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快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

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DOI：

10.3791/55364

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2017年4月13日

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1Biomedical Sciences & Iowa Center for Advanced Neurotoxicology, Iowa State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外 实验。这种改进的分离方法可同时获得高产量和高纯度，相较于其他方法具有显著优势，有助于广泛开展小胶质细胞生物学机制的研究。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统损伤的主要应答细胞；然而，它们在调控神经炎症过程中的作用仍有许多未知之处。小胶质细胞属于中胚层来源的细胞，其功能类似于巨噬细胞，可监测炎症应激状态。巨噬细胞的经典活化（M1型）和替代性活化（M2型）表型分类也已被扩展应用于小胶质细胞，以期更深入理解这些表型在帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经炎症性疾病中的相互作用机制。体外实验利用原代小胶质细胞可获得快速且可靠的结果，并可进一步推广至体内环境。尽管这相比体内实验具有明显优势，但在分离小胶质细胞时获得足够产量和高纯度的细胞仍是一项挑战。目前常用的方法往往存在回收率低、纯度低或两者兼有的问题。本文中，我们展示了一种对无柱式CD11b磁性分离方法的优化，可在一半时间内实现更高的细胞回收率和更优的纯度。我们建议将此优化后的方法作为研究神经炎症与神经退行性病变时原代小胶质细胞分离的一种高效且实用的模型。

引言

小胶质细胞是起源于中胚层、不依赖Myb的常驻巨噬细胞，由卵黄囊血岛中的c-kit+/CD45-红系-髓系前体细胞分化而来1,2。胚胎期小胶质细胞定植于中枢神经系统（CNS）后，会从阿米巴样形态转变为分支状形态3。这些成年小胶质细胞被归类为“监视型”，因其动态的突起持续探测健康脑实质中可能存在的损伤刺激4。尽管小胶质细胞仅占中枢神经系统细胞总数的约10%，但它们彼此之间能够铺展覆盖整个脑实质，从而实现对组织的最大化扫描4,5。危险相关分子模式（DAMPs），如α-突触核蛋白6,7和β-淀粉样蛋白8，或病原体相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）9，可经典激活小胶质细胞，促使其恢复为阿米巴样活化状态，并产生一氧化氮、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-12以及趋化因子C-C模体配体2，从而引发炎症反应9,10,11。在帕金森病等神经炎症条件下，致病性α-突触核蛋白积聚，导致多巴胺能神经元死亡，释放出更多聚集态α-突触核蛋白，进一步促进小胶质细胞的经典活化，形成神经退行性循环7。类似于外周巨噬细胞，小胶质细胞在抗炎细胞因子IL-4和IL-10存在的情况下也可能发生替代性活化，从而具备促进神经修复和减轻炎症的潜力2,11。除了在中枢神经系统中的免疫学功能外，小胶质细胞还被描述为神经环路的重要调控者，在发育过程中通过修剪突触发挥关键作用。例如，Cx3cr1-基因敲除小鼠的小胶质细胞密度较低，突触修剪减少，导致树突棘过多、突触未成熟以及中枢神经系统发育不全的电生理特征12。深入理解小胶质细胞在中枢神经系统稳态中的这些生理复杂性及其多种功能，对于寻找治疗神经退行性疾病的有效疗法至关重要。

在神经免疫学领域，体外（in vitro）实验备受青睐，因其更便于进行机制研究，维护成本较低，且耗时和人力投入较少。此外，分离特定细胞群体的能力对于明确目标细胞在特定条件下的功能至关重要。目前存在多种小胶质细胞分离方法，但这些方法在获得较高细胞数量和纯度以支持广泛实验方面仍存在局限性13,14,15。例如，分化簇11b（CD11b）是单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞常见的表面标志物16。利用CD11b，已有研究首次描述了一种基于磁珠柱的分离方法，可从每只新生小鼠脑组织中获得约99.5%纯度和约1.6 × 106个小胶质细胞17。本实验室近期开发了一种无需磁珠柱的CD11b磁分离方法15，该方法在聚苯乙烯试管中进行，首先使用与藻红蛋白（PE）偶联的单克隆抗体标记CD11b；随后加入一种针对PE和葡聚糖的双特异性二抗，该抗体与PE结合后形成复合物；接着引入包被磁性颗粒的葡聚糖，其与抗体复合物中的葡聚糖端结合；最后将聚苯乙烯试管置于磁铁中以实现小胶质细胞的分离。该方法使每只新生小鼠脑组织中小胶质细胞的产量提高至约3.2 × 106，但纯度略有下降，约为97%。

本文展示了一种快速且优化的无需层析柱的CD11b磁分离方案（图1）。该改进方法与我们先前建立的无柱磁分离法同样可行，且CD11b磁分离试剂盒价格相同。整个操作时间缩短了一半，这对于最大限度地提高细胞存活率和得率至关重要。值得注意的是，该优化方法获得的细胞纯度达到~>99%，显著优于本实验室此前开发的原始无柱方法15。最重要的是，该方法不再使用CD11b-PE标记抗体，从而无需避光孵育，并释放了红色荧光通道，可用于荧光显微镜检测。最后，与原始CD11b方法一样，该改进方案同样可获得高得率和高纯度的星形胶质细胞组分。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，其稳态功能被认为在病理生理过程中不可或缺18。这类胶质细胞参与多种生理功能，包括血脑屏障的形成、营养支持、神经递质稳态的维持、损伤后胶质瘢痕的形成、神经保护、学习与记忆以及神经炎症等，充分体现了其在胶质细胞生物学研究中的重要价值19。小胶质细胞和星形胶质细胞的形态与功能已通过共聚焦显微镜、蛋白质印迹（Western blotting）、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）、Griess亚硝酸盐检测以及Luminex多重细胞因子检测等方法得以确认。本方案的优化提升了对小胶质细胞或星形胶质细胞纯度的信心，拓展了荧光显微镜在红光通道可用性方面的应用，并节省了实验时间，这些优势对于体外（in vitro）实验研究均具有重要意义。

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方案

动物使用及实验方案程序均经爱荷华州立大学（美国爱荷华州艾姆斯）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准并监督

1. 混合胶质细胞培养物的培养

  1. 快速使用5.5英寸手术剪将出生1-2天的幼鼠断头，并立即将头部置于盛有冰的50 mL离心管中。注意，断头即为安乐死方式。
  2. 在超净工作台中，使用4.5英寸直头显微解剖剪在颅骨和脑膜上做一个小切口。从尾端向头端（鼻部）方向进行剪切。利用断头后形成的开口深入至皮肤下方。
    1. 切开后，将一侧半球向外剥离，然后使用一对弯头或钩状镊子取出整个脑组织。
  3. 将脑组织浸入装有0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）的新50 mL离心管中，在37 °C水浴中孵育15分钟。每份脑组织使用2 mL胰蛋白酶-EDTA。
  4. 用新鲜的生长培养基（10% FBS，DMEM/F12，1% 青霉素/链霉素，1% L-谷氨酰胺，1% 丙酮酸钠，和 1% 非必需氨基酸）冲洗脑组织，通过加入并移除培养基完成洗涤。重复此步骤 4 次。
  5. 每个大脑接种两瓶含有生长培养基的T-75培养瓶。因此，向离心管中每脑加入2 mL生长培养基。这样，每瓶T-75培养瓶中相当于含有1 mL匀浆脑组织和8–9 mL生长培养基。
  6. 使用不同孔径的移液器，按照从大到小的顺序对脑组织进行吹打匀浆。当观察到脑组织不再变小时，换用下一个更小孔径的移液器。吹打结束后，悬液应呈澄清状态，无可见组织块。
    1. 依次使用25 mL移液管、5 mL移液管和10 mL移液管。
  7. 将每份均质化脑组织悬液通过70 µm细胞筛，制备成单细胞悬液。
  8. 每个匀浆脑组织样本，按步骤1.5所述，接种两瓶含培养基的T-75培养瓶（每瓶T-75培养瓶中加入1 mL脑匀浆液和8–9 mL培养基）。
  9. 6天后更换培养基，继续培养至第16天进行分离th 天

2. 小胶质细胞的分离

  1. 16天后，从培养瓶中移除生长培养基，并转移至一个新的50 mL离心管中。向每个T-75培养瓶中加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养瓶置于旋转摇床上，在室温下振荡5分钟。
    1. 将移除的培养基在 0.4 × g 条件下离心 5 分钟，用于在后续步骤中终止胰蛋白酶-EDTA 反应。
  2. 振荡5分钟后，加入至少4 mL培养基（新鲜培养基或来自步骤2.1.1的用过的培养基）以终止胰蛋白酶-EDTA反应。
  3. 轻柔吹打，确保所有细胞均已脱落。
  4. 经吹打混悬后，将细胞通过70 μm细胞滤网以制备单细胞悬液，进行细胞计数，随后在0.4 × g离心5分钟。
  5. 每100乘以106 细胞（约15个T-75培养瓶），使用1 mL推荐培养基（2% FBS，DPBS（含钙） 无氯化镁）和 1 mM EDTA）重悬细胞沉淀。
    注意：以下所有步骤均针对1 mL分离体系设计。
  6. 取一个5 mL聚苯乙烯管，加入1 mL推荐培养基，并标记弯月面。再加入推荐培养基至2.5 mL，并同样标记。弃去推荐培养基，将重悬的细胞转移至该5 mL聚苯乙烯管中。
  7. 每1 mL悬浮细胞中加入50 µL大鼠血清，室温孵育5 min。
  8. 通过混合25 µL组分A和25 µL组分B制备筛选鸡尾酒溶液。这些组分属于专有成分。
  9. 加入50 µL筛选混合液至细胞中，在室温下孵育5分钟。
    注意：为获得更纯的培养物，建议重复步骤 2.9（推荐但非必需）。
  10. 涡旋微球45秒。每1 mL样品加入80 µL微球。室温孵育3分钟。
  11. 在聚苯乙烯管中加入推荐培养基，定容至2.5 mL。
  12. 将试管置于磁力架上，室温孵育3分钟。可根据需要调整孵育时间以提高纯度。保持聚苯乙烯管处于磁力架上，缓慢将推荐培养基倒入一个15 mL离心管中。
  13. 重复步骤 2.12 三次。可根据需要增加磁性孵育次数以提高纯度。
  14. 加入3 mL培养基，使用细胞计数器对细胞数量进行计数。
  15. 在经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养板中接种细胞，并进行相应处理。在PDL包被的培养板中接种细胞后48小时开始处理，以使细胞有足够时间从分离应激中恢复。
    注意：使用前述免疫细胞化学方法检测细胞培养物的纯度15.
  16. 将主要含有星形胶质细胞的阴性组分（收集于15 mL离心管中）接种至T-75培养瓶中，加入生长培养基进行培养。
  17. 在37 °C培养箱中孵育至少6小时后，更换培养基并过夜培养。次日将星形胶质细胞按实验要求进行传代处理。

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结果

使用CD11b阳性选择试剂盒II分离的小胶质细胞具有高纯度

采用上述方案分离原代小鼠小胶质细胞，并将其接种于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上以检测分离纯度。每孔接种一万个细胞，通过免疫细胞化学分析，使用离子化钙结合接头分子1（Iba1）作为小胶质细胞标志物，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞标志物，评估所分离小胶质细胞的纯度。分离得到的细胞培养物仅表达Iba1，而不表达GFAP（图2A），表明所获得的培养物为高纯度的小胶质细胞。与其他已发表的原代小胶质细胞分离方法相比（其纯度约为97%），本方法在一半的时间内实现了约>99%的纯度。为进一步验证该培养物的纯度，我们进行了Iba1和GFAP的蛋白质印迹实验20。免疫印迹分析进一步证实，从混合胶质细胞培养物中分离得到的细胞几乎为纯的小胶质细胞培养物（图2B

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讨论

传统的的小胶质细胞分离方法回收率较低，不适合进行蛋白质印迹法（Western blot）的蛋白分析和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的RNA分析。差速贴壁法和温和胰蛋白酶消化法是两种常见的方法，但小胶质细胞得率均较低13,14,15。基于柱层析的CD11b分离方法回收率同样较低，但纯度高于差速贴壁法和温和胰蛋白酶消化法13,14,15,16,17。我们先前建立的无柱CD11b方法显著提高了分离得率，使其适用于蛋白质和RNA分析，如Western blotting和qRT-PCR，但纯度有所下降

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目（NS088206 和 ES026892）的支持。同时感谢 AGK 获得的 W. Eugene 和 Linda Lloyd 捐赠讲席以及 AK 获得的院长教授职位。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EasySep CD11b 分离试剂盒 IIStemCell Technologies18970
EasySep 磁力架StemCell Technologies18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)Life Technologies11330057
丙酮酸钠Life Technologies11360070
MEM 非必需氨基酸 (100x)Life Technologies11140050
L-谷氨酰胺 (100x)Life Technologies25030081
EDTAFisher ScientificAM9260G
胎牛血清 (FBS)Sigma13H469
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies 公司旗下 Gibco25200
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)Life Technologies 公司旗下 Gibco14190250

参考文献

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84(2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

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