Method Article

序贯盐萃取法分析染色质修饰配合物的体染色质结合特性

DOI:

10.3791/55369

⸱

October 2nd, 2017

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

顺序盐提取染色质结合蛋白是一个有用的工具, 以确定结合性质的大蛋白复合物。该方法可用于评价单个亚基或域在蛋白质复合体与大块染色质的整体亲和性中的作用。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于染色质的复杂性质和大多数哺乳动物染色质修饰络合物的异质性, 对染色质靶向蛋白的结合性质的阐明具有很大的挑战性。为了克服这些障碍, 我们采用了一种顺序盐萃取 (SSE) 测定方法来评估染色质结合物的相对结合的亲和力。这种简单而直接的测定方法可用于非, 以评估两个相关复合物的结合亲和性的相对差异, 当亚基丢失或单个域被灭活时, 复杂度的亲和性变化, 以及染色质景观改变后的结合亲和力。通过在不断增加的盐量中依次 re-suspending 大块染色质, 我们能够从染色质中分析特定蛋白质的洗脱。使用这些轮廓, 我们能够确定染色质修饰复合物或染色质环境的改变如何影响结合作用。连接 SSE 与其他在体外和在体内化验, 我们可以确定的作用, 单个领域和蛋白质的功能, 在一个复杂的各种染色质环境。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核细胞中的 DNA 调控是一个复杂而复杂的系统, 它受到一系列蛋白质的严密控制, 它们能够协调对细胞内和细胞外刺激的反应。dna 被包裹在组蛋白 octamers 形成核, 它可以松散地沿 dna 分布或压缩成紧密的线圈1。这种结构安排的 DNA 和组蛋白被称为染色质, 这是由一个网络的蛋白质, 读取, 写入, 并抹去后的翻译修改 (PTM) 组组的2。一些组蛋白 PTMs, 如乙酰化, 改变了它们所沉积的氨基酸的电荷, 改变了蛋白质组与 DNA2之间的相互作用。组蛋白 PTMs 也用于招募转录调节剂, 染色质 remodelers, dna 损伤修复机械, 和 dna 复制机械, 以特定的区域的染色体3。

大多数研究染色质相互作用的方法要么探测小规模的相互作用, 要么涉及大规模的全基因组分析。体外结合研究通常利用单个重组域与组蛋白多肽或 DNA 进行分析, 如电泳迁移率测定 (EMSA)、等温滴定量热法、荧光极化和肽 pulldowns。因为这些分析通常专注于单个蛋白质领域, 它们有助于理解一小部分的拼图, 但不允许我们理解多域蛋白质的合作性质, 更不用说它们在 multi-protein 中的作用了。配合.另一层复杂的是由大多数哺乳动物染色质修饰复合物的异质成分添....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 准备工作

  1. 准备100毫升低渗溶液缓冲器 A: 0.3 米蔗糖, 60 毫米氯化钾, 60 毫米三 pH 8.0, 2 毫米 EDTA, 0.5% NP-40。存储在4和 #186; C.
    注意: 某些细胞系, 如 HEK293T, 需要较不严格的溶条件。如果原子核溶解容易, 使用修改的缓冲 A:25 毫米 HEPES pH 7.6, 25 毫米氯化钾, 5 毫米氯化镁 2 , 0.05 毫米 EDTA, 0.1% NP-40, 和10% 甘油.
  2. 准备一个250毫升的 2x mRIPA 溶液的库存解决方案: 100 mM pH 8.0, 2% NP-40, 和0.5% 钠胆酸.
  3. 准备100毫升的5米氯化钠的库存解决方案.
  4. 使用 2x mRIPA 和5米 nacl 溶液, 为六盐浓度的每一个都准备50毫升的 1x mRIPA 溶液: 0 毫米, 100 毫米, 200 毫米, 300 毫米, 400 毫米, 和500毫米氯化钠。在开始实验之前, 冷却所有的冰上的解决方案.
  5. 在所需条件下增大单元格线.
    注: 在确定击倒蛋白质的效果时, 必须将 SSE 与野生细胞进行比较。这些 SSE 必须并排执行。举例来说, 使用化学抑制剂或刺激, 请参阅 3-5 节.

2。基本顺序盐萃取

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文从文献6中, 论证了常用的顺序盐萃取 (SSE) 方法的优点和应用。在图 1中, 我们通过检测 ARID1a 和 PBRM1 的洗脱模式, 比较了 SSE 在提取蛋白质并发中的重现性。我们一贯观察, ARID1a, 一个曝气生物滤子亚基, elutes 主要在200毫米氯化钠和 PBRM1, 一个独家 PBAF 亚基, elutes 主要在300毫米氯化钠。图 1a显示了三独立的 SSE 与 800万 OVCA429 单元的复制。图 1b描绘了一个非盐提取物, 从200万细胞中分离出来的细胞核悬浮在一个盐缓冲液中。虽然这两种方法的结论, ARID1a elutes 在200毫米和 PBRM1 elutes 在300毫米, SSE 产生一个明确的绑定配置文件, 并允许明确区分这两个复合体的约束力。此外, 在非方法中, 400 mm 和 500 m.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质和染色质相互作用通过盐萃取的表征是一种常用的方法, 已经使用了几十年14,15;然而, 它没有得到系统的优化, 以揭示它的充分效用。我们演示了这种顺序方法提供了一种快速和廉价的方法来区分染色质结合的变化时, 蛋白质或环境的改变。SSE 具有高度的适应性和优化, 重要的是, 它在技术上是简单的, 不需要专门的设备。在开始之前需要优化的关键方面是: 起始单元数、低渗缓冲条件和潜伏期。

细胞数的最重要的方面是它是一致的所有样品。当观察生物滤池复合物时, 使用800万细胞能很好地描述这些复合物是如何结合的;然而, 细胞的数量 (或缓冲的数量) 可能需要调整根据兴趣蛋白质的丰盈。重要的是要注意, 使用较少的细胞是有挑战性的, 因为在400毫米和500毫米氯化钠很难想象的染色质颗粒。这是至关重要的, 以确保颗粒没有转移与上清后, 400 毫米氯化钠。

为了准确地评估核蛋白, 细胞核需要保持完好, 直到它们与0毫米氯化.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有相互竞争的金融利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了 v 学者奖 (V2014-004) 和 v 学者加奖 (D2016-030) 从 v 的癌症研究基金会和美国癌症协会机构研究补助金 (ACS 表意文字补助金 58-006-53) 的支持, 以普渡大学癌症中心研究.e.g.p. 获得了普渡大学药物化学和分子药理学系创研究生捐赠奖的支持。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
氯化钠，晶体 2.5 kg AR （ACS）Avantor/Macron7581-06
蔗糖，晶体 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron8360-04
氯化钾，颗粒状 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron6858-04
Trizma（R） 碱，一级标准品和缓冲液，>=99.9%（滴定），结晶Sigma-AldrichT1503-1kg
EDTA（乙烯二硝基）四乙酸，二钠盐，二水合物 125 G AR （ACS）Avantor/Macron4931-02
NONIDET P-40 底物，100mL UN3082AmrescoE109-100ML
HEPES 缓冲液溶液 （1M）Gibco15630-080
氯化镁，6-水合物，晶体 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron5958-04
甘油，1LAmresco0854-1L
脱氧胆酸钠盐，100gAmresco0613-100G
Eppendorf Research 加移液器Fisher Scientific13-690-032
Eppendorf 5424 R 冷冻微量离心机Eppendorf5424 R
小鼠二级 IgG HRP-linked细胞信号转导7076
二抗兔 IgG HRP 连接的细胞信号转导7074
BMI-1 抗体Millipore
PBRM1 抗体BethylA301-591A
ARID1a 抗体Santa Cruzsc-32761
BRD4 抗体BethylA301-9852a
（+） JQ1开曼化学公司11187
SAHA开曼化学公司10009929
阿霉素AK Scientific25316-40-9
二甲基亚砜 （DMSO）Macron4948-02
小型反式印迹细胞BioRad1703930
小型凝胶槽ThermoFisherA25977
牛白蛋白 （BSA）Amresco0332-100gPBS-T 中的 5% 溶液，作为蛋白质印迹的封闭溶液
Bolt MOPS SDS 电泳缓冲液 （20x）Life TechnologiesB0001
Bolt LDS 样品缓冲液 （4x）Life TechnologiesB0007
PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准，10 至 250 kDaThermoFisher26619
甲基酒精，无水Macron3041-10
胰蛋白酶 kEDTA，1XCellgro25-053-CI
叠氮化钠，250g UN1687Amresco0639-250G
十二烷基硫酸钠 （SDS）500g UN1325Amresco0227-500G
甘氨酸，用于电泳，>=99%Sigma-AldrichG8898-1kg
BigTop微量离心管，聚丙烯VWR20170-333
1000 和微量;L 移液器吸头VWR83007-382
NuPAGE Bis-Tris 预制胶 4-12%InvitrogenNW04125BOX
亮肽素半硫酸盐，5 MGRPI 研究产品22035-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液。
APROTININ，10 MGRPI 研究产品20550-0.01用于蛋白酶抑制剂溶液。
胃蛋白酶抑制剂 A，5 MGRPI 研究产品30100-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液。
OVCA429细胞由 Karen Cowden Dahl. 博士提供
HEK293TATCCCRL-3216
HeLa细胞ATCCCCL-2
麦考伊5A培养基康宁Mediatech10-050-CV
DMEM康宁Mediatech10-013-CV
最低必需培养基（MEM），粉末康宁Mediatech50-011-PC
MEM NEAA （100X）非必需氨基酸Gibco11140-050
FB-11：胎牛血清，美国来源Omega ScientificFB-11
青霉素-链霉素溶液Life Technologies15140-122
GlutamaxLife Technologies35050-061
丙酮酸钠Life Technologies11360070
VWR Power来源VWR13-690-032
用作

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
  2. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
  3. Musselm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sequential Salt ExtractionChromatin BindingProtein ElutionSalt ConcentrationWestern BlotSDS PAGE GelHypotonic BufferModified RIPAProtein Loading DyeImage Analysis

Related Articles