通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

摘要

本文介绍一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺组织中分离胰腺微环境中细胞的方法，重点在于间充质细胞的分离。该方法可用于分析细胞的基因表达和蛋白质分泌，从而阐明调控胰腺发育、功能及肿瘤发生过程中的外在信号。

摘要

胰腺由上皮细胞构成，这些细胞在食物消化和血糖调节中起必需作用。研究表明，胰腺微环境中的细胞（包括内皮细胞、神经元细胞和间充质细胞）可调控胚胎胰腺中的细胞分化与增殖。在成体中，胰岛素生成细胞的功能和数量依赖于其微环境中的细胞，包括周细胞、免疫细胞、内皮细胞和神经元细胞。最后，胰腺微环境的改变被证明可调控胰腺肿瘤的发生。然而，介导这些过程的具体信号尚不完全明确。因此，鉴定构成胰腺微环境的不同细胞类型，并分析其基因表达谱，对于阐明正常及疾病状态下胰腺组织的发育与功能至关重要。本文介绍了一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺中分离间充质细胞的方法。该方法利用酶消化小鼠胰腺组织，随后对标记的细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）或流式细胞术分析。细胞可通过表面标志物的免疫染色或荧光蛋白的表达进行标记。细胞分离有助于鉴定胰腺间充质细胞中表达的基因和蛋白质。本方案已成功用于从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺中分离并培养高纯度的间充质细胞群体。

引言

哺乳动物的能量稳态和食物消化依赖于胰腺的正常功能。成年胰腺主要由两个细胞区室组成：外分泌部和内分泌部。外分泌细胞包括产生和分泌消化酶的腺泡细胞，以及将这些酶转运至肠道的导管细胞，占胰腺总质量的80%以上¹。内分泌细胞包括产生胰岛素的β细胞和产生胰高血糖素的α细胞，它们聚集形成朗格汉斯胰岛，散布于外分泌组织中，通过分泌激素调节血糖水平²。

胰腺细胞通过一个高度调控的多步骤过程获得其分化命运³。研究表明，神经细胞、内皮细胞和间充质细胞提供的外在信号在胚胎中引导胰腺细胞的分化与增殖^3,4,5。其中一个例子是主动脉对早期胰腺前体细胞特化的必要性⁶。在发育后期，内皮细胞被证明在胰腺内分泌和外分泌细胞的发育中起核心作用，并能促进β细胞的分化^4,6,7。间充质细胞被证明可通过分泌生长因子Fgf10主要支持共同胰腺前体细胞的存活与扩增^8,9。我们进一步证明，这些细胞支持胚胎胰腺中内分泌和外分泌前体细胞以及分化细胞（包括腺泡细胞和β细胞）的增殖⁵。最近，间充质细胞还被证明可调控内分泌细胞的分化¹⁰。

在成体中，β细胞的功能和数量依赖于其微环境中的细胞，包括神经细胞、免疫细胞、内皮细胞以及周细胞^11,12,13。在损伤过程中，内皮细胞被证实可募集免疫细胞至胰腺，以促进β细胞的复制¹³。此外，内皮细胞还被证明可产生细胞外基质（ECM）成分，以支持胰岛素表达和β细胞功能¹⁴。我们最近证实了胰岛周细胞对β细胞功能的必要性¹¹。最后，胰腺间质细胞被证明可调控胰腺导管腺癌（PDAC）的进展^15,16。然而，指导胰腺发育、功能及肿瘤发生的外在信号分子在很大程度上仍不清楚。

确定胰腺微环境中细胞所提供的信号线索，需要对这些细胞所表达的基因和蛋白质进行表征。这依赖于从胰腺中分离出这些细胞，以开展基因表达和蛋白质组学分析，和/或建立细胞系。本文提出一种利用组织酶解结合荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于分离胰腺微环境中的间充质细胞，该方法适用于经免疫荧光标记的细胞或表达荧光蛋白的细胞。该方案已成功用于分离和分析胚胎期、新生期及成年期胰腺中表达黄色荧光蛋白（YFP）的间充质细胞^5,17。

方案

实验按照特拉维夫大学动物研究委员会批准的方案进行。

1. 小鼠胰腺组织的分离

1. 对于成年小鼠：
   1. 配制消化缓冲液：将 0.4 mg/mL 胶原酶 P 和 0.1 ng/mL DNase I 溶解于汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。每只小鼠在 15 mL 圆锥形离心管中新鲜配制 5 mL 缓冲液，并在使用前置于冰上保存。
   2. 根据机构指南实施小鼠安乐死。
   3. 解剖每只小鼠以取出胰腺（操作说明请参见参考文献 18）；将其置于含有 HBSS 的培养皿中。此步骤可在体视显微镜下进行，为提高消化效率，可将组织切成 2–4 块。
   4. 将胰腺组织放入含有消化缓冲液（步骤 1.1.1 中配制）的离心管中。在所有小鼠完成解剖并收集胰腺组织前，将离心管保持在冰上。
   5. 对剩余小鼠重复步骤 1.1.2–1.1.4。
2. 对于胚胎及新生小鼠：
   1. 配制消化缓冲液：将 0.4 mg/mL 胶原酶 P 和 0.1 ng/mL DNase I 溶解于 HBSS 中。对于胚胎及出生后第 7 天（p7）或更小的幼鼠，每只小鼠在 15 mL 圆锥形离心管中新鲜配制 1.5–2 mL 缓冲液；对于 p7 及以上的幼鼠，每只小鼠配制 3–4 mL 缓冲液。使用前置于冰上保存。
   2. 根据机构指南实施小鼠安乐死。对于胚胎，从母体子宫中取出所有胚胎，并置于含有 PBS 的 10 mm 培养皿中。每次解剖一个胚胎。
   3. 将小鼠仰卧放置，头部朝向远离操作者的方向。使用精细镊子提起腹部皮肤，并沿中线剪开至横膈膜处，暴露腹腔¹⁸。
   4. 使用精细镊子将肝脏从背部腹壁分离。连续向小鼠尾部方向移动，取出内脏器官（包括肝脏、胃、脾脏、肠道、肾脏和胰腺），并将其置于含有 HBSS 的培养皿中。
   5. 在体视显微镜下，移除肝脏和肾脏以暴露胰腺（图 1）。使用精细镊子将胰腺从胃、十二指肠，最后从脾脏上分离。
   6. 将胰腺组织放入含有消化缓冲液（步骤 1.2.1 中配制）的离心管中。对于 p14 及以上幼鼠，为提高消化效率，将组织切成 2 块。在所有小鼠完成解剖并收集胰腺组织前，将离心管保持在冰上。
   7. 对剩余小鼠重复步骤 1.2.2–1.2.6。

2. 胰腺消化

1. 将含有胰腺组织（置于消化缓冲液中）的离心管放入37 °C的加热金属块中孵育30分钟，同时以700 rpm振荡。孵育15分钟后，手动倒置离心管3–4次，然后放回加热金属块中。
   注意：若使用的加热金属块不具备振荡功能，请每隔5–10分钟手动倒置离心管一次。确保组织充分消化；若消化不完全，可在孵育前将组织切成更小的片段，或提高振荡速度。
2. 为终止组织消化，将离心管置于冰上，并向每管中加入10 mL预冷的HBSS。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，随后吸除上清液。
3. 重悬：
   1. 对于成年小鼠以及出生后第14天（p14）或更年长的幼鼠，用6 mL PBS重悬沉淀物，并通过置于新的15 mL锥形聚丙烯收集管上方的70 µm细胞滤网过滤。为确保最大程度回收细胞，用额外6 mL PBS冲洗原离心管，并将冲洗液同样通过细胞滤网滤入收集管中。
   2. 对于胚胎及出生后小于p14的幼鼠，用2 mL PBS重悬沉淀物，并通过置于5 mL圆底聚苯乙烯收集管（FACS管）上方的35 µm细胞滤网过滤。为确保最大程度回收细胞，用额外2 mL PBS冲洗原离心管，并将冲洗液同样通过细胞滤网滤入收集管中。
4. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。吸取液体时需小心操作，因细胞与聚苯乙烯管壁的结合较为疏松。

3. 准备标记的单细胞

1. 缓冲液配制：采用FACS进行细胞分离时，通过混合不含氯化钙和氯化镁的PBS、5%胎牛血清（FBS）以及5 mM EDTA来配制分选缓冲液。用于流式细胞术分析时，将分选缓冲液中添加0.05%叠氮化钠以配制分析缓冲液。两种缓冲液均可在4–8 °C保存最多2个月。
2. 将细胞重悬于分选或分析缓冲液中。将每只胚胎及出生后7天（p7）以内的幼鼠胰腺组织用1 mL缓冲液重悬，出生后8天（p8）至1月龄幼鼠胰腺组织用1.5 mL缓冲液重悬，1月龄以上小鼠胰腺组织用3 mL缓冲液重悬。将细胞悬液通过置于圆底聚苯乙烯管（FACS管）上方的35 µm细胞筛网过滤。
3. 作为染色对照，从上一步制备的样品中取出50–100 µL等分试样（不超过总样品体积的5%），分装至新的FACS管中；每种使用的荧光染料均需设置一管，包括DAPI和荧光蛋白，同时设置未染色对照管。
   注意：当使用表达荧光蛋白的转基因小鼠细胞或细胞数量有限时，应包括非转基因组织作为染色对照。若使用表达荧光蛋白的细胞且无需进一步染色，则直接进入步骤 3.8。
4. 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞，并吸除上清液。
5. 封闭时，用封闭液（100 µL 分选或分析缓冲液中加入 1 µL 小鼠IgG）重悬细胞，冰上孵育 30 分钟。
6. 为了染色细胞表面标志物，配制含有所有目标荧光素偶联抗体的混合液，每样本体积为 100 µL。用分选或分析缓冲液配制抗体的 2 倍稀释液（即， 将抗体稀释至所需浓度的两倍；若需要的最终稀释比例为1:200，则将抗体按1:100稀释。无需洗涤封闭液，直接向样本细胞中加入100 µL抗体混合液，使最终染色体积达到200 µL。冰上避光孵育30–60分钟。
7. 为设置分析或分选参数（见步骤 4.3 和 5.2），需额外准备仅含一种所用抗体的试管（单染对照）。在分选或分析缓冲液中（如步骤 3.6 所述）配制 2 倍浓度的抗体稀释液。确保为每种使用的荧光染料均设置相应的单染对照稀释液，并设置未染色对照。无需洗涤封闭液，直接向细胞（步骤 3.3 所制备）中加入 100 µL 抗体混合液，使最终染色体积为 200 µL。冰上避光孵育 30–60 分钟。
8. 用分析缓冲液或分选缓冲液将每管补至最大体积4 mL进行洗涤。可选步骤：将细胞再次通过35 µm细胞滤网过滤（如步骤3.2所述）。
9. 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，小心移除上清液。
10. 将样本重悬于分析或分选缓冲液中。从胚胎中分离的细胞重悬于500 µL缓冲液中，从不足一个月的幼鼠中分离的细胞重悬于1 mL缓冲液中，从1–3个月龄小鼠中分离的细胞重悬于2 mL缓冲液中，从超过3个月龄的小鼠中分离的细胞重悬于3 mL缓冲液中。染色对照可重悬于300 µL缓冲液中。
11. 向重悬的细胞中加入200 ng/mL的DAPI以标记死细胞。需设置一个不含DAPI的未染色细胞管，用于流式细胞仪参数调节。随后进行细胞分选（步骤4）或分析（步骤5）。

4. 细胞分选

1. 准备工作：
   1. 在RNA提取前进行细胞分选时，分选前应立即用RNase抑制剂包被1.5 mL收集管。具体操作如下：将含有0.01 U/mL RNase抑制剂的1 mL分选缓冲液加入无菌的1.5 mL收集管中。孵育5分钟后，振荡混匀，弃去液体。
   2. 细胞培养前进行细胞分选时，向无菌的15 mL收集管中加入3 mL无菌培养基（含20% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM））。
2. 在将样品管上机至流式细胞分选仪前，需短暂涡旋振荡以重悬细胞。其余样品管应保持在冰上。
3. 首先分析染色对照，以确定分选参数（例如， 电压和补偿）以及分选门（例如， 总细胞群体、活的DAPI阴性细胞以及待分选的细胞群体。
4. 设置好分选参数和门控后，加载样本并启动细胞分选，将细胞分选至收集管中。
   注意：分选条件高度依赖于仪器。我们使用100 µm的喷嘴直径、23.1 psi的压力和最大分选速度5。
5. 继续进行RNA提取或分选细胞的培养。
   注意：进行RNA提取时，以2,000 × g离心5分钟，去除上清液后，再按照标准提取流程操作。若需培养细胞，当细胞在非无菌条件下分选时，应使用培养基将细胞悬液冲洗两次，每次加满离心管后以300 × g离心7分钟，以尽量减少污染，然后再进行培养。

5. 流式细胞术进行细胞分析

1. 在将每支试管上机前，短暂涡旋振荡以重悬细胞。其余试管保持在冰上。
2. 首先分析未染色和单染色样本，以确定分析参数（例如， 电压和补偿
3. 设置好分析参数后，依次加载每个样本（包括染色对照），并记录结果。使用流式细胞术分析软件对获得的结果进行分析。

结果

胰腺间充质在发育期及成年期均是必需的。本文所述方法可用于从胚胎期、新生期及成年期胰腺中分离间充质细胞。在 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 小鼠的胰腺中，仅间充质细胞（而非其他细胞类型）表达黄色荧光蛋白（YFP）^5,11,17,19。在发育过程中，Nkx3.2（亦称为 BapX1）在胚胎期胰腺、胃和肠的间充质中表达，也在部分骨骼体节中表达^19,20,21。该基因在胰腺间充质中自 e9.5 至 e11.5 期间表达，从而自 e9.5 起可在 Nkx3.2-Cre 的调控下实现基因表达^5,19,20。基于此标记，可通过流式细胞术从大量胰腺组织中纯化细胞。图2展示了按照本文所述方法分离得到的胚胎期、新生期及成年期胰腺组织单细胞的流式细胞术分析结果。非转基因胰腺组织中不含荧光细胞，而所有检测年龄段的 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 胰腺组织均含有明确的 YFP 标记细胞群体（图2；以门控标记）。

根据此处描述的方法，表达荧光蛋白的细胞可通过流式细胞术进行分选或分析，也可在额外进行免疫染色后实施。例如，基于荧光标记分选后，可对间充质细胞进行培养以建立细胞系（至少传代五次），如图3A所示。注意培养细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，符合间充质细胞的特征。此外，该系统还可用于分析分选后细胞的基因表达。为此，从分选得到的间充质细胞中提取RNA并合成cDNA，通过qPCR分析基因表达水平。此类分析显示，分选后的细胞表达泛间充质标志物波形蛋白（vimentin）（图3B）。最后，可通过流式细胞术分析胰腺细胞的表面标志物表达情况。例如，我们采用此处所述方法分离了成年Nkx3.2-Cre;R26R-YFP小鼠胰腺组织中的细胞，并使用细胞表面糖蛋白CD9进行染色，该分子已被报道在成纤维细胞中表达²²。如图3C所示，Nkx3.2-Cre;R26R-YFP小鼠胰腺中所有荧光标记的细胞均表达CD9。

图1：胚胎期和新生期的胰腺组织。 分离的完整胃肠道组织，包括 e15.5 胚胎 (A) 和 p4 幼鼠 (B) 的胃、脾、肠和胰腺。胰腺组织以蓝色线条标出。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 胰腺组织中的间充质细胞被荧光标记。 对来自非转基因小鼠（左图）和 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 转基因小鼠（右图）在不同年龄阶段分离的胰腺细胞进行流式细胞术分析：胚胎期 (A)、新生期 (B) 和成年期 (C)。细胞按侧向散射（y轴）和黄色荧光（x轴）进行分析。门控区域（以“D”标记）显示在转基因小鼠中存在 YFP⁺ 细胞群，而在非转基因对照小鼠中则无此细胞群。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：分离的胰腺细胞的分析。（A） 从小鼠胰腺组织中分选得到的 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 新生小鼠细胞（如图 2B所述）被培养以建立细胞系。培养后的细胞进行了荧光成像（绿色；左、右图）和相差成像（灰色；右图）。（B） 柱状图显示了从 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 成年小鼠胰腺组织中分选得到的 YFP⁺ 细胞（如图 1C所述；绿色）与未分选胰腺组织（黑色）相比的 Vimentin1（Vim1）表达水平。提取 RNA 并通过 qPCR 分析基因表达；表达量以 Cyclophilin 为内参进行标准化。N = 4。***P < 0.001。数据表示为均值 ± 标准差。（C） 对来自 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 成年小鼠的胰腺细胞进行流式细胞术分析，细胞经分散后使用藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的抗 CD9 抗体免疫染色，并检测 APC 信号（y 轴）和黄色荧光信号（x 轴）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种分离和分析胰腺微环境中细胞的方法。该方法可用于从胚胎期和成年期的胰腺组织中分离间充质细胞。此外，我们已成功利用该方案从成年及新生胰腺中分离内皮细胞^5,17。然而，该方法可能不适用于获得可重复的胰腺上皮细胞单细胞悬液（其他替代方案见参考文献18、23和24）。利用本方法，可通过荧光标记（包括表达荧光蛋白或经表面标志物免疫染色）的细胞，使用流式细胞分选（FACS）进行纯化，或通过流式细胞术进行分析。可从纯化后的细胞中提取RNA，以分析其基因表达谱。此外，纯化后的细胞也可进行培养，建立细胞系，用于后续的蛋白质组学分析。该方法将有助于鉴定胰腺微环境所表达的、调控其器官发生、生理功能及病理生理过程的相关因子。

胰腺间充质通过促进前体细胞和分化细胞的增殖，支持组织器官的发生^5,9。研究表明，这些细胞能够支持由人胚胎干细胞（hESC）衍生的胰腺前体细胞的扩增^17,25,26。因此，明确胚胎间充质因子的身份将有助于当前利用hESC和诱导性多能干细胞（iPSC）生成胰岛素分泌型β细胞的努力，从而为糖尿病提供潜在的治愈方案。小鼠遗传学研究已鉴定出由间充质产生、在胰腺发育早期促进胰腺上皮扩张的生长因子，例如Fgf10^3,9。为了鉴定在胚胎间充质中表达的其他因子，我们采用激光捕获显微切割技术分离这些细胞，提取其RNA并进行基因表达分析²⁶。然而，该方法不仅劳动密集，而且依赖于基于细胞形态特征进行识别，因此仅适用于上皮向周围间充质分支之前的发育阶段（i.e., e12.5）。为了在更晚的发育阶段对间充质细胞进行表征，我们采用了本文所述的方法^5,17。

我们采用该方法分析新生儿胰腺间充质细胞表面标志物的表达⁵此外，从胚胎期和新生期的胰腺组织中分离出了间充质细胞 Nkx3.2-Cre;R26-EYFP 小鼠，根据该小鼠品系中的荧光标记进行筛选，并进行培养以建立细胞系¹⁷这些细胞的蛋白质组学分析有助于鉴定由胰腺间充质分泌、能够促进人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞发育的因子¹⁷我们进一步采用该细胞分离方法，从成年胰腺组织中纯化间充质细胞，用于RNA提取和基因表达分析¹⁷因此，该方法可用于鉴定胰腺间充质中表达的基因和蛋白质，这些基因和蛋白质具有支持胰腺细胞发育的能力。

进一步研究表明，胰腺间充质细胞在胰腺肿瘤发生中发挥一定作用。胰腺导管腺癌（PDAC）的特征是形成富含成纤维细胞的纤维化间质，该间质由成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质（ECM）²⁷组成。尽管间质曾被认为可促进多种癌症的发展，但研究发现其实际上可抑制PDAC的进展^15,16,28。这表明胰腺间质的某些组分可能分泌抑制肿瘤发生的因子。此外，间质细胞组成及其细胞表型的变化可能影响其对上皮细胞的作用^15,16,28。因此，本文所述方法有助于鉴定PDAC间质与健康胰腺组织间在细胞类型组成上的差异。该方法还可用于分离纯化不同的间质细胞类型，以分析其在PDAC进展过程中基因表达谱的潜在变化。然而，由于肿瘤发生过程中胰腺ECM成分发生变化²⁷，可能需要对组织消化参数进行调整，例如增加其他类型的胶原酶或延长孵育时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 P	Roche	11213865001
脱氧核糖核酸酶（DNase）	Sigma-Aldrich	D5025-15KU	有效单位应至少为 2,000 单位/毫升蛋白
Hanks’ 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma-Aldrich	H6648
胎牛血清（FBS）	Biological Industries	04-127-1A
EDTA	Biological Industries	01-862-1A
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
山羊 IgG 血清	Sigma-Aldrich	G9023
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
RNase 抑制剂	Invitrogen	N8080119
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Invitrogen	11965092
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
青霉素-链霉素	Biological Industries	03-031-1B
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537	不含氯化钙和氯化镁
1.5 mL 离心管	Sarstedt	72 690
15 mL 锥形管	Corning	430052
圆底聚苯乙烯 5 mL 管	Corning	352008	FACS 管。请确保所用试管与将使用的流式细胞仪兼容，因为不同品牌对试管的要求略有差异
带 35 μm 细胞筛网 snap cap 的 5 mL 管	Corning	352235	FACS 管
70 μm 细胞筛网	Miltenyi Biotec	130-098-462
带振荡功能的加热块	Eppendorf	ThermoMixer C
离心机	ThermoFisher	Heraeus Megafuge 40R
体视显微镜	Nikon	SMZ 745
细胞分选仪	BD Biosciences	FACSAria IIu
流式细胞仪	Beckman Coulter	Gallios