杆细胞表达EGFP:为了进一步证实，这种方法适用于图像的各种视网膜细胞层，从完好的Tg为Eco.NfsB-EGFP RHO]准备急性分离的视网膜植视紫红质启动子。 图2E - H显示，有可能获得GFP阳性视杆和它们的内段的图像。作为棒内段朝视网膜色素上皮锥光感受器之间延伸，这些数据将意味着它也有可能图像锥光感受器。这是不是然而进一步调查。

具有观察米勒胶质细胞/神经元祖细胞中的ONL在光损坏视网膜细胞核，我们详细表征（ 图3和电影1）他们的迁移行为。米勒胶质细胞/神经元祖细胞由绿色荧光蛋白标记的细胞核迁移双向的INL，他们通常驻留和ONL，感光体损的部位的基底位置之间。通常情况下，GFAP:nGFP阳性细胞核移植的INL短距离（ 图3A - C）他们经历了前核膜破裂，同时仍然位于INL，基于绿色荧光蛋白的再分配到整个米勒胶质细胞/神经元祖细胞（ 图3D）的细胞质中。继外核层细胞分裂，二GFAP:nGFP阳性核成为在回到基础INL（ 图3H - J）外核层（ 图3F，G）可见。当细胞分裂时，新产生的核起初非常暗淡，因此难以辨认（ 图3G）。然而，有丝分裂的一到两个时间框架内，核GFP荧光变得明亮了，这使核移植的可视化（ 图3H - J）。活细胞成像也允许的分割面（ 图3F，G），该水平发生视网膜用于图3中所示的细胞的顶端表面的可视化。它也是可行使用其它转基因斑马鱼线，例如作为Tg [GFAP:EGFP]表达在细胞质中的GFP NT11斑马鱼（未示出数据）。虽然可以可靠地确定心尖运动和水平的细胞分裂，它往往很难准确识别基部迁移子细胞核和垂直细胞分裂中的T g的位置[GFAP:EGFP] NT11斑马鱼视网膜（数据未显示）。

为了确定速度，一个GFAP:nGFP阳性细胞核未在整个录音期间迁移被选为参考点（明星， 图4A - E）。 -在最大XZ或图像系列的每个时间点nGFP阳性细胞核（E水平红线， 图4A）:在相对于参考GFAP测定-所述转移核（E垂直红线， 图4A）的距离YZ-突起（取决于在哪些角度晶核可以visuali捷思最有效）。该核迁移的距离被暗算的电子表格（ 图4F -高 ）的时间。核膜破裂常常在图中作为一个初始basalward运动观察由于在整个小区内的GFP的再分布（在此实例中的单元主体的基部大部分）。心尖速度为核膜破裂前确定，拟合线性回归曲线（灰色虚线， 图4G）来暗算的时候了核膜破裂前的时间段（红钻， 图4G）的距离。线性回归曲线（表达式y = mx + c）的斜率的"m"表示速度"DX / dt的'。对于在图4中呈现的细胞的顶端速度为10.89微米/小时。同样的方法用于计算初始快速基底运动速度的新形成的子细胞核的（V B）（ 图4F， H）。的子细胞D1和D2的-67.71和33.51微米/小时基底迁移速度V B，分别为同等比根尖速度更快。不幸的是，这是不可能的，以确定核膜破裂作为整个细胞扩散的GFP后根尖速度。取而代之的是，瞬时速度是基于核膜破裂和新形成的子细胞核的第一可视化前核的定时和位置来计算。的7.9微米/小时用于图4中所示的单元中的瞬时速度是可能是低估的染色质到达ONL之前末期有丝分裂的，当子细胞核可见。

总结，视网膜外植体的培养可以在成人再生斑马鱼视网膜和迁移和细胞分裂PA的判定INM的活细胞成像个体细胞核rameters。

图1:视网膜分离过程。 一 ）示意图说明斑马鱼的头与它的眼睛。 B）的眼睛从斑马鱼取出并导向显示眼睛与瞳孔的前面。 C）转动眼球180°，使眼与视柄（填充黑色圆圈）后面的（D变为可见）和瞳孔朝下。灰度颜色表示眼睛的巩膜的存在。 E）的一对麦弗逊式Vannas剪刀的一个刀片被插入眼睛的视柄（实心黑色圆圈）将其切割成其背侧和腹侧边这是由白色分割线表示。 F）眼背一半去除腹后半段。黑色半圈为T他对视柄的残留部分。 G）的转动眼90°向后以显示（H）的眼睛的内部与仍然由巩膜（灰线包围的视网膜（棕色），玻璃体（未示出）和透镜（L，浅灰色圆圈） ）。 我 ），巩膜被分离（注意，灰线缺失）和J）的晶状体和玻璃体去掉引起仅视网膜（棕色）。 K）视网膜旋转90°向前引起背视网膜（L）的平面式安装视图。 M）背视网膜外植体平板安装在玻璃底FluoroDish中。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:3-D重建视网膜多光子Z-堆栈。 A）多光子Z堆栈图像序列GFAP的三维重建:nGFP-阳性细胞的斑马鱼视网膜全安装的文化光损伤后48 h。 乙- D）GFAP单多光子XY-图片:在ONL（B）中，INL（C），相当于包含穆勒层的水平在（A三维重建显示）nGFP阳性细胞神经胶质细胞胞体和保利协鑫（D）。箭头（B）表示扩大一轮米勒的神经胶质细胞在ONL核膜破裂后。 E）多光子Z堆栈图像序列从完好的Tg视网膜外植体的三维重建[RHO:Eco.NfsB-EGFP] nt19斑马鱼。 的F -高 ）单多光子XY-图像在杆内段（RIS，F）中 ，杆的核层的水平（G），并在视网膜内层（H）的电平。 GCL，神经节细胞层; INL，内核层; ONL，外核层; RIS，杆内节。比例尺在A，D，E和H，10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:INM的延时摄影图片系列。 A - j）图片系列Z堆栈时光倒流系列三维重建显示Tg为GFAP:nGFP] mi2004的经历INM中（外核层视网膜外植体上排）来划分阳性细胞核。 1顶部迁移核和其基部迁移子细胞核的位置由红色箭头表示。红星有丝分裂过程表明核膜破裂。 一个- J，底部行），相同的图像系列作为最上面一行是过饱和和裁剪集中在ONL分裂细胞。 INL，内核层; IPL，内网层; ONL，外核层。比例尺在A，10微米，是B中的相同- J. 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:顶回和底偏移速度分析。 A - E）的z栈图像序列的Tg的最大YZ投影[GFAP:nGFP]在由多光子显微镜获得的缩时拍摄的不同时间点mi2004视网膜外植体。使用"人工测量'作用下的行工具，一个水平线被放置在基准小区的水平，由星号表示。垂直我asurement线被定位起始于水平线并延伸到迁移GFAP的基部位置:nGFP阳性核。测量线的长度在白盒上的图像和用于图像下可读性中给出。 L1的子细胞迁移1 =长度; L2的子细胞迁移2 =长度。 F）距离该小区（F0）在（A测量- E）顶部迁移，而且所产生的子细胞D1和D2在多光子慢速拍摄记录基部迁移。红线指示将其计算出的心尖迁移速度（V a）当黑色和灰色线表示用于计算基础迁移速度为D1和D2（V B），分别测量的测量结果。 G，H）的距离被暗算了核膜破裂（G之前心尖迁移在Excel中的时间）和快速的基础的阶段出于对女儿的单元格D1（H）的迁移。线性回归曲线拟合和功能都与代表速度的斜率的曲线图下方给出。 INL，内核层; IPL，内网状层; ONL，外核层。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1:激光增益电平用于Z-强度修正在不同的飞机为图2显示的实验- 4。

电影1:由多光子显微镜视网膜外植体活细胞成像。 （点击下载）。

作者什么都没有透露。