通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

摘要

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。

摘要

转染是将外源核酸导入细胞的技术，在蛋白质研究中是一种强大的工具。通过该方法，可利用电生理分析、生化表征、突变研究以及其对细胞过程的影响来研究离子通道。瞬时转染提供了一种简单方案，可在数小时至数天内获得用于分析的蛋白质。尽管该方法具有相对简便且省时的优点，但其中一个关键环节是将目的基因的表达水平校准至生理相关水平或适合分析的水平。为此，已发展出多种能够调控目的基因表达的方法。一些稳定的细胞转染方案可通过四环素调控的转录激活系统，将目的基因永久性地整合到细胞基因组中。虽然该技术可实现可靠的表达水平，但每个目的基因都需要数周的熟练操作，包括杀灭曲线的校准、细胞克隆的筛选以及消耗更多的资源。本文介绍一种在可诱导系统中对瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）基因进行瞬时转染的方案，作为一种高效、可控表达蛋白质的方法，这对于离子通道分析至关重要。我们证明，利用该技术可通过一次转染，实现钙成像、全细胞记录以及单通道分析，并对每种数据采集所需的通道表达水平进行精确控制。总体而言，该方法提供了一种可重复的技术，可用于研究离子通道的结构与功能。

引言

异源表达系统是研究多种细胞功能最常用的技术之一¹其内源性蛋白表达水平低、培养需求简单、生长稳定，且具有摄取并表达外源DNA的能力，使得人胚胎肾细胞（HEK293）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等细胞系几乎成为生物研究中不可或缺的工具。^2,3使用异源表达系统的研究领域包括膜蛋白、细胞内信号转导以及酶活性研究。在将外源DNA转染入细胞后，可进行多种不同形式的分析，包括电生理学检测、比率法钙成像、蛋白质印迹（western blot） 等。^4,5.

由于异源表达系统具有广泛的应用前景，人们已开发出多种不同的试剂和产品，以利用这些细胞及其特性⁶。将外源DNA瞬时或稳定整合到细胞中的DNA递送系统，已成为研究外源蛋白最常用且最有用的生物学研究工具之一。更具体而言，将DNA瞬时转染到细胞中是一种被广泛采用的简单直接的方法，所需时间和材料相对较少。此外，成功转染的细胞比例较高⁷。当该技术与绿色荧光蛋白（GFP）等标记基因联合使用时，可靠性很高，可用于钙成像和电生理学等多种不同技术⁵。然而，瞬时在宿主细胞中表达DNA也存在一些重大缺陷，其中尤为突出的是单个细胞的表达水平不可靠。每个细胞摄取的质粒DNA拷贝数无法控制，因此不同实验之间的表达水平可能存在很大差异²。当需要模拟生理条件或进行精确的数据采集时，这一问题尤为显著。

为解决上述问题，已设计出稳定的转染方案，其中可在可诱导启动子（如四环素阻遏表达系统）的严格调控下，将目的基因插入细胞基因组中，确保每个细胞基因组仅整合一个质粒拷贝，并且仅在转录机制被诱导后（例如在多西环素存在的情况下）才表达目的蛋白。尽管该方法克服了瞬时转染中蛋白表达水平不一致的难题，但却失去了瞬时转染快速且相对简便操作流程的优势。建立稳定细胞系至少需要数周时间，期间必须针对特定抗生素确定杀灭曲线，以维持蛋白表达并确保载体整合，同时需熟练地筛选和培养单克隆细胞集落。总体而言，该方法耗时更长、工作量更大，且成功率较低​⁸。

在此，我们介绍一种中间实验方案，该方案结合了两种常用转染方法的优势，为在任何可诱导细胞系中控制表达水平提供了一种简单且有效的方法。在维持带有可诱导 tet 系统的细胞的同时，我们对目标基因进行瞬时转染。 瞬时受体电位香草素亚家族成员1（TRPV1）被克隆至可与阻遏系统同源重组的载体中。通过该方法，基因可被导入细胞而不立即表达，仅在加入多西环素后才启动表达，使我们能够根据实验技术或生理条件下观察到的蛋白表达水平进行校准。本方案还避免了构建稳定表达细胞系所伴随的冗长操作。我们首先展示了从非诱导状态到诱导四小时期间，通过钙成像检测TRPV1激活水平的动态变化，以及细胞内钙离子浓度升高的相关性。随后，我们在膜片钳全细胞记录模式下重复该实验，显示随着诱导时间延长，电流逐渐增强。最后，我们提供了单通道电生理记录的示例，表明该技术在需要基于蛋白单体进行精确数据采集时，尤其适用于可控表达。通过本实验方案，我们提供了一种在异源表达系统中便捷调控蛋白表达的方法，避免了复杂的长期细胞培养过程，从而实现在不同实验间控制实验条件，并获得更具可重复性的结果。

方案

1. 将目的基因连接至载体的可抑制位点

1. 获取一种可诱导表达的载体，例如 pcDNA5/FRT/TO 或 pcDNA4/TO。
2. 分析目的基因中是否存在位于基因中部且在所选载体的多克隆位点中也含有的潜在易感限制性酶切位点 计算机模拟 DNA分析软件⁴.
3. 使用标准的重叠PCR技术⁴在目的基因两端分别插入两个选定的限制性内切酶识别位点（该识别位点在目的基因中不存在），其中一个位于起始密码子之前，另一个位于终止密码子之后。
4. 用步骤1.2中选择的限制性内切酶在酶的最适温度下对载体和插入片段进行双酶切反应，反应时间为1小时；随后仅在载体反应体系中加入1单位的小牛肠碱性磷酸酶（CIP），30分钟，以防止载体自连。
5. 将消化后的DNA上样至1%琼脂糖凝胶，通过电泳分离切割后的片段⁹.
6. 使用紫外光照射，用刀片切下含有目标载体片段和待连接插入片段的凝胶部分。
7. 从琼脂糖凝胶片段中提取DNA（使用市售DNA提取试剂盒），并通过分光光度计在260 nm处测定其最终浓度。
8. 将目的基因与诱导型选择载体在室温下用T4连接酶连接20分钟。为提高插入片段与载体连接的概率，插入片段与载体的摩尔比应采用3:1。作为对照，设置仅包含载体的连接反应。
9. 用于细菌转化时，将10 ng的空载体以及载体加目的基因分别加入50 μL感受态细胞中 大肠杆菌将离心管置于冰上孵育30分钟，随后在42 °C孵育45秒。立即放回冰上孵育2分钟，将转化后的细菌转移至500 μL LB培养基，37 °C、220 rpm振荡培养1小时。
10. 为筛选成功转化的细菌，涂布100 μL 每个反应（如1.9所述）接种到含有适当抗生素的预配制LB琼脂平板上（例如，使用pCDNA4/TR时加入100 μg/mL氨苄青霉素。
11. 37 °C过夜培养。用塑料封口膜 tightly 密封后，平板可在4 °C保存长达两周。
12. 使用10 μL枪头挑取单菌落，于3 mL LB加抗生素培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养过夜。如需短期保存含目的DNA的细菌，可将LB培养液与细菌在11,000 × g离心后吸除上清，菌体于-20 °C冷冻保存。长期保存则需将细菌制成甘油菌，在-80 °C冻存。
13. 通过小提法提取DNA，并在260 nm波长下用分光光度计测定最终浓度⁵.
14. 通过测序纯化的构建体确认目的基因的成功插入⁴或者，也可通过限制性内切酶对构建体进行诊断性酶切，利用电泳分离酶切片段，并检测其存在与否及长度，以达到此目的。⁴.

2. 培养表达 TetR 的细胞系

1. 获取一种基因组DNA中整合有Tet阻遏质粒的细胞系。本实验方案以含有pcDNA6/TR质粒的人胚肾293T细胞（HEK-293T）为例进行说明。
2. 将细胞接种于100 mm组织培养皿中，加入含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和25 mM HEPES（pH 7.3）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（以下简称完全DMEM），在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。所有细胞操作均应在生物安全柜中的无菌条件下进行。
3. 为维持Tet阻遏蛋白基因的表达，吸除培养基，并更换为添加5 µg/mL杀稻瘟菌素的完全DMEM。在37 °C、5% CO₂条件下继续培养细胞。
4. 当细胞融合度达到80–90%时，吸除培养基，并用预热至37 °C的不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（DPBS）轻柔洗涤细胞两次。
5. 为在不造成机械损伤的情况下轻柔地消化细胞，将培养皿置于含0.05%胰蛋白酶的DMEM中，在37 °C孵育1.5分钟。
6. 加入等体积的完全DMEM以终止胰酶消化作用。轻柔吹打数次使细胞脱落，并转移至无菌离心管中。
7. 在200 × g条件下离心5分钟。
8. 吸除上清液，加入1 mL完全DMEM重悬细胞沉淀。反复吹打直至无可见细胞团块。使用血细胞计数板对细胞进行计数并计算细胞数量。
9. 将1–2 × 10⁶个细胞接种至含12 mL完全DMEM（添加5 µg/mL杀稻瘟菌素）的100 mm组织培养皿中。当细胞融合度达到90%时，每周传代两次。

3. 将目的质粒转染入细胞

1. 采用与上述相同的细胞传代方法，将细胞接种至已加入0.9 mL完全DMEM培养基的12孔板中，使细胞密度约为50%融合度（约200,000个细胞），于37 °C、CO₂培养箱中过夜培养。
2. 配制转染混合物：将含有目的基因的pcDNA4/TO质粒、作为填充的惰性质粒（如需使总DNA量达到1 µg）、3 µL脂质转染试剂以及DMEM培养基混合，终体积为100 µL。由于不同蛋白的表达效率差异较大，所需质粒DNA的最佳用量可能有较大变化。若进行电生理实验，需在转染混合物中加入含EGFP的哺乳动物表达质粒，以便识别成功转染的细胞⁴。
3. 将转染混合物在室温下孵育30分钟。
4. 将转染混合物逐滴加入12孔板中的细胞培养孔内，轻轻吹打或剧烈摇动培养板，以确保DNA与转染试剂均匀分散。转染时细胞融合度应约为80%。
5. 将转染后的细胞在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
6. 若进行电生理实验，次日早晨在紫外灯下观察EGFP荧光信号，以确认细胞是否成功转染。

4. 在多聚-D-赖氨酸（PDL）盖玻片/孔板上接种细胞

1. 用70%异丙醇溶液浸泡12 mm盖玻片进行灭菌。干燥后，将单个盖玻片放入24孔板的每个孔中，用于电生理记录。
2. 向每个盖玻片或钙成像培养皿的每个孔中加入0.1–0.2 mg/mL的PDL溶液，使用移液器滴加。
3. 在37 °C、5% CO₂培养箱中静置30分钟。
4. 用细胞培养级的双蒸水（DDW）洗涤三次，每次洗涤之间用抽吸法去除液体。最后一次洗涤后，彻底干燥，并在室温下静置。
5. 对于电生理实验，向每个含有PDL包被盖玻片的孔中加入500 µL预热至37 °C的完全DMEM培养基。
6. 转染细胞的传代方法同上。胰酶处理并阻断后，将细胞重悬，取80 µL细胞悬液（约30,000个细胞）转移至每个PDL包被盖玻片的中央，用于电生理记录。让细胞沉降至少1.5小时，或在37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
7. 对于钙成像实验，将20 µL细胞悬液（约20,000个细胞）转移并滴加至每个PDL包被的钙成像孔中央。让细胞沉降至少30 min ，然后向每孔加入180 µL完全DMEM培养基。

5. 诱导基因表达

1. 根据制造商说明，用去离子水（DDW）配制浓度为 1 mg/mL 的多西环素储备液。储备液置于 4 °C 避光保存，可使用长达 3 周。如需长期保存，应将多西环素储备液存于 -20 °C。
2. 在完全 DMEM 培养基中新鲜配制 2 µg/mL（用于电生理记录）或 3 µg/mL（用于钙成像）的多西环素工作液，并将其预热至 37 °C。
3. 进行电生理记录时，向每个孔中加入 500 µL 的 2 µg/mL 多西环素溶液，使终浓度为 1 µg/mL。进行钙成像时，向每个孔中加入 100 µL 的 3 µg/mL 多西环素溶液，使终浓度同样为 1 µg/mL。记录诱导开始的时间。
4. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育所需时间以完成诱导。

6. 蛋白质表达时间线的校准

1. 通过钙成像校准蛋白质表达^5,10
   1. 配制林格氏液（140 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、2 mM MgSO₄、20 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4），并将溶液预热至 37 °C。
   2. 在林格氏液中配制通道激动剂的饱和浓度。由于向含有细胞和细胞外液的钙成像腔室中添加激动剂时会发生稀释，因此激动剂的加入量应为所需终浓度的两倍。 这也意味着每个孔中灌流液体积的控制至关重要。
   3. 配制20% W/V的非离子型F-127 DMSO溶液。将溶液加热至40 °C，直至非离子型F-127完全溶解。将非离子型F-127溶液在室温下储存，并在使用前加热至40 °C。非离子型F-127用于帮助分散荧光离子探针（如Fura-2）的乙酰氧基甲酯（AM酯）在水溶液中的溶解。
   4. 吸除培养基，替换为Fura-2AM负载溶液（林格氏液中添加2–3 µM Fura-2AM、0.02 mg/mL非离子型F-127和10 mM D-葡萄糖）。
   5. 在室温下避光孵育60分钟。
   6. 吸除Fura-2AM溶液，用含10 mM D-葡萄糖的林格氏液洗涤细胞，以去除细胞外残留染料。重复此步骤两次。
   7. 每孔中保留200 µL含10 mM D-葡萄糖的林格氏液，在室温下避光孵育30分钟。
   8. 将培养腔置于显微镜物镜上方的载物台上，并用固定夹固定。
   9. 打开光源、相机和显微镜，选择Fura-2滤光片，以检测510 nm波长的发射光。
   10. 调节至所需放大倍数，并对选定视野中的细胞进行聚焦。
   11. 在暗环境中，扣除背景光并设定曝光时间。
   12. 以设定的采样速率进行图像采集，通过在340 和380 nm波长激发，记录Fura-2负载细胞的荧光响应。340/380信号比值可反映细胞内Ca²⁺浓度，从而也反映TRPV1的活性。
   13. 用移液器向200 µL林格氏液中加入2 µM辣椒素，使终浓度达到1 µM的饱和浓度，以评估TRPV1的表达水平。
   14. 根据诱导时间分析TRPV1的响应，并确定目标蛋白的实验方案。
2. 利用膜片钳技术的全细胞构型在异源表达系统中调节蛋白质表达^4,11。
   1. 配制灌流液（单位：mM）：140 NaCl、2.3 KCl、2 MgSO₄、5 HEPES和5 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES），用NaOH调节pH至7.4。
   2. 在细胞外液中配制通道激动剂的饱和浓度。
   3. 拉制内径（I.D.）为1.10 mm的玻璃电极，并经火焰抛光至电阻为2–4 MΩ。
   4. 配制电极内液（单位：mM）：130 KCl、4 NaCl、2 MgSO₄、0.5 CaCl₂、1 EGTA和10 HEPES，用KOH调节pH至7.2。使用前对电极内液进行过滤。每次实验前，将一根火焰抛光的玻璃电极尖端浸入电极内液中至少1分钟，然后用装有相同电极内液的注射器通过熔融并拉伸的尖端将其充满。
   5. 轻轻将涂有PDL的细胞培养盖玻片从孔板中取出，转移至一个盛有约2 mL室温灌流液的35 mm塑料培养皿中。在倒置荧光显微镜下观察。
   6. 在制备好的盖玻片上，找到在荧光显微镜下可见的EGFP阳性细胞，并将其移至视野中央。
   7. 将已填充的电极连接至显微操作器的电极夹持器上，并向系统内注入少量正压，以防止细胞内电极液被污染。将电极缓慢下降至EGFP阳性细胞上方，检查电阻是否正常。
   8. 当电极接触细胞时，施加少量负压，以在玻璃电极与细胞膜之间形成吉欧姆（GΩ）级密封。
   9. 通过短暂而迅速的吸力脉冲，击破细胞膜，使电极与细胞内含物接触。
   10. 将放大器模式切换至全细胞模式，并将贝塞尔滤波器和输出增益分别调至1–5 kHz和0.5α。
   11. 采用电压斜坡或无间隙记录模式，记录通道激动剂饱和浓度下的电流响应。
   12. 由于不同蛋白的表达效率存在差异，需采用不同的诱导时间重复记录。
3. 确定单通道记录的最佳诱导时间⁴。
   1. 配制电极内液（单位：mM）：150 Na-葡萄糖酸盐、15 NaCl、5 EGTA和10 HEPES，用NaOH调节pH至7.4。灌流液使用步骤6.2.1中的溶液。
   2. 重复全细胞操作，使用内径0.86 mm的玻璃电极，经火焰抛光至电阻为10–12 MΩ，并将钳制电位设为-40 mV。
   3. 按前述方法在膜上形成高阻封接，随后击破膜。
   4. 利用显微操作器将带有膜片的电极从细胞上提起。
   5. 将灌流系统紧邻含有膜片的电极放置。
   6. 将贝塞尔滤波器和输出增益分别调至2–5 kHz和10α。
   7. 向膜片灌流通道激动剂的饱和浓度，根据响应判断膜片是否包含单个或多个通道。
   8. 分析成功记录的单通道膜片数量与细胞诱导时间之间的关系，并根据所需结果调整诱导时间。

结果

为了快速构建一个可诱导表达模型，我们使用了表达四环素抑制蛋白（TR）的 HEK293 细胞（例如， T-REx-293）以及在CMV启动子与多克隆位点之间含有四环素操纵子序列（TetO）的载体例如， pcDNA4/TO）。当该质粒转染至TREx-293细胞中时，由于TR蛋白可结合TetO序列，目的基因的表达受到抑制。在培养基中加入多西环素可阻断TR与TetO的结合，从而启动目的蛋白的表达。为实现对大鼠TRPV1（rTRPV1）表达的调控，我们首先按照上述方案将该通道基因插入pcDNA4/TO载体中。随后，根据方案第3步的操作，将rTRPV1-pcDNA4/TO质粒转染至T-REx-293细胞。转染后，通过在培养体系中加入多西环素（1 μg/mL）孵育1–4小时，诱导rTRPV1的表达。值得注意的是，可通过调整多西环素浓度以获得所需的表达水平。我们采用电生理记录和钙成像技术，在不同时间点施加rTRPV1的激动剂辣椒素，以评估其表达水平。如图所示 图 1,<...

讨论

转染是一种广泛用于蛋白质表达与研究的实验方案，存在多种不同变体以提高表达的一致性与稳定性。瞬时转染试剂提供了一种简单、易于操作的流程，可在转染后的数小时至过夜时间内对目标细胞和目标蛋白质进行分析。然而，当分析方法需要稳定的蛋白质表达水平时，例如电生理学中的单通道记录，该方法可能表现出不可预测性。²或者，已开发出基于四环素可抑制表达系统的稳定细胞系，以提供一种调控目的蛋白表达水平的方法¹²该方法通过添加四环素类衍生物（如多西环素）作为补充剂，实现培养物中所有细胞的稳定表达。尽管这种方法能够对蛋白水平进行一致且精确的调控，但所需的时间和投入的精力也相应增加 建立稳定细胞系的过程在研究多种蛋白质时显得不便且具有劣势⁸.

本文介绍的实验方案为现有的转染方法提供了一种折中的解决方案。通过在含有四环素阻遏蛋白的细胞中，瞬时转染一个受可控启动子调控的基因，我们能够在避免繁琐复杂操作步骤的同时实现基因表达的精确控制。在此，我们以非选择性阳离子通道...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pcDNA™4/TO 哺乳动物表达载体	赛默飞世尔科技	V102020
pcDNA™5/TO 哺乳动物表达载体	赛默飞世尔科技	V103320
PureLink Quick PCR 纯化试剂盒	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro 温度循环仪	Esco	无可用信息
限制性内切酶	赛默飞世尔科技	ER0501
琼脂糖	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	赛默飞世尔科技	ND-2000C
T4 DNA连接酶	赛默飞世尔科技	EL0011
一次转化法® TOP10 化学感受态细胞 E. coli	赛默飞世尔科技	C404006
氨苄青霉素（钠），USP级	Gold Bio	A-301-5
微生物学用胰蛋白胨	默克	6.19305×10¹³
酵母提取物	BD 全球	212750
SIF6000R 恒温振荡器	实验伴侣	45H118
NucleoSpin®质粒	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V 电源供应器	主要科学领域	MP-300V
猫头鹰™ EasyCast™ B1A Mini胶电泳系统	赛默飞世尔科技	B1A
T-REx™-293细胞系	Invitrogen	R710-07
DMEM（1×），液体（高葡萄糖）	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® 缓冲液	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  哺乳动物表达载体	赛默飞世尔科技	V102520
胎牛血清（FBS），经鉴定，符合欧盟标准，南美洲来源	Gibco	10270106
HEPES缓冲液（1 M）	生物工业公司	03-025-1B
青霉素-链霉素溶液	生物工业公司	03-031-1B
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（稳定型谷氨酰胺）（200 mM）	生物工业公司	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	51026406
MSC-Advantage™ II级生物安全柜	赛默飞世尔科技	51025411
盐酸杀稻瘟菌素S	Sigma-Aldrich	15205-25MG
杜尔贝科’无氯化钙和氯化镁的改良型 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	Gibco	25300054
双Neubauer刻度金属化血细胞计数板	豪泽科学	31000
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 转染试剂	Mirus	MIR 2300
玻璃盖玻片，1号厚度，直径12 mm圆形	克尼特尔玻璃	GG-12
BioCoat™ 聚-D-赖氨酸（PDL）	康宁	354210
水，细胞培养级	生物工业公司	03-055-1A
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM 酯	Biotium	BTM-50034
泊洛沙姆® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-第8孔	ibidi	80826
(E)-辣椒素	Tocris	462
奥林巴斯IX70荧光显微镜	Olympus	无可用信息
Lambda DG-4 波长切换器	Sutter Instruments	无
EXi Blue 荧光显微镜相机	QImaging	无可用数据
MetaFluor 荧光比率成像软件	Molecular Devices	无
薄壁硼硅玻璃管	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
标准壁厚硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
无水二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	276855
P1000 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 显微操作仪	NARISHIGE	无可用信息
ValveBank 灌注系统	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A 低噪声数据采集系统	Molecular Devices	无可用信息
Axopatch 200B 放大器	Molecular Devices	无可用信息
pCLAMP 10.6 软件	Molecular Devices	无
显微操作仪	Sutter Instruments	MP-225