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方法文章

用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

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DOI：

10.3791/55369

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2017年10月2日

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

本文内容

摘要

染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。

摘要

由于染色质结构的复杂性以及大多数哺乳动物染色质修饰复合物的异质性，阐明靶向染色质蛋白的结合特性可能极具挑战性。为了克服这些困难，我们改进了一种连续盐萃取（SSE）实验方法，用于评估染色质结合复合物的相对结合亲和力。这种简便直接的实验方法可被非专业研究人员用于评估两个相关复合物之间结合亲和力的相对差异、某个亚基缺失或某个结构域失活时复合物亲和力的变化，以及染色质景观发生改变后结合亲和力的变化。通过在逐步增加盐浓度的条件下依次重新悬浮大量染色质，我们能够分析特定蛋白从染色质上的洗脱情况。利用这些洗脱谱型，我们可以确定染色质修饰复合物本身的改变或染色质环境的改变如何影响其结合相互作用。将SSE与其它体外（in vitro）和体内（in vivo）实验相结合，我们能够在多种染色质环境中明确各个结构域和蛋白质在复合物功能中所起的作用。

引言

真核细胞中的DNA调控是一个复杂而精密的系统，由多种蛋白质严格控制，这些蛋白质协调细胞内外刺激的响应。DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体，核小体可沿DNA松散分布，也可压缩成紧密的螺旋结构1。DNA与组蛋白的这种结构排列称为染色质，其受到一个蛋白质网络的调控，这些蛋白质能够“读取”、“书写”和“擦除”组蛋白上的翻译后修饰（PTM）2。某些组蛋白PTM（如乙酰化）会改变其修饰位点氨基酸的电荷，从而影响组蛋白与DNA之间的相互作用2。组蛋白PTM还可招募转录调控因子、染色质重塑复合物、DNA损伤修复机器以及DNA复制机器至基因组的特定区域3。

研究染色质相互作用的方法大多仅能检测小范围的相互作用，或需进行全基因组范围的大规模分析。体外结合实验通常使用单独的重组结构域与组蛋白肽段或DNA进行检测，例如电泳迁移率变动分析（EMSA）、等温滴定微量热法、荧光偏振法以及肽段下拉实验。由于这些实验通常仅针对单一蛋白质结构域，因此有助于理解其中局部机制，但无法揭示多结构域蛋白质之间的协同作用，更难以阐明其在多蛋白复合物中的功能。此外，大多数哺乳动物染色质修饰复合物具有高度异质性的组成，这种蛋白质组成的复杂性，加上染色质环境的动态变化，使得在体外准确重现染色质蛋白与染色质在体内的结合相互作用变得极具挑战性。

体内 方法已取得显著进展；然而，这些方法通常成本高昂、耗时且在技术上具有挑战性。染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-seq）在确定蛋白质和组蛋白修饰在全基因组范围内的定位方面非常有用，但该方法需要大量优化4。通常需要将蛋白质与染色质交联以保持其相互作用；然而，这种方法可能产生人为的相互作用，并可能导致表位遮蔽5。此外，免疫沉淀（IP）需要高度特异性的抗体，并需利用已知结合位点通过 ChIP-qPCR 对 DNA 剪切和 IP 条件进行 extensive 优化，而这些信息往往在实验前无法获得。a priori。在完成 ChIP 条件优化后，样本处理成本较高，且测序与分析通常需要数周至数月时间。尽管该方法在鉴定染色质结合蛋白的全基因组定位方面具有不可替代的价值，但其高昂的成本和时间投入限制了其在探索微小变化如何影响全局结合特性的假设生成中的应用。

本文中，我们描述了如何利用连续盐提取（SSE）实验来研究染色质结合蛋白的全局结合特征，并区分蛋白质、蛋白复合物或整体PTM谱的改变如何影响其相互作用。尽管盐提取是一种广泛使用的技术，但我们展示了这种连续方法具有高度可重复性和多功能性。SSE使我们能够表征复合物中单个亚基甚至单个结构域如何贡献于该复合物与整体染色质的结合亲和力。SSE还可用于判断蛋白质的结合是否受到染色质景观变化的影响，从而提出有关组蛋白修饰靶向性的有趣假设，并可通过ChIP-seq及其他全基因组研究加以验证。

我们最初借鉴了Wu等人的方法，用于研究多溴域蛋白1（Polybromo1, PBRM1）在PBAF染色质重塑复合物结合功能中的作用6,7。利用该技术，我们确定了PBRM1在PBAF染色质重塑复合物中参与染色质结合的功能，并进一步分析了其六个独立的溴结构域在该功能中的相对贡献7。

本文介绍了如何优化该方法，以研究不同细胞类型中的染色质结合情况，评估相似的染色质修饰复合物之间的相对结合亲和力，检测化学抑制剂对蛋白质从染色质上解离的影响，以及确定染色质景观改变后染色质结合效应的变化。

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方案

1. 准备工作

  1. 配制100 mL低渗溶液缓冲液A：0.3 M蔗糖，60 mM KCl，60 mM Tris（pH 8.0），2 mM EDTA和0.5% NP-40。4 ºC保存。
    注意：某些细胞系（如HEK293T）需要较温和的裂解条件。如果细胞核容易裂解，请使用改良缓冲液A：25 mM HEPES（pH 7.6），25 mM KCl，5 mM MgCl2，0.05 mM EDTA，0.1% NP-40和10%甘油。
  2. 配制250 mL 2x mRIPA储存液：100 mM Tris（pH 8.0），2% NP-40和0.5%脱氧胆酸钠。
  3. 配制100 mL 5 M NaCl储存液。
  4. 使用2x mRIPA溶液和5 M NaCl溶液，为以下六种NaCl浓度（0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM和500 mM）各配制50 mL的1x mRIPA溶液。实验开始前，将所有溶液置于冰上预冷。
  5. 在所需条件下培养细胞系。
    注意：在确定敲低某种蛋白的影响时，必须将敲低细胞系的SSE结果与野生型细胞进行平行比较。这些SSE实验必须同时进行。有关使用化学抑制剂或刺激物的示例，请参见第3–5节。

2. 基本的逐级盐提取法

  1. 每种条件下收集800万个细胞，并用5 mL预冷的PBS洗涤两次。
    注意：必须确保细胞数量相等，以获得一致的蛋白浓度。具体细胞数量可能需要根据不同的细胞系或特定蛋白进行优化。细胞数量不宜过多，否则蛋白浓度过高会影响洗脱曲线的观察，因为该曲线依赖于平衡结合状态；但若细胞过少 ，则可能蛋白量不足而无法检测到曲线，且染色质沉淀难以分离，容易在不同组分间丢失。
  2. 将细胞重悬于1 mL Buffer A + 蛋白酶抑制剂中，转移至1.5 mL微量离心管中，于4 ºC 条件下上下翻转旋转10分钟。
  3. 在4 ºC 下以6000 × g离心5分钟，分离细胞核。
    注意：此步骤后核膜应保持完整。若核膜完整，沉淀应能完全重悬；若核膜已破裂并释放染色质，则沉淀无法完全重悬。若在Buffer A孵育后核膜不完整，请使用改良Buffer A。
  4. 在重悬沉淀前，向每个核沉淀中加入200 µL mRIPA 0 mM NaCl + 蛋白酶抑制剂。使用1 mL移液器吹打15次以均质化各样品。沉淀应较易重悬，但在吹打过程中细胞核会裂解，样品将变得浓稠、黏滞，难以移液。
    1. 为将沉淀吸入枪头，可轻敲移液器枪头底部接触离心管底。DNA从细胞核释放后沉淀不会完全溶解，但吹打可将其打散。
  5. 所有样品均完成均质化后，将样品置于冰上孵育3分钟。
    注意：孵育时间可能需要根据目标蛋白进行优化。
  6. 在4 ºC 下以6500 × g离心3分钟，分离染色质沉淀。
  7. 将上清液转移至洁净的1.5 mL离心管中，此为0 mM组分。该0 mM mRIPA溶液可作为洗涤步骤，用于裂解细胞核并去除未与染色质结合的松散蛋白。
  8. 在重悬沉淀前，向每个染色质沉淀中加入200 µL mRIPA 100 mM NaCl + 蛋白酶抑制剂。通过上下吹打15次将染色质沉淀打散。
    注意：吹打次数必须保持一致，这是关键操作。
  9. 在冰上孵育3分钟。此孵育步骤可使所有样品达到平衡状态，尤其在处理多个样品时尤为重要。
  10. 在4 ºC 下以6500 × g离心3分钟，将上清液转移至洁净的1.5 mL离心管中。
  11. 对剩余的盐浓度重复步骤2.6–2.10。
    注意：在400 mM NaCl之后，mRIPA中的沉淀应变得透明且呈胶状，不再沉于管底。可将沉淀暂时置于离心管盖中，以便分离上清液。
  12. 向每份组分中加入70 µL 4×蛋白上样缓冲液，取每份30 µL上样至SDS丙烯酰胺凝胶进行Western blot分析。
    注意：为确定蛋白的结合特征，关键是要上样等体积的裂解液，而非上样等量蛋白浓度。
  13. 通过标准Western blot流程将蛋白转移至膜上，并使用针对目标蛋白的一抗进行检测。
  14. 为定量从染色质洗脱的蛋白，将膜与红外荧光IRDye二抗孵育，并使用成像仪进行成像。尽管也可使用其他显色方法，我们推荐采用荧光或红外成像，因其具有更高的定量准确性。
  15. 使用ImageJ或类似软件计算各盐浓度下目标蛋白条带的强度。通过绘制条带强度随盐浓度变化的曲线，即可确定目标蛋白的洗脱模式。

3. 存在A情况下的连续盐提取 "读者" 抑制剂

  1. 收集两组细胞（400万），并按照标准的SSE方法分离细胞核。
  2. 将两组细胞重悬于200 µL不含NaCl的mRIPA缓冲液中，孵育3分钟，以去除细胞核中游离的蛋白质。
  3. 向每份细胞沉淀中加入200 µL不含NaCl的mRIPA缓冲液。向其中一份样品中加入抑制剂（2 µL的1 mM (+)JQ1），另一份对照组加入DMSO。
  4. 通过移液器吹打沉淀15次使其混匀，然后在冰上孵育5分钟。
  5. 在4 ºC条件下以6500 × g离心3分钟，将上清液转移至干净的1.5 mL离心管中。
  6. 针对所有盐浓度重复步骤3.3至4，并进行标准的蛋白质印迹（Western blot）分析。

4. 存在盐条件下的连续盐提取 "作者" 抑制剂

  1. 用抑制剂（10 µM SAHA）或 DMSO 处理细胞 3 小时。
  2. 每种处理收集 400 万个细胞。
  3. 对样品进行标准 SSE 操作，所有缓冲液中均需加入抑制剂。

5. DNA损伤后的连续盐提取

  1. 用 1 µM 阿霉素处理细胞 1 小时。
  2. 更换细胞培养基，让细胞恢复 3 小时。
  3. 收集 800 万个细胞，并进行基本的 SSE 实验。

6. 非连续盐提取法

  1. 收集1200万个细胞，并用PBS洗涤。
  2. 将细胞分装，每管含200万个细胞。
  3. 用500 µL缓冲液A重悬，孵育10分钟。
  4. 在6000 × g条件下离心，分离细胞核。
  5. 将沉淀物重悬于200 µL含NaCl的每种mRIPA缓冲液中。
  6. 用1 mL移液枪头反复吹打15次，使每份样品充分匀浆。
  7. 冰上孵育3分钟。
  8. 在6500 × g条件下离心分离染色质，将上清液转移至洁净离心管中。加入70 µL上样染料，取30 µL进行SDS-PAGE凝胶电泳，用于Western blot分析。

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结果

本文中，我们展示了从文献中借鉴并改进的常用顺序盐梯度提取法（SSE）的优势与应用6。在图1中，我们通过检测ARID1a和PBRM1的洗脱模式，比较了SSE方法与非顺序盐提取方法的可重复性。我们 consistently 观察到，作为BAF复合物亚基的ARID1a主要在200 mM NaCl条件下洗脱，而专属于PBAF复合物的PBRM1则主要在300 mM NaCl条件下洗脱。图1a展示了使用800万个OVCA429细胞进行的三次独立SSE重复实验。图1b展示了一种非顺序盐提取方法，其中从200万个细胞中分离的细胞核被重悬于单一盐浓度缓冲液中。尽管两种方法均得出ARID1a在200 mM NaCl、PBRM1在300 mM NaCl条件下洗脱的结论，但SSE方法能够产生清晰明确的结合谱型，从而更清楚地区分这两个复合物的结合特性。此外，在非顺序提取方法...

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讨论

通过盐溶液提取来表征蛋白质与染色质相互作用是一种已使用数十年的常用方法14,15；然而，此前尚未对其进行系统性优化以充分揭示其应用价值。我们展示了这种连续提取方法如何在蛋白质或环境发生改变时，快速且经济地分辨染色质结合状态的变化。SSE 方法具有高度可调性和可优化性，更重要的是，其技术操作简便，无需特殊设备。在开始实验前需要优化的关键参数包括：起始细胞数量、低渗缓冲液条件以及孵育时间。

细胞数量最重要的方面是在所有样品之间保持一致。在研究BAF复合物时，使用800万个细胞能够较好地显示这些复合物的结合情况；然而，细胞数量（或缓冲液体积）可能需要根据目标蛋白的丰度进行调整。需要注意的是，使用较少细胞会带来挑战，因为在400 mM和500 mM NaCl条件下难以观察到染色质沉淀。必须确保在400 mM NaCl处理后，沉淀物不会随上清液被转移。

为了准确评估核蛋白，细胞核必须保持完整，直到使用0 mM NaCl的...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本工作获得了癌症研究V基金会的V学者奖（V2014-004）和V学者加奖（D2016-030），以及美国癌症协会机构研究拨款（ACS IRG拨款58-006-53）对普渡大学癌症研究中心的支持。E. G. P. 获得了普渡大学药物化学与分子药理学系博尔赫研究生捐赠奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠，晶体，2.5 kg，分析纯（AR）(ACS)Avantor/Macron7581-06
蔗糖，晶体，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS)Avantor/Macron8360-04
氯化钾，颗粒状，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS)Avantor/Macron6858-04
Trizma(R) base，一级标准品和缓冲液，>=99.9%（滴定法），结晶状Sigma-AldrichT1503-1kg
EDTA（乙二胺四乙酸）二钠盐二水合物，125 g，分析纯（AR）(ACS)Avantor/Macron4931-02
NONIDET P-40 底物，100 mL，UN3082AmrescoE109-100ML
HEPES 缓冲液（1 M）Gibco15630-080
氯化镁六水合物，晶体，500 g，分析纯（AR）¨ (ACS)Avantor/Macron5958-04
甘油，1 LAmresco0854-1L
脱氧胆酸钠，100 gAmresco0613-100G
Eppendorf Research plus 移液器Fisher Scientific13-690-032
Eppendorf 5424 R 冷冻微量离心机Eppendorf5424 R
二抗小鼠 IgG HRP 标记Cell Signaling7076
二抗兔 IgG HRP 标记Cell Signaling7074
BMI-1 抗体Millipore
PBRM1 抗体BethylA301-591A
ARID1a 抗体Santa Cruzsc-32761
BRD4 抗体BethylA301-9852a
(+) JQ1Cayman Chemical Company11187
SAHACayman Chemical Company10009929
阿霉素AK Scientific25316-40-9
二甲基亚砜（DMSO）Macron4948-02
Mini Trans-Blot 转膜装置BioRad1703930
Mini 凝胶电泳槽ThermoFisherA25977
牛血清白蛋白（BSA）Amresco0332-100g用作 Western blot 封闭液，配制成 PBS-T 中的 5% 溶液
Bolt MOPS SDS 电泳缓冲液（20×）Life TechnologiesB0001
Bolt LDS 上样缓冲液（4×）Life TechnologiesB0007
PageRuler Plus 预染蛋白 Marker，10 至 250 kDaThermoFisher26619
甲醇，无水Macron3041-10
胰蛋白酶-EDTA 溶液（1×）Cellgro25-053-CI
叠氮化钠，250 g，UN1687Amresco0639-250G
十二烷基硫酸钠（SDS），500 g，UN1325Amresco0227-500G
甘氨酸，电泳级，>=99%Sigma-AldrichG8898-1kg
BigTop 微量离心管，聚丙烯材质VWR20170-333
1000 µL 移液器吸头VWR83007-382
NuPAGE Bis-Tris 预制胶，4-12%InvitrogenNW04125BOX
亮抑蛋白酶肽半硫酸盐，5 mgRPI Research Products22035-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液
抑肽酶，10 mgRPI Research Products20550-0.01用于蛋白酶抑制剂溶液
胃蛋白酶抑制剂 A，5 mgRPI Research Products30100-0.005用于蛋白酶抑制剂溶液
OVCA429 细胞由 Karen Cowden Dahl 博士惠赠
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
HeLa 细胞ATCCCCL-2
McCoy's 5A 培养基Corning Mediatech10-050-CV
DMEM 培养基Corning Mediatech10-013-CV
最低必需培养基（MEM），粉末状Corning Mediatech50-011-PC
MEM NEAA（100×）非必需氨基酸Gibco11140-050
FB-11：胎牛血清，美国来源Omega ScientificFB-11
青霉素-链霉素溶液Life Technologies15140-122
GlutamaxLife Technologies35050-061
丙酮酸钠Life Technologies11360070
VWR 电源装置VWR13-690-032

参考文献

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