Method Article

序贯盐萃取法分析染色质修饰配合物的体染色质结合特性

DOI:

10.3791/55369

⸱

October 2nd, 2017

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

顺序盐提取染色质结合蛋白是一个有用的工具, 以确定结合性质的大蛋白复合物。该方法可用于评价单个亚基或域在蛋白质复合体与大块染色质的整体亲和性中的作用。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于染色质的复杂性质和大多数哺乳动物染色质修饰络合物的异质性, 对染色质靶向蛋白的结合性质的阐明具有很大的挑战性。为了克服这些障碍, 我们采用了一种顺序盐萃取 (SSE) 测定方法来评估染色质结合物的相对结合的亲和力。这种简单而直接的测定方法可用于非, 以评估两个相关复合物的结合亲和性的相对差异, 当亚基丢失或单个域被灭活时, 复杂度的亲和性变化, 以及染色质景观改变后的结合亲和力。通过在不断增加的盐量中依次 re-suspending 大块染色质, 我们能够从染色质中分析特定蛋白质的洗脱。使用这些轮廓, 我们能够确定染色质修饰复合物或染色质环境的改变如何影响结合作用。连接 SSE 与其他在体外和在体内化验, 我们可以确定的作用, 单个领域和蛋白质的功能, 在一个复杂的各种染色质环境。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核细胞中的 DNA 调控是一个复杂而复杂的系统, 它受到一系列蛋白质的严密控制, 它们能够协调对细胞内和细胞外刺激的反应。dna 被包裹在组蛋白 octamers 形成核, 它可以松散地沿 dna 分布或压缩成紧密的线圈1。这种结构安排的 DNA 和组蛋白被称为染色质, 这是由一个网络的蛋白质, 读取, 写入, 并抹去后的翻译修改 (PTM) 组组的2。一些组蛋白 PTMs, 如乙酰化, 改变了它们所沉积的氨基酸的电荷, 改变了蛋白质组与 DNA2之间的相互作用。组蛋白 PTMs 也用于招募转录调节剂, 染色质 remodelers, dna 损伤修复机械, 和 dna 复制机械, 以特定的区域的染色体3。

大多数研究染色质相互作用的方法要么探测小规模的相互作用, 要么涉及大规模的全基因组分析。体外结合研究通常利用单个重组域与组蛋白多肽或 DNA 进行分析, 如电泳迁移率测定 (EMSA)、等温滴定量热法、荧光极化和肽 pulldowns。因为这些分析通常专注于单个蛋白质领域, 它们有助于理解一小部分的拼图, 但不允许我们理解多域蛋白质的合作性质, 更不用说它们在 multi-protein 中的作用了。配合.另一层复杂的是由大多数哺乳动物染色质修饰复合物的异质成分添加。这种蛋白质的异质性, 结合染色质景观的动态性质, 使它具有挑战性, 以重述在体内染色质蛋白的结合相互作用的染色质体外。

在体内方法已取得重大进展;然而, 他们往往是昂贵的, 费时, 技术上的挑战。染色质沉淀, 其次是测序 (芯片序列) 是非常有用的, 以确定蛋白质和组蛋白修饰在整个基因的本地化, 但它需要大量的优化4。蛋白质通常与染色质交联以保持相互作用;然而, 这可以产生人工交互作用, 并可能导致表位掩蔽5。此外, immunoprecipitations (ip) 要求高度特异的抗体, 并广泛优化 DNA 剪切和 IP 条件的芯片 qPCR 使用已知的绑定站点, 这通常是不可用的先验。在优化了芯片条件后, 样品的处理成本很高, 需要数周到数月才能进行序列分析。虽然这种方法对于鉴别基因组中染色质结合蛋白的定位是非常宝贵的, 但成本和时间的承诺使得它无法使用这种方法来产生关于小的变化可能影响全局绑定属性的假设。.

在本文中, 我们描述了如何使用顺序盐萃取 (SSE) 检测可以用来检查染色质结合蛋白的全球结合剖面, 并区分如何改变蛋白质, 复杂, 或全球 PTM 剖面可以改变相互作用。虽然盐提取物是一个普遍和广泛使用的技术, 我们展示了如何这种顺序方法是高度重现性和多才多艺。SSE 允许我们描述一个复杂的单个子单位, 甚至一个单一的域是如何促成复合体对大块染色质的整体亲和性的。SSE 也可以用来确定蛋白质的结合是否受染色质景观的变化的影响, 为组蛋白标记靶向提供了有趣的假说, 可以使用芯片序列和其他基因研究进行确认。

我们最初改编自吴 et al., 检查 Polybromo1 (PBRM1) 在 PBAF 染色质 remodeler6,7的绑定中的功能。利用这一技术, 我们确定了 PBRM1 在 PBAF 染色质重塑复合体中染色质结合的作用, 然后确定了六个体 bromodomains 对此函数的相对贡献7。

在这里, 我们描述如何优化这种方法来探索不同细胞类型的染色质结合, 以评估类似的染色质修饰复合物的相对结合亲和性, 以检查化学抑制剂的染色质蛋白质的位移, 并以确定染色质结合在染色质景观改变后的效果。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 准备工作

  1. 准备100毫升低渗溶液缓冲器 A: 0.3 米蔗糖, 60 毫米氯化钾, 60 毫米三 pH 8.0, 2 毫米 EDTA, 0.5% NP-40。存储在4和 #186; C.
    注意: 某些细胞系, 如 HEK293T, 需要较不严格的溶条件。如果原子核溶解容易, 使用修改的缓冲 A:25 毫米 HEPES pH 7.6, 25 毫米氯化钾, 5 毫米氯化镁 2 , 0.05 毫米 EDTA, 0.1% NP-40, 和10% 甘油.
  2. 准备一个250毫升的 2x mRIPA 溶液的库存解决方案: 100 mM pH 8.0, 2% NP-40, 和0.5% 钠胆酸.
  3. 准备100毫升的5米氯化钠的库存解决方案.
  4. 使用 2x mRIPA 和5米 nacl 溶液, 为六盐浓度的每一个都准备50毫升的 1x mRIPA 溶液: 0 毫米, 100 毫米, 200 毫米, 300 毫米, 400 毫米, 和500毫米氯化钠。在开始实验之前, 冷却所有的冰上的解决方案.
  5. 在所需条件下增大单元格线.
    注: 在确定击倒蛋白质的效果时, 必须将 SSE 与野生细胞进行比较。这些 SSE 必须并排执行。举例来说, 使用化学抑制剂或刺激, 请参阅 3-5 节.

2。基本顺序盐萃取

  1. 每种情况下收获800万细胞, 用5毫升冰冷 PBS 洗涤两次.
    注意: 有同等数量的细胞具有同等的蛋白质浓度是至关重要的。细胞的确切数量可能需要针对单个细胞系或特定的蛋白质进行优化。重要的是不要有太多, 因为增加的蛋白质浓度将阻止观察的洗脱曲线, 这是依赖于平衡结合。然而, 太少, #160; 细胞可能没有足够的蛋白质来检测曲线, 染色质颗粒更难隔离, 并可以在分数之间丢失.
  2. 重新悬浮在1毫升的缓冲液 + 蛋白酶抑制剂, 转移到1.5 毫升微离心管, 并旋转顶部超过底部在4和 #186; C 为 10 min.
  3. 通过离心 6000 x g 分离原子核 5 min 在4和 #186; C.
    注: 在这一步之后, 核信封仍应完好无损。如果核包完好无损, 颗粒将 re-suspend 充分;然而, 当信封是裂解和染色质释放, 颗粒不会 re-suspend。如果在缓冲孵化后核包络不完整, 请使用修改后的缓冲区 a.
  4. 添加200和 #181; L mRIPA 0 毫米氯化钠 + 蛋白酶抑制剂, 每核颗粒前 re-suspending 颗粒。质每样移15次, 用1毫升吸管。球团应该 re-suspend 容易, 然而, 原子核将溶解, 因为它是 pipetted 和样品将变得厚实和黏, 并且困难的吸管。
    1. 为了将球团拉入笔尖, 在离心管的底部插入吸管尖端的末端。一旦 DNA 从细胞核中释放出来, 颗粒就不会完全溶解, 但移会破坏它.
  5. 当所有样本均已匀浆时, 在冰上孵育所有样品3分钟.
    注意: 孵化时间可能需要根据感兴趣的蛋白质进行优化.
  6. 在 6500 x g 处离心3分钟, 在4和 #186 分离染色质颗粒; C.
  7. 将上清液转移到清洁的1.5 毫升离心管。这将是0毫米的分数。这0毫米 mRIPA 溶液可以作为一个洗涤步骤来溶解细胞核并去除任何与染色质无关的松散蛋白.
  8. 添加200和 #181; L mRIPA 100 毫米氯化钠 + 蛋白酶抑制剂, 每一个染色质颗粒前 re-suspending 颗粒。通过移15倍的颗粒来分解染色质颗粒.
    注意: 关键是要与 pipetted 中的球团的次数一致.
  9. 在冰上孵育3分钟。这一孵化步骤允许所有样本达到平衡状态, 这是特别重要的, 当有多个样本.
  10. 离心机在 6500 x g, 3 分钟在4和 #186; C 和转移上清到一个干净的1.5 毫升管.
  11. 对剩余的盐浓度重复 2.6-2.10.
    注: 400 毫米氯化钠后, mRIPA 颗粒应清晰, 7月29日, 不会停留在底部的管。颗粒可以放在离心管的盖子上, 而上清分离.
  12. 添加70和 #181; 将4x 蛋白质加载到每一个分数中, 并加载30和 #181; 每一个分数的 l 对 SDS 丙烯酰胺凝胶进行西部印迹分析.
    注: 要确定蛋白质的结合轮廓, 关键是要装载等量的裂解物, 而不是载入等量的蛋白质浓度.
  13. 通过转移到膜上并使用有兴趣的蛋白质的主要抗体来执行标准的免疫印迹.
  14. 从染色质定量蛋白质洗, 用成像仪在红外荧光 IRDye 二次抗体和图像印迹中孵育印迹。虽然其他的开发方法可以使用, 我们建议荧光或红外成像, 因为它是更定量的性质.
  15. 使用 ImageJ 或类似软件计算每个盐浓度的蛋白质洗强度。通过绘制对盐浓度的波段强度, 可以确定你感兴趣的蛋白质的洗脱模式.

3。在 #34; 读取器和 #34; 抑制剂

  1. 获取两组单元格 (400万) 并将原子核隔离为标准的 SSE.
  2. 在200和 #181 中重新挂起两个组; mRIPA 0 毫米氯化钠, 孵育3分钟。这将允许去除细胞核中的任何游离蛋白.
  3. 添加200和 #181; 每粒 mRIPA 0 毫米氯化钠。将抑制剂 (2 和 #181; 1 毫米 (+) JQ1) 添加到一个样品和一甲基亚砜到对照组.
  4. 用移15次搅动颗粒, 在冰上孵育5分钟.
  5. 离心机在 6500 x g, 3 分钟在4和 #186; C 和转移上清到一个干净的1.5 毫升管.
  6. 重复 3.3-4 对所有盐浓度和执行一个标准的西方印迹.

4。序贯盐萃取在 #34; 作家和 #34; 抑制剂

  1. 使用抑制剂 (10 和 #181; M) 或亚甲基亚砜治疗3小时的细胞
  2. 为每种治疗收集400万单元格.
  3. 为示例执行一个标准的 SSE, 并将抑制剂添加到所有缓冲区.

5。DNA 损伤后的序贯盐提取

  1. 使用1和 #181 处理单元格; M. 1 h.
  2. 更改单元格上的媒体并允许它们恢复3小时.
  3. 收集800万单元格并执行基本的 SSE

6。非顺序盐提取

  1. 收集1200万单元格并使用 PBS 进行清洗.
  2. 拆分单元格, 使每个微离心管有200万细胞.
  3. 在500和 #181 中重新挂起; 缓冲 A L, 孵育10分钟.
  4. 用离心法将原子核分离 6000 x g.
  5. 在200和 #181 中重新悬浮颗粒; 每个 mRIPA 缓冲液 + 氯化钠.
  6. 质每样移15次, 用1毫升吸管针尖.
  7. 在冰上孵育3分钟
  8. 通过离心 6500 x g 分离染色质, 并将上清液转移至清洁管。添加70和 #181; l 加载染料和运行30和 #181; 我在一个 SDS 页的凝胶中进行印迹分析.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文从文献6中, 论证了常用的顺序盐萃取 (SSE) 方法的优点和应用。在图 1中, 我们通过检测 ARID1a 和 PBRM1 的洗脱模式, 比较了 SSE 在提取蛋白质并发中的重现性。我们一贯观察, ARID1a, 一个曝气生物滤子亚基, elutes 主要在200毫米氯化钠和 PBRM1, 一个独家 PBAF 亚基, elutes 主要在300毫米氯化钠。图 1a显示了三独立的 SSE 与 800万 OVCA429 单元的复制。图 1b描绘了一个非盐提取物, 从200万细胞中分离出来的细胞核悬浮在一个盐缓冲液中。虽然这两种方法的结论, ARID1a elutes 在200毫米和 PBRM1 elutes 在300毫米, SSE 产生一个明确的绑定配置文件, 并允许明确区分这两个复合体的约束力。此外, 在非方法中, 400 mm 和 500 m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质和染色质相互作用通过盐萃取的表征是一种常用的方法, 已经使用了几十年14,15;然而, 它没有得到系统的优化, 以揭示它的充分效用。我们演示了这种顺序方法提供了一种快速和廉价的方法来区分染色质结合的变化时, 蛋白质或环境的改变。SSE 具有高度的适应性和优化, 重要的是, 它在技术上是简单的, 不需要专门的设备。在开始之前需要优化的关键方面是: 起始单元数、低渗缓冲条件和潜伏期。

细胞数的最重要的方面是它是一致的所有样品。当观察生物滤池复合物时, 使用800万细胞能很好地描述这些复合物是如何结合的;然而, 细胞的数量 (或缓冲的数量) 可能需要调整根据兴趣蛋白质的丰盈。重要的是要注意, 使用较少的细胞是有挑战性的, 因为在400毫米和500毫米氯化钠很难想象的染色质颗粒。这是至关重要的, 以确保颗粒没有转移与上清后, 400 毫米氯化钠。

为了准确地评估核蛋白, 细胞核需要保持完好, 直到它们与0毫米氯化...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有相互竞争的金融利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了 v 学者奖 (V2014-004) 和 v 学者加奖 (D2016-030) 从 v 的癌症研究基金会和美国癌症协会机构研究补助金 (ACS 表意文字补助金 58-006-53) 的支持, 以普渡大学癌症中心研究.e.g.p. 获得了普渡大学药物化学和分子药理学系创研究生捐赠奖的支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
氯化钠，晶体 2.5 kg AR （ACS）Avantor/Macron7581-06
蔗糖，晶体 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron8360-04
氯化钾，颗粒状 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron6858-04
Trizma（R） 碱，一级标准品和缓冲液，>=99.9%（滴定），结晶Sigma-AldrichT1503-1kg
EDTA（乙烯二硝基）四乙酸，二钠盐，二水合物 125 G AR （ACS）Avantor/Macron4931-02
NONIDET P-40 底物，100mL UN3082AmrescoE109-100ML
HEPES 缓冲液溶液 （1M）Gibco15630-080
氯化镁，6-水合物，晶体 500 g AR¨（美国有线电视协会）Avantor/Macron5958-04
甘油，1LAmresco0854-1L
脱氧胆酸钠盐，100gAmresco0613-100G
Eppendorf Research 加移液器Fisher Scientific13-690-032
Eppendorf 5424 R 冷冻微量离心机Eppendorf5424 R
小鼠二级 IgG HRP-linked细胞信号转导7076
二抗兔 IgG HRP 连接的细胞信号转导7074
BMI-1 抗体Millipore
PBRM1 抗体BethylA301-591A
ARID1a 抗体Santa Cruzsc-32761
BRD4 抗体BethylA301-9852a
（+） JQ1开曼化学公司11187
SAHA开曼化学公司10009929
阿霉素AK Scientific25316-40-9
二甲基亚砜 （DMSO）Macron4948-02
小型反式印迹细胞BioRad1703930
小型凝胶槽ThermoFisherA25977
牛白蛋白 （BSA）Amresco0332-100gPBS-T 中的 5% 溶液，作为蛋白质印迹的封闭溶液
Bolt MOPS SDS 电泳缓冲液 （20x）Life TechnologiesB0001
Bolt LDS 样品缓冲液 （4x）Life TechnologiesB0007
PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准，10 至 250 kDaThermoFisher26619
甲基酒精，无水Macron3041-10
胰蛋白酶 kEDTA，1XCellgro25-053-CI
叠氮化钠，250g UN1687Amresco0639-250G
十二烷基硫酸钠 （SDS）500g UN1325Amresco0227-500G
甘氨酸，用于电泳，>=99%Sigma-AldrichG8898-1kg
BigTop微量离心管，聚丙烯VWR20170-333
1000 和微量;L 移液器吸头VWR83007-382
NuPAGE Bis-Tris 预制胶 4-12%InvitrogenNW04125BOX
亮肽素半硫酸盐，5 MGRPI 研究产品22035-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液。
APROTININ，10 MGRPI 研究产品20550-0.01用于蛋白酶抑制剂溶液。
胃蛋白酶抑制剂 A，5 MGRPI 研究产品30100-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液。
OVCA429细胞由 Karen Cowden Dahl. 博士提供
HEK293TATCCCRL-3216
HeLa细胞ATCCCCL-2
麦考伊5A培养基康宁Mediatech10-050-CV
DMEM康宁Mediatech10-013-CV
最低必需培养基（MEM），粉末康宁Mediatech50-011-PC
MEM NEAA （100X）非必需氨基酸Gibco11140-050
FB-11：胎牛血清，美国来源Omega ScientificFB-11
青霉素-链霉素溶液Life Technologies15140-122
GlutamaxLife Technologies35050-061
丙酮酸钠Life Technologies11360070
VWR Power来源VWR13-690-032
用作

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
  2. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
  3. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  4. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  5. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
  6. Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
  7. Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
  8. Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
  9. Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
  10. Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
  11. Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
  12. Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
  13. Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
  14. Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
  15. Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sequential Salt ExtractionChromatin BindingProtein ElutionSalt ConcentrationWestern BlotSDS PAGE GelHypotonic BufferModified RIPAProtein Loading DyeImage Analysis

Related Articles