染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
由于染色质结构的复杂性以及大多数哺乳动物染色质修饰复合物的异质性，阐明靶向染色质蛋白的结合特性可能极具挑战性。为了克服这些困难，我们改进了一种连续盐萃取（SSE）实验方法，用于评估染色质结合复合物的相对结合亲和力。这种简便直接的实验方法可被非专业研究人员用于评估两个相关复合物之间结合亲和力的相对差异、某个亚基缺失或某个结构域失活时复合物亲和力的变化，以及染色质景观发生改变后结合亲和力的变化。通过在逐步增加盐浓度的条件下依次重新悬浮大量染色质，我们能够分析特定蛋白从染色质上的洗脱情况。利用这些洗脱谱型，我们可以确定染色质修饰复合物本身的改变或染色质环境的改变如何影响其结合相互作用。将SSE与其它体外（in vitro）和体内（in vivo）实验相结合，我们能够在多种染色质环境中明确各个结构域和蛋白质在复合物功能中所起的作用。
引言
真核细胞中的DNA调控是一个复杂而精密的系统，由多种蛋白质严格控制，这些蛋白质协调细胞内外刺激的响应。DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体，核小体可沿DNA松散分布，也可压缩成紧密的螺旋结构1。DNA与组蛋白的这种结构排列称为染色质，其受到一个蛋白质网络的调控，这些蛋白质能够“读取”、“书写”和“擦除”组蛋白上的翻译后修饰（PTM）2。某些组蛋白PTM（如乙酰化）会改变其修饰位点氨基酸的电荷，从而影响组蛋白与DNA之间的相互作用2。组蛋白PTM还可招募转录调控因子、染色质重塑复合物、DNA损伤修复机器以及DNA复制机器至基因组的特定区域3。
研究染色质相互作用的方法大多仅能检测小范围的相互作用，或需进行全基因组范围的大规模分析。体外结合实验通常使用单独的重组结构域与组蛋白肽段或DNA进行检测，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）、等温滴定微量热法、荧光偏振法以及肽段下拉实验。由于这些实验通常仅针对单一蛋白质结构域，因此有助于理解其中局部机制，但无法揭示多结构域蛋白质之间的协同作用，更难以阐明其在多蛋白复合物中的功能。此外，大多数哺乳动物染色质修饰复合物具有高度异质性的组成，这种蛋白质组成的复杂性，加上染色质环境的动态变化，使得在体外准确重现染色质蛋白与染....
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方案
1. 准备工作
- 配制100 mL低渗溶液缓冲液A：0.3 M蔗糖，60 mM KCl，60 mM Tris（pH 8.0），2 mM EDTA和0.5% NP-40。4 ºC保存。
注意：某些细胞系（如HEK293T）需要较温和的裂解条件。如果细胞核容易裂解，请使用改良缓冲液A：25 mM HEPES（pH 7.6），25 mM KCl，5 mM MgCl2，0.05 mM EDTA，0.1% NP-40和10%甘油。 - 配制250 mL 2x mRIPA储存液：100 mM Tris（pH 8.0），2% NP-40和0.5%脱氧胆酸钠。
- 配制100 mL 5 M NaCl储存液。
- 使用2x mRIPA溶液和5 M NaCl溶液，为以下六种NaCl浓度（0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM和500 mM）各配制50 mL的1x mRIPA溶液。实验开始前，将所有溶液置于冰上预冷。
- 在所需条件下培养细胞系。
注意：在确定敲低某种蛋白的影响时，必须将敲低细胞系的SSE结果与野生型细胞进行平行比较。这些SSE实验必须同时进行。有关使用化学抑制剂或刺激物的示例，请参见第3–5节。
2. 基本的逐级盐提取法
- 每种条件下收集800万个细胞，并用5 mL预冷的PBS洗涤两次....
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结果
本文中，我们展示了从文献中借鉴并改进的常用顺序盐梯度提取法（SSE）的优势与应用6。在图1中，我们通过检测ARID1a和PBRM1的洗脱模式，比较了SSE方法与非顺序盐提取方法的可重复性。我们 consistently 观察到，作为BAF复合物亚基的ARID1a主要在200 mM NaCl条件下洗脱，而专属于PBAF复合物的PBRM1则主要在300 mM NaCl条件下洗脱。图1a展示了使用800万个OVCA429细胞进行的三次独立SSE重复实验。图1b展示了一种非顺序盐提取方法，其中从200万个细胞中分离的细胞核被重悬于单一盐浓度缓冲液中。尽管两种方法均得出ARID1a在200 mM NaCl、PBRM1在300 mM NaCl条件下洗脱的结论，但SSE方法能够产生清晰明确的结合谱型，从而更清楚地区分这两个复合物的结合特性。此外，在非顺序提取方法.......
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讨论
通过盐溶液提取来表征蛋白质与染色质相互作用是一种已使用数十年的常用方法14,15；然而，此前尚未对其进行系统性优化以充分揭示其应用价值。我们展示了这种连续提取方法如何在蛋白质或环境发生改变时，快速且经济地分辨染色质结合状态的变化。SSE 方法具有高度可调性和可优化性，更重要的是，其技术操作简便，无需特殊设备。在开始实验前需要优化的关键参数包括：起始细胞数量、低渗缓冲液条件以及孵育时间。
细胞数量最重要的方面是在所有样品之间保持一致。在研究BAF复合物时，使用800万个细胞能够较好地显示这些复合物的结合情况；然而，细胞数量（或缓冲液体积）可能需要根据目标蛋白的丰度进行调整。需要注意的是，使用较少细胞会带来挑战，因为在400 mM和500 mM NaCl条件下难以观察到染色质沉淀。必须确保在400 mM NaCl处理后，沉淀物不会随上清液被转移。
为了准确评估核蛋白，细胞核必须保持完整，直到使用0 mM NaCl的.......
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了癌症研究V基金会的V学者奖（V2014-004）和V学者加奖（D2016-030），以及美国癌症协会机构研究拨款（ACS IRG拨款58-006-53）对普渡大学癌症研究中心的支持。E. G. P. 获得了普渡大学药物化学与分子药理学系博尔赫研究生捐赠奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠，晶体，2.5 kg，分析纯（AR）(ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| 蔗糖，晶体，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| 氯化钾，颗粒状，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base，一级标准品和缓冲液，>=99.9%（滴定法），结晶状 | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA（乙二胺四乙酸）二钠盐二水合物，125 g，分析纯（AR）(ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 底物，100 mL，UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES 缓冲液（1 M） | Gibco | 15630-080 | |
| 氯化镁六水合物，晶体，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| 甘油，1 L | Amresco | 0854-1L | |
| 脱氧胆酸钠，100 g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus 移液器 | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R 冷冻微量离心机 | Eppendorf | 5424 R | |
| 二抗小鼠 IgG HRP 标记 | Cell Signaling | 7076 | |
| 二抗兔 IgG HRP 标记 | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 抗体 | Millipore | ||
| PBRM1 抗体 | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a 抗体 | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 抗体 | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| 阿霉素 | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot 转膜装置 | BioRad | 1703930 | |
| Mini 凝胶电泳槽 | ThermoFisher | A25977 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Amresco | 0332-100g | 用作 Western blot 封闭液，配制成 PBS-T 中的 5% 溶液 |
| Bolt MOPS SDS 电泳缓冲液（20×） | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS 上样缓冲液（4×） | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus 预染蛋白 Marker，10 至 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| 甲醇，无水 | Macron | 3041-10 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液（1×） | Cellgro | 25-053-CI | |
| 叠氮化钠，250 g，UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS），500 g，UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| 甘氨酸，电泳级，>=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop 微量离心管，聚丙烯材质 | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL 移液器吸头 | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶，4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| 亮抑蛋白酶肽半硫酸盐，5 mg | RPI Research Products | 22035-0.005 | 用于蛋白酶抑制剂溶液 |
| 抑肽酶，10 mg | RPI Research Products | 20550-0.01 | 用于蛋白酶抑制剂溶液 |
| 胃蛋白酶抑制剂 A，5 mg | RPI Research Products | 30100-0.005 | 用于蛋白酶抑制剂溶液 |
| OVCA429 细胞 | 由 Karen Cowden Dahl 博士惠赠 | ||
| HEK293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa 细胞 | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A 培养基 | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM 培养基 | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| 最低必需培养基（MEM），粉末状 | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA（100×）非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11：胎牛血清，美国来源 | Omega Scientific | FB-11 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR 电源装置 | VWR | 13-690-032 |
参考文献
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselm....
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重印与许可
