通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。
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本文内容
摘要
摘要
转染是将外源核酸导入细胞的技术，在蛋白质研究中是一种强大的工具。通过该方法，可利用电生理分析、生化表征、突变研究以及其对细胞过程的影响来研究离子通道。瞬时转染提供了一种简单方案，可在数小时至数天内获得用于分析的蛋白质。尽管该方法具有相对简便且省时的优点，但其中一个关键环节是将目的基因的表达水平校准至生理相关水平或适合分析的水平。为此，已发展出多种能够调控目的基因表达的方法。一些稳定的细胞转染方案可通过四环素调控的转录激活系统，将目的基因永久性地整合到细胞基因组中。虽然该技术可实现可靠的表达水平，但每个目的基因都需要数周的熟练操作，包括杀灭曲线的校准、细胞克隆的筛选以及消耗更多的资源。本文介绍一种在可诱导系统中对瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）基因进行瞬时转染的方案，作为一种高效、可控表达蛋白质的方法，这对于离子通道分析至关重要。我们证明，利用该技术可通过一次转染，实现钙成像、全细胞记录以及单通道分析，并对每种数据采集所需的通道表达水平进行精确控制。总体而言，该方法提供了一种可重复的技术，可用于研究离子通道的结构与功能。
引言
异源表达系统是研究多种细胞功能最常用的技术之一1其内源性蛋白表达水平低、培养需求简单、生长稳定，且具有摄取并表达外源DNA的能力，使得人胚胎肾细胞（HEK293）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等细胞系几乎成为生物研究中不可或缺的工具。2,3使用异源表达系统的研究领域包括膜蛋白、细胞内信号转导以及酶活性研究。在将外源DNA转染入细胞后，可进行多种不同形式的分析，包括电生理学检测、比率法钙成像、蛋白质印迹（western blot） 等。4,5.
由于异源表达系统具有广泛的应用前景，人们已开发出多种不同的试剂和产品，以利用这些细胞及其特性6。将外源DNA瞬时或稳定整合到细胞中的DNA递送系统，已成为研究外源蛋白最常用且最有用的生物学研究工具之一。更具体而言，将DNA瞬时转染到细胞中是一种被广泛采用的简单直接的方法，所需时间和材料相对较少。此外，成功转染的细胞比例较高7。当该技术与绿色荧光蛋白（GFP）等标记基因联合使用时，可靠性很高，可用于钙成像和电生理学等多种不同技术
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方案
1. 将目的基因连接至载体的可抑制位点
- 获取一种可诱导表达的载体，例如 pcDNA5/FRT/TO 或 pcDNA4/TO。
- 分析目的基因中是否存在位于基因中部且在所选载体的多克隆位点中也含有的潜在易感限制性酶切位点 计算机模拟 DNA分析软件4.
- 使用标准的重叠PCR技术4在目的基因两端分别插入两个选定的限制性内切酶识别位点（该识别位点在目的基因中不存在），其中一个位于起始密码子之前，另一个位于终止密码子之后。
- 用步骤1.2中选择的限制性内切酶在酶的最适温度下对载体和插入片段进行双酶切反应，反应时间为1小时；随后仅在载体反应体系中加入1单位的小牛肠碱性磷酸酶（CIP），30分钟，以防止载体自连。
- 将消化后的DNA上样至1%琼脂糖凝胶，通过电泳分离切割后的片段9.
- 使用紫外光照射，用刀片切下含有目标载体片段和待连接插入片段的凝胶部分。
- 从琼脂糖凝胶片段中提取DNA（使用市售DNA提取试剂盒），并通过分光光度计在260 nm处测定其最终浓度。
- 将目的基因与诱导型选择载体在室温下用T4连接酶连接20分钟。为提高插入片段与载体连接的概率，插入片段与载体的摩尔比应采用3:1。作为对照，设置仅包含载体的连接反应。
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结果
为快速构建可诱导表达模型，我们采用了表达四环素阻遏蛋白（TR）的 HEK293 细胞例如， T-REx-293）以及在CMV启动子与多克隆位点之间含有四环素操纵子序列（TetO）的载体例如， pcDNA4/TO)。当将该质粒转染至TREx-293细胞时，由于TR蛋白可结合TetO序列，pcDNA4/TO载体中目的基因的表达受到抑制。向培养基中加入多西环素可阻断TR与TetO的结合，从而允许转染蛋白的表达。为调控大鼠TRPV1（rTRPV1）的表达，我们首先按照上述方案将该通道基因插入pcDNA4/TO载体中。随后，根据方案第3步的操作，将rTRPV1-pcDNA4/TO质粒转染至T-REx-293细胞。转染后，通过在培养体系中加入多西环素诱导rTRPV1的表达。1 μg/mL）孵育1-4小时。重要的是，可使用不同浓度的多西环素以达到所需的表达水平。我们通过施加rTRPV1的激动剂辣椒素，结合电生理学和钙成像方法，在每个时间点评估rTRPV1的表达水平。如图所示 图 1<.......
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讨论
转染是一种广泛用于蛋白质表达与研究的实验方案，存在多种不同变体以提高表达的一致性与稳定性。瞬时转染试剂提供了一种简单、易于操作的流程，可在转染后的数小时至过夜时间内对目标细胞和目标蛋白质进行分析。然而，当分析方法需要稳定的蛋白质表达水平时，例如电生理学中的单通道记录，该方法可能表现出不可预测性。2或者，已开发出基于四环素可抑制表达系统的稳定细胞系，以提供一种调控目的蛋白表达水平的方法12该方法通过添加四环素类衍生物（如多西环素）作为补充剂，实现培养物中所有细胞的稳定表达。尽管这种方法能够对蛋白水平进行一致且精确的调控，但所需的时间和投入的精力也相应增加 建立稳定细胞系的过程在研究多种蛋白质时显得不便且具有劣势8.
本文介绍的实验方案为现有的转染方法提供了一种折中的解决方案。通过在含有四环素阻遏蛋白的细胞中，瞬时转染一个受可控启动子调控的基因，我们能够在避免繁琐复杂操作步骤的同时实现基因表达的精确控制。在此，我们以非选择性阳离子通道.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以色列科学基金会资助［资助号：1721/12、1368/12 和 1444/16］（授予 A.P.）。A.P. 隶属于耶路撒冷希伯来大学药学院布雷特勒中心和大卫·R·布鲁姆中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pcDNA™4/TO 哺乳动物表达载体 | 赛默飞世尔科技 | V102020 | |
| pcDNA™5/TO 哺乳动物表达载体 | 赛默飞世尔科技 | V103320 | |
| PureLink Quick PCR 纯化试剂盒 | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro 温度循环仪 | Esco | 无可用信息 | |
| 限制性内切酶 | 赛默飞世尔科技 | ER0501 | |
| 琼脂糖 | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | 赛默飞世尔科技 | ND-2000C | |
| T4 DNA连接酶 | 赛默飞世尔科技 | EL0011 | |
| 一次转化法® TOP10 化学感受态细胞 E. coli | 赛默飞世尔科技 | C404006 | |
| 氨苄青霉素（钠），USP级 | Gold Bio | A-301-5 | |
| 微生物学用胰蛋白胨 | 默克 | 6.19305×10¹³ | |
| 酵母提取物 | BD 全球 | 212750 | |
| SIF6000R 恒温振荡器 | 实验伴侣 | 45H118 | |
| NucleoSpin®质粒 | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V 电源供应器 | 主要科学领域 | MP-300V | |
| 猫头鹰™ EasyCast™ B1A Mini胶电泳系统 | 赛默飞世尔科技 | B1A | |
| T-REx™-293细胞系 | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM（1×），液体（高葡萄糖） | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® 缓冲液 | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR 哺乳动物表达载体 | 赛默飞世尔科技 | V102520 | |
| 胎牛血清（FBS），经鉴定，符合欧盟标准，南美洲来源 | Gibco | 10270106 | |
| HEPES缓冲液（1 M） | 生物工业公司 | 03-025-1B | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 生物工业公司 | 03-031-1B | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（稳定型谷氨酰胺）（200 mM） | 生物工业公司 | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ II级生物安全柜 | 赛默飞世尔科技 | 51025411 | |
| 盐酸杀稻瘟菌素S | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| 杜尔贝科’无氯化钙和氯化镁的改良型 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS） | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 | Gibco | 25300054 | |
| 双Neubauer刻度金属化血细胞计数板 | 豪泽科学 | 31000 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 转染试剂 | Mirus | MIR 2300 | |
| 玻璃盖玻片，1号厚度，直径12 mm圆形 | 克尼特尔玻璃 | GG-12 | |
| BioCoat™ 聚-D-赖氨酸（PDL） | 康宁 | 354210 | |
| 水，细胞培养级 | 生物工业公司 | 03-055-1A | |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM 酯 | Biotium | BTM-50034 | |
| 泊洛沙姆® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-第8孔 | ibidi | 80826 | |
| (E)-辣椒素 | Tocris | 462 | |
| 奥林巴斯IX70荧光显微镜 | Olympus | 无可用信息 | |
| Lambda DG-4 波长切换器 | Sutter Instruments | 无 | |
| EXi Blue 荧光显微镜相机 | QImaging | 无可用数据 | |
| MetaFluor 荧光比率成像软件 | Molecular Devices | 无 | |
| 薄壁硼硅玻璃管 | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| 标准壁厚硼硅酸盐玻璃管 | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| 无水二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 显微操作仪 | NARISHIGE | 无可用信息 | |
| ValveBank 灌注系统 | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A 低噪声数据采集系统 | Molecular Devices | 无可用信息 | |
| Axopatch 200B 放大器 | Molecular Devices | 无可用信息 | |
| pCLAMP 10.6 软件 | Molecular Devices | 无 | |
| 显微操作仪 | Sutter Instruments | MP-225 |
参考文献
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300(2016).
- Thomas, P., Smart, T. G.
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重印与许可
