模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。
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本文内容
摘要
摘要
合适材料的可获得性受限 体外 能够可靠地模拟复杂人类大脑发育的模型是制约基础脑科学研究向临床应用转化的一个重要瓶颈。尽管诱导性多能干细胞（iPSCs）已取代存在伦理争议的人类胚胎干细胞，但基于iPSC的神经元分化研究仍主要停留在细胞水平的描述性阶段，未能充分提供源自复杂三维人类脑组织的详细信息。
如今，通过应用源自诱导多能干细胞（iPSC）的三维脑类器官——“培养皿中的大脑”——填补了这一空白，这类模型能够模拟复杂人类大脑发育的多种特征。本文介绍了一种生成源自诱导多能干细胞的三维脑类器官的方法。这些类器官有助于建模常染色体隐性原发性小头畸形（MCPH），这是一种罕见的人类神经发育障碍疾病。目前广泛接受的关于MCPH患者脑部畸形的解释是，在人类大脑发育早期阶段神经干细胞池耗竭所致，而这一发育缺陷在体外极难重现或证实in vitro。
为了研究小头畸形症（MCPH），我们利用携带中心体蛋白CPAP基因突变的患者成纤维细胞生成了诱导多能干细胞（iPSCs）。通过分析小头畸形3D脑类器官的脑室区，我们揭示了神经前体细胞的过早分化。这些3D脑类器官是一种强大的体外（in vitro）研究系统，在模拟由神经毒性化学物质、神经营养性病毒感染或遗传性基因突变引起的先天性脑部疾病方面将发挥关键作用。
引言
由于人类大脑具有扩展的皮层表面，这一特征不同于非人类动物，因此诸如小头症等人类神经发育障碍在动物模型中难以得到充分研究。
这一特点使得人类大脑发育成为一个复杂的过程，无法在二维条件下得到充分研究， 体外 细胞培养系统。新兴的3D培养技术能够利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成类似组织的类器官。 体外 多能干细胞在三维悬浮培养中的分化能够以时间和区域特异性的方式形成多种细胞类型，进而发育为结构有序、分层的组织1,2,3感谢那些率先开发三维培养技术并揭示了从干细胞出发的器官形成复杂性的实验室，我们由此建立了一种可靠的方法来生成脑类器官，以阐明人类大脑发育的早期事件，并建立小头畸形的模型 体外1,2,3值得注意的是，我们对 Lancaster 开发的原始方法进行了改进 等 生成脑类器官1该方法根据我们的实验需求进行了修改。
Gabriel....
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方案
1. 脑类器官的生成（23 天）
- 神经外胚层启动（5天）
注意：在开始分化之前，应考虑以下几点。重编程方法（基于慢病毒、基于仙台病毒、基于附加体或基于微小RNA） 等等。) 获得人iPSCs时，理想情况下所有患者和对照iPSC系应使用相同的重编程方法。目前已有多种基于已发表方案的重编程试剂盒及相关操作说明可供使用15,16,17,18人类iPSC细胞系的质量是实现最佳分化的关键。使用显微镜监测克隆和细胞形态，并通过检测Oct3/4、Nanog或TRA-1-60等标志物的表达来验证其多能性。- 在涂有Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质的培养皿中，使用培养基A在无饲养层条件下培养人iPSCs。
注意：以无饲养层、无血清条件培养人iPSCs，以维持明确的培养环境，并避免在启动分化前额外去除小鼠胚胎成纤维饲养层细胞（MEFs）的步骤。人iPSCs启动分化时的最佳传代次数范围为重编程后的第15代至总计第70代。传代时，使用适当的细胞解离溶液，结合低机械应力操作和2 mL血清学移液管，将hiPSC克隆以细胞团聚体形式从原培养皿转移至新培养皿。....
- 在涂有Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质的培养皿中，使用培养基A在无饲养层条件下培养人iPSCs。
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结果
脑类器官的生成需要至少三周的连续培养（图1A）。为了获得可重复的结果，我们建议研究人员记录每一步操作，并且重要的是，避免对培养基成分、时间节点和细胞操作进行任何改动。在此，我们概述了如何评估关键里程碑是否达成，以确保在实验结束时获得足够质量的类器官。在96孔板中神经球的形成应从第4天起清晰可见。神经球可被识别为每个孔底部界限清晰的球状结构（图1B，步骤1）。
第5天时，神经球的直径应约为500 µm，表面光滑，具有围绕暗色中心的明亮边缘。在此明亮边缘内可能已可观察到类似神经玫瑰花环样的延伸结构（图1C，步骤2的起始阶段）。如果神经球发生解体或更类似于细胞团块，则不应继续进行分化。最后，在旋转烧瓶中的分化过程中，类器官应逐渐增大并表现出相似的大小（图1D，步骤3）。更多信息请参见故障排除表（Table 1.......
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讨论
小头畸形症是一种复杂的人类神经发育障碍，无法在动物模型中重现 体内 或在简单的人类细胞培养方法中 体外MCPH 的临床表现在妊娠第一孕期即开始显现，此时早期神经发生启动。因此，三维脑类器官是模拟 MCPH 发育过程的可靠实验体系。此外，三维人脑类器官是一种理想的研究方法，因为：i）可适应具有不同遗传背景的多种患者样本；ii）能够形成包含多种神经细胞类型的组织结构；更重要的是，iii）可呈现神经发育过程中多个分化阶段的特征 体外 方法与它们相关联的 体内 对应物25,26,27. 例如，神经玫瑰花结是与发育中的神经管相对应的结构。
兰开斯特 等 与对照组iPSCs相比，使用了两倍数量的患者iPSCs才能成功生成患者类器官。值得注意的是，通过改进现有方法并采用本方案所述流程，我们能够从相同数量的.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由弗里茨·蒂森基金会（Az.10.14.2.152）资助。我们感谢CMMC组织包埋平台和显微镜核心设施提供的支持。我们感谢中心体与细胞骨架生物学实验室成员在讨论和技术方面给予的支持。我们感谢李明贵对稿件的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | 山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B 兔多克隆抗体 |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；多个供应商 |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | 化合物 C；多个供应商 |
| 包埋介质 | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol；包埋介质；多个供应商 |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 基质 | Corning | 354277 | Matrigel hESC 认证基质；重要：必须为 hESC 认证级别 |
| 鱼明胶 | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | 来自冷水鱼皮的明胶；多个供应商；加入 PBS 后高压灭菌以溶解并灭菌，4 °C 保存 |
| 甘氨酸 | AppliChem | A1067,1000 | 分子生物学级甘氨酸；多个供应商 |
| 一次性接种环带针（1 µL） | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | 多个供应商 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | 多个供应商 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco, US | 25030081 | L-谷氨酰胺（200 mM） |
| 培养基 A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1（hiPSC 培养基） |
| 培养基 B | Stem cell technologies | #05835 | 神经诱导培养基（NIM）；神经分化培养基 |
| 培养基 C | Gibco, US | 21103049 | 神经基础培养基 |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓缩） |
| MycoAlert 支原体检测试剂盒 | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | 支原体检测试剂盒；多个供应商 |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin 小鼠单克隆抗体（4D11） |
| 多聚甲醛（PFA） | AppliChem | A3813, 0500 | PBS 中 4%，溶液保存于 -20 °C；注意：佩戴皮肤和眼部防护装备，并在通风橱中操作 |
| PBS 片剂 | Gibco, US | 18912014 | 参见制造商´说明；多个供应商 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco, US | 15140122 | 多个供应商 |
| 聚-L-赖氨酸溶液（PLL） | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | 多个供应商 |
| pVim | MBL | D076-3S | 磷酸化波形蛋白（Ser55）单克隆抗体 |
| 试剂 A | Stem cell technologies | # 05872 | 参见方案 1.1.1.2 注释；ReLSR（无酶人 ES 和 iPS 细胞筛选与传代试剂）；请遵循制造商´操作说明；多个供应商提供替代产品 |
| 试剂 B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase 溶液是一种用于单细胞解离的酶解溶液；多个供应商；方案 1.1.2 中的“酶解细胞解离溶液”"” |
| Leica CM3050 S 研究型冷冻切片机 | Leica biosystems | CM3050 S | 多个供应商 |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | 多个供应商 |
| 250 mL 摇瓶 | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| 蔗糖 | AppliChem | A4734, 1000 | 多个供应商 |
| Superfrost 超级加号载玻片 | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | 载玻片应标有“"+"”符号且为正电荷 |
| 添加剂 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 添加剂（100 倍浓缩） |
| 添加剂 2（不含维生素 A） | Gibco, US | 12587010 | B-27 添加剂（50 倍浓缩），不含维生素 A；多个供应商 |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | 多个供应商 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura, NL | 4583 | 多个供应商 |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | 多个供应商 |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-微管蛋白 III（兔多克隆） |
| TUNEL 检测试剂盒 | Promega, US | G3250 | DeadEnd 荧光 TUNEL 检测系统；多个供应商 |
| 分子生物学级 Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | 多个供应商 |
| 防水膜 | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”；多个供应商 |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK 抑制剂（Y-27632 2HCL）；多个供应商 |
| β-巯基乙醇 | Gibco, US | 31350010 | 2-巯基乙醇（50 mM）；多个供应商 |
参考文献
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
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重印与许可
