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方法文章

成年转基因斑马鱼视网膜外植体的培养及其通过多光子显微镜进行的活细胞成像

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DOI：

10.3791/55335

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2017年2月24日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

本文内容

摘要

斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。

摘要

成年斑马鱼中穆勒胶质细胞启动内源性再生程序 （斑马鱼））视网膜在神经元损伤和死亡后，穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，产生神经祖细胞，这些神经祖细胞经历多轮细胞分裂，并分化为缺失的神经元类型。穆勒胶质细胞和神经祖细胞的细胞核在视网膜的不同位置进行DNA复制并发生有丝分裂， 即 它们分别在内核层（INL）基底部和外核层（ONL）之间迁移，这一过程被称为核间期迁移（Interkinetic Nuclear Migration, INM）。INM 主要是在发育中的视网膜中被研究。为了详细观察成年斑马鱼视网膜再生过程中 INM 的动态变化，需要对荧光标记的穆勒胶质细胞/神经前体细胞进行活细胞成像。本文提供了分离和培养背侧视网膜的条件 Tg[gfap:nGFP]mi2004 暴露于持续强光下35小时的斑马鱼。我们还显示，这些视网膜培养物可用于活细胞成像实验，利用多光子显微镜连续获取视网膜外植体全厚度范围内的z轴层扫图像，持续时间长达8小时，以监测细胞迁移行为 gfap:nGFP阳性细胞。此外，我们详细描述了成像后分析的具体步骤，以确定顶端和基底INM的移动速度。综上所述，我们建立了在成年神经元再生模型中研究INM动态过程的实验条件。这将有助于深入理解这一关键的细胞过程，并使我们能够揭示调控INM的分子机制。

引言

与人类不同，斑马鱼（Danio rerio）在视网膜神经元发生细胞死亡后表现出强烈的再生反应1,2,3,4。视网膜神经元死亡时释放的信号分子肿瘤坏死因子α可诱导位于视网膜内核层（INL）基底部的穆勒胶质细胞增殖5，并产生神经前体细胞；这些前体细胞在分化为已死亡的神经元类型之前会持续增殖2,3,4。在再生反应的增殖阶段，穆勒胶质细胞及其衍生的神经前体细胞的细胞核会随着细胞周期发生重复性的迁移运动（即核间期迁移，INM）6,7。位于内核层基底部的细胞核首先在该区域复制其DNA，随后迁移至外核层（ONL），在该层完成分裂，新生的细胞核再返回至内核层的基底部。这一过程最早通过组织学方法在神经上皮发育过程中被描述，而后续的活细胞成像研究进一步证实了Sauer提出的解释8,9,10,11,12。组织化学和活细胞成像方法均已被用于研究INM在发育中的神经上皮（包括视网膜）中的机制及其功能9,11,12,13。然而，成年斑马鱼视网膜再生过程中调控INM的机制尚未被深入研究6,7。活细胞成像技术将成为推动我们理解成年再生视网膜中调控INM信号通路的宝贵手段。

直到最近，对视网膜中核膜内陷（INM）的活细胞成像仅限于活体斑马鱼胚胎，或鸡胚胎及出生后小鼠视网膜外植体9,10,11,12,14,15,16尽管已利用包括小鼠、大鼠和斑马鱼在内的多种物种的成年动物视网膜外植体进行不同的细胞生物学研究17,18,19,20，使用视网膜外植体进行的活细胞成像实验仅限于短暂时间，且无法持续数小时连续进行21,22在此，我们描述了一种详细的方案，用于培养光损伤的成年斑马鱼视网膜，以开展活细胞成像实验，利用多光子显微镜监测核内迁移（INM）。6活细胞成像技术在研究控制核内有丝分裂（INM）的机制时相较于免疫组织化学方法具有优势，因为该技术能够揭示INM的动力学过程， 例如， 速度可能会受到影响，而非有丝分裂的位置，而免疫细胞化学方法可能无法检测到这种变化。

未来，该方法还有望经过改进，用于研究视网膜再生过程中的其他动态事件，例如穆勒胶质细胞对凋亡光感受器的吞噬作用，或小胶质细胞的行为。

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方案

注：斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本论文所述方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会批准，并符合视觉与眼科研究协会关于动物在视觉研究中使用的声明。

1. 溶液

  1. 准备70%乙醇，用于对组织培养超净台及转入组织培养超净台的所有设备/试剂进行消毒。
  2. 将2 mL 2-苯氧乙醇加入1 L系统用水中（1:500 2-苯氧乙醇）。
  3. 配制0.1 mM NaHCO3，pH 8.0。在无菌组织培养超净台中，使用10 mL 注射器和孔径0.2 µm的注射器滤器对溶液进行除菌。
    注意：NaHCO3 可用于有效铺展细胞和组织黏附剂于荧光培养皿的盖玻片表面（见步骤3.2）。
  4. 配制1.0 M CaCl2和1.0 M MgCl2。在无菌组织培养超净台中，使用10 mL注射器和孔径0.2 µm的注射器滤器进行除菌。
  5. 配制Hank's平衡盐溶液（HBSS）时，将无菌CaCl2和无菌MgCl2 加入不含Ca2+/Mg2+、不含酚红的1x HBSS中，终浓度均为1 mM。操作需在无菌环境中进行。
  6. 配制培养基时，在无菌环境中将以下成分混合：50%不含酚红的1x最低必需培养基（MEM）、25%含CaCl2和MgCl2的HBSS（见步骤1.4）、25%马血清（HS）、10单位/mL青霉素和10 µg/mL链霉素。
    注意：避免使用含酚红的培养基，因其具有自发荧光，会影响信噪比。23
  7. 在不含酚红的1x MEM中配制10 mL 1%低熔点琼脂糖。使用微波炉加热溶解琼脂糖/1x MEM。建议配制小体积琼脂糖（例如，10 mL） ，因反复加热会导致水分蒸发，从而改变离子浓度。
  8. 培养前，通过高压灭菌对1.5 mL微量离心管进行灭菌。

2. 光损伤模型

  1. 暗适应
    1. 选取 2 - 3 Tg[gfap:nGFP]mi2004 转基因斑马鱼（或其他感兴趣的转基因品系），年龄为 6 - 14 个月，置于完全无光环境中进行 14 天的暗适应。具体操作细节参见文献2, 6, 24, 25。
  2. 将含有 2 - 3 条经暗适应处理的转基因斑马鱼的饲养缸置于系统水中，并放置在两盏荧光灯之间，光照强度为 2,800 lux2, 6, 24, 25。
  3. 以持续高强度光照暴露斑马鱼 35 小时。在光照期间，确保水温维持在 31 - 33 °C 之间。

3. 培养前准备（视网膜分离当天）

  1. 使用70%乙醇对组织培养超净台以及转移至组织培养超净台内的组分/工具进行消毒例如， 含 MEM 和 HBSS 的培养瓶、移液管、无菌移液管吸头 等等.).
  2. 氟化培养皿的制备
    1. 为每只视网膜准备一个氟化培养皿，用细胞和组织粘附剂包被（参见 材料表).
    2. 将细胞和组织粘附剂用 0.1 mM NaHCO₃ 稀释3 终浓度为70 µg/mL，向每个荧光培养皿中加入50 µL，并用200 µL移液枪头将溶液在荧光培养皿中央涂布成直径约1 - 1.2 cm的区域。
    3. 将包被的荧光培养皿在室温下孵育1 - 3小时 （或者在4 °C下孵育过夜）。
    4. 吸除溶液，每次用 500 µL 的 1x MEM 洗涤 3 次。为防止包被的荧光培养皿干燥，需将其保留在 MEM 中，直至视网膜外植体安装完毕。
  3. 按照步骤1.6所述配制培养基。培养基可在4 °C保存最多1周。

4. 视网膜外植体的分离与培养

注意：以下方案适用于分离背侧视网膜，该区域是上述光损伤模型中主要受损的视网膜区域。因此，损伤诱导的细胞增殖及相关联的核间期迁移事件均发生在背侧视网膜。然而，分离步骤可根据研究人员或研究问题的具体需求进行调整，以获取不同的视网膜区域。

  1. 每次使用1:500的2-苯氧基乙醇处死一只光损伤的转基因斑马鱼。
  2. 用1,000 µL移液器从一个荧光培养皿中移除MEM，仅保留一层薄薄的液体。
  3. 将斑马鱼转移至干燥的纸巾上，使用弯头Dumont镊子（#5号镊子，45°角）摘除眼球，并将其转移至荧光培养皿上。
  4. 在体视显微镜下，将眼球调整方向，使瞳孔朝向荧光培养皿的盖玻片，确保带有视神经的眼球后部可见（图1D）。
  5. 使用McPherson-Vannas剪刀切除视神经，剪切位置应靠近眼球后部。此外，清除覆盖在眼球外侧的结缔组织。
  6. 用一对#5号镊子夹住眼球的鼻侧和颞侧，在视神经乳头处用剪刀刀尖刺穿筛板，并沿眼球鼻侧和颞侧进行剪切（见图1E，虚线所示）。
  7. 使用两对#5号镊子，一对固定视网膜背侧，另一对将腹侧视网膜与背侧分离，轻轻拉伸组织。
    注意：建议将背侧视网膜调整至晶状体和神经节细胞层朝向盖玻片，而巩膜朝上。
  8. 用一对#5号镊子去除背侧视网膜上的巩膜，同时用另一对#5号镊子夹住与视网膜相连的晶状体（图1H, I）。
  9. 为去除晶状体，使用McPherson-Vannas剪刀在晶状体后方剪切，注意不要损伤视网膜（图1I, J）。有时晶状体在步骤4.7中已自行分离。在此情况下，用镊子小心去除巩膜，同时用第二对#5号镊子夹住视网膜的切缘。
  10. 在去除晶状体的同时清除玻璃体，注意不要损伤视网膜。将视网膜展平，使神经节细胞层朝向荧光培养皿的盖玻片（图1L, M）。
  11. 用10 µL的1%低熔点琼脂糖围绕视网膜，并让琼脂糖凝固。
  12. 注意液态琼脂糖不得将视网膜抬起，因为即使轻微抬升也可能影响对组织深层的聚焦。若观察到抬升现象，应使用移液器吸除多余琼脂糖。待残留琼脂糖凝固后，再尝试添加更多琼脂糖。
  13. 在向整个荧光培养皿覆盖1%低熔点琼脂糖之前，重复步骤4.12数次。待琼脂糖完全凝固后，加入1.5 mL培养基。
  14. 将视网膜外植体培养物置于5% CO2/空气环境中，温度设定为32 °C，持续约12小时，以使视网膜从分离操作造成的应激中恢复。将温度设为32 °C，以保持视网膜与经光照处理的斑马鱼体内温度一致（见步骤2.3）。

5. 多光子显微镜

注意：本论文中进行的实验针对配备红外激光器（见材料表）、40倍高数值孔径长工作距离水浸物镜（数值孔径1.15）、检流计扫描器以及可容纳四个35 mm培养皿插件的环境培养室的多光子显微镜进行了优化。图像使用非共轭扫描探测器（R-NDD）采集。

  1. 成像前，将环境培养箱平衡至5% CO₂条件2/空气环境。确保将空的培养皿插入支架中，以避免气体泄漏到室内。
  2. 打开显微镜系统。
  3. 待环境室平衡后，将折射率液体加至40倍平场复消色差长工作距离水浸物镜（数值孔径1.15）上。
    注意：使用光学性质与水相似的折射率匹配液，以避免在长时间成像过程中水的蒸发。
  4. 将含有视网膜外植体的荧光培养皿放入腔室中。使用明场光照，将样本置于光路中，并使背侧视网膜的中段区域处于焦平面上。
  5. 使用GFP落射荧光光源聚焦于 gfap:nGFP-阳性 Müller 胶质细胞核（图2A，C).
    注意：如果外植体未平整固定或琼脂糖积聚在外植体下方，则难以聚焦到目标区域 gfap:nGFP阳性细胞核或荧光微弱。
    1. 检查在同一视网膜外植体内的不同区域移动是否可克服聚焦问题。否则，更换为另一个视网膜外植体。
  6. 在图像采集软件中，打开“A1 MP GUI”、“TiPad”、“A1 Compact GUI”和“ND acquisition”窗口。进行双光子成像时，确保在“A1 Compact GUI”中选择“IR NDD”选项。
  7. 在“设置”字段中，为1选择IR-DMst 二向色镜并选择525/50带通滤光片以采集GFP荧光。
  8. 在标有“A1MP GUI”的窗口中打开红外激光器。激光器需要几分钟时间才能准备就绪。将波长设置为910 nm以激发GFP荧光，并在“A1 MP GUI”窗口中点击“自动对准”按钮来对准激光器。
  9. 确保在打开“A1 MP GUI”中的快门之前，关闭或遮蔽房间和设备的光源，以避免光电倍增管过曝。为降低噪声水平，应将显微镜置于暗环境中。
  10. 以300 × 300像素的视野范围、2倍放大倍数和每像素4.8 µs的像素驻留时间采集图像。通过调整“A1MP GUI”中的“采集区域”以及“A1 Compact GUI”窗口中的增益，大致设置激光功率。
  11. 设置Z轴堆栈
    1. 聚焦至神经节细胞层，以在“ND采集”窗口的“z”子窗口中设置z轴堆栈的顶部焦平面。某些 gfap:nGFP阳性细胞通常位于节细胞层，有助于识别视网膜的基底边界（图2A，D).
    2. 移动焦平面至外核层（ONL）水平图 2A，B），其特征是存在弱标记的 gfap:nGFP-阳性细胞，其形态呈圆形且较内核层（INL）中的对应细胞增大图2A、C).
    3. 将此平面设为z轴堆叠的底部。确保整个外核层（ONL）均被成像（图2A、B).
    4. 当在成像期间遇到需要重新调整的焦平面漂移时，双击“z”子窗口中的中间位置，将其设为“home”位置。切换至“symmetric mode defined”，然后点击“relative”。
    5. 将 z 轴步长设置在 0.7 到 1 µm 之间。
  12. Z轴强度校正：
    1. 对深层组织成像时因光散射导致的像素强度衰减进行z轴强度校正。
    2. 设置校正时，打开“z-intensity 校正”窗口。在设置“z-stack 范围”时，选择“From ND”。
    3. 在“z-intensity 校正”窗口中点击底部焦平面（本例中对应于节细胞层），并设置激光强度（“A1MP GUI”中的“acquisition area”）和增益（A1 Compact GUI）。
    4. 单击“z-intensity correction”窗口中“z-values”旁边的箭头，以确认随后在“z-intensity correction”窗口的“device settings”下为所选焦平面显示的设置。
    5. 对中间和顶部平面重复该过程，逐步增加激光功率和增益。如有需要，可添加额外的焦平面。参见 表1 针对实验中的特定激光和增益设置 图2 - 4.
    6. 在“A1 MP GUI”窗口中设置“采集区域”。开始成像时，避免选择大于15的采集区域和高于126的增益，以防止光漂白和噪声水平升高。
      注意：由于不同显微镜系统的激光器和光电倍增管存在差异，需测试激光功率和增益设置，以获得最佳成像条件，同时避免光漂白。
    7. 在“z轴强度校正”窗口中选择“相对强度校正”。
  13. 在“ND 采集”窗口的“时间序列”子窗口中，将持续时间设置为 8 h，间隔设置为“无延迟”。然后，务必点击“ND 采集”窗口中“z-层扫描”子窗口内的“运行 z 轴校正”按钮，以获取三维时间序列图像。
  14. 在整个图像采集过程中，将视网膜外植体维持在27 - 29 °C的温度条件下。
  15. 在整个图像采集期间，如有必要，应重新调整功率水平和增益，以保持图像质量，便于后续成像分析。如需调整，请执行步骤 5.11.2 - 5.11.4。
  16. 如果焦平面发生偏移，暂停或停止运行，并重新执行步骤 5.11。
    注意：如果在步骤 5.12.7 中选择了“相对 z 轴校正”，且已执行步骤 5.11.4，则无需重新调整激光功率和增益水平，除非发生严重的光漂白。

6. 速度分析

  1. 在图像上选取时间区域，设置“感兴趣区域”，使用“时间测量”工具并将时间值导出至电子表格。
  2. 裁剪包含正在分裂的 gfap:nGFP-阳性细胞核的区域。
  3. 选择裁剪区域时，应包含至少一个未发生核内迁移（INM）的细胞核，以便建立参考点，用于后续测量分裂细胞核相对于内核层基底部（basal INL）的迁移距离。 注意：为选择始终位于内核层基底部的细胞核，建议制备该时间序列的三维重建图像。
  4. 或者，若在整个采集期间均观察到位于外核层（ONL）的 gfap:nGFP-阳性细胞，则可使用一条长度固定的垂直线，从该ONL中的细胞核延伸至内核层基底部，以确定参考点。
  5. 使用“显示切片视图”功能生成正交投影，随后将模式从“切片”更改为“最大强度投影”。
  6. 关闭正交最大强度投影中的“xy”视图。根据迁移/分裂细胞核最清晰的观察方向，进一步关闭“xz”或“yz”视图之一。
  7. 用鼠标右键单击剩余图像，使用“从此视图创建新文档”功能提取“xz”或“yz”图像序列。如有需要，可对图像进行旋转。
  8. 使用“手动测量”功能，在始终停留在内核层基底部且未发生INM的细胞核底部水平位置绘制一条水平线（= 参考点；图4A - E，红色水平线）。
  9. 利用分析软件中的“线性测量”工具，测量该时间序列中参考线与迁移细胞核基底端之间的距离（见 图4A - E）。
  10. 一旦核膜破裂，若绿色荧光蛋白（GFP）扩散至整个细胞后仍可识别胞体位置，则测量胞体的基底位置。
  11. 使用电子表格软件，绘制细胞核迁移距离随时间变化的曲线（图4F）。
    1. 为确定向顶迁移速度（va），绘制核膜破裂前时间段内的迁移距离曲线（图4G）。
    2. 选中图表中的数据序列，右键单击并插入线性回归曲线，同时显示对应的函数表达式“y=mx+c”。其中斜率“m”即代表迁移速度 va（图4G）。
    3. 重复步骤6.11.1和6.11.2，针对快速向基底迁移的第一阶段，计算基底迁移速度 vb（图4H）。

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结果

根据图1示意图中所述步骤分离视网膜，可在5% CO2/空气环境中对光损伤的成年Tg[gfap:nGFP]mi2004斑马鱼的展平背侧视网膜进行至少24小时的培养。这些平铺的视网膜外植体可用于对深层组织层面进行成像。例如，在光损伤视网膜中，利用Müller胶质细胞特异性启动子gfap（胶质纤维酸性蛋白）驱动GFP标记的Müller胶质细胞/神经前体细胞核在有丝分裂期间位于外核层（ONL）（图2A - D, 3）。为进一步验证该方法适用于观察不同视网膜细胞层，我们从未经损伤的Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19斑马鱼眼球中急性分离视网膜外植体，该品系在视紫红质（rhodopsin）启动子驱动下于视杆光感受器中表达EGFP。图2E - H显示，可成功获取GFP阳性视杆光感受器及其内节的图像。由于视杆内节延伸于视锥光感受器之间并朝...

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讨论

研究成年斑马鱼视网膜损伤后再生机制的工作主要采用免疫细胞化学方法5,25,26,27,28,29,30。建立视网膜外植体培养条件，并对诸如核内有丝分裂（INM）等现象进行活细胞成像，使我们能够获得详细的空间和时间信息。该技术可用于确定细胞核迁移速度、有丝分裂前期核膜破裂的时间与位置，以及细胞分裂的长度和位置。此外，还可确定分裂平面以及子代细胞的命运及其后续定位。最终，这一强大方法将揭示在视网膜再生过程中，穆勒胶质细胞与神经前体细胞在INM行为上是否存在差异。利用转基因斑马鱼品系，可在视网膜再生反应的不同阶段特异性标记增殖细胞，有助于解析这些差异性行为

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 William Archer 及圣母大学综合成像中心提供的支持。特别感谢圣母大学弗赖曼生命科学中心的技术人员，感谢他们持续的帮助以及对斑马鱼的悉心照料和饲养管理。本研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所对 DRH 的资助（项目编号：R01-EY018417、R01-EY024519）以及圣母大学斑马鱼研究中心（位于美国印第安纳州圣母大学）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dumont 镊子 #5World precision instruments14098
Dumont 镊子 #5，45° 角World precision instruments14101
McPherson-Vannas 剪刀World precision instruments501233
FluordishesWorld precision instrumentsFD35-100
体视显微镜Nikon SMZ-1B类似型号的解剖用体视显微镜亦可使用
生物安全柜 A2 级Labconco同等类型可使用
组织培养孵箱ThermoscientificHEPA-100 级同等类型可使用
Sylvania 荧光灯管 OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 µm 孔径 Acrodisc 注射式滤器VWR4192
10 mL 鲁尔锁式注射器VWRBD309604
60 mL 鲁尔锁式注射器VWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
不含 Ca2+ 和 Mg2+、不含酚红的 HBSS，GibcoThermoScientific14175-095
不含酚红的 MEM，GibcoThermoScientific5100-038
马血清，经热灭活ThermoScientific26050-070
青霉素/链霉素VWR16777-164
超纯低熔点琼脂糖ThermoScientific16520-100
乙醇，纯品ThermoScientificBP2818-4
2-苯氧基乙醇Sigma77699
Corning Cell-Tak 细胞和组织粘合剂 VWR354240
折射率匹配液 Cargille Lab1803Y
配备 MaiTai 红外激光器的 Nikon A1 多光子显微镜Nikon同等系统可使用
40X Apo 长工作距离水浸物镜（数值孔径 1.15）
配备 35 mm 培养皿插件的环境培养室Okolab同等系统可使用
NIS 分析软件Nikon

参考文献

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