此处，我们介绍一种用于可视化血管形成的实验方案 体内 通过多光子显微镜在三维支架中实时观察。在转基因支架中的血管生成研究采用小鼠颅骨临界骨缺损模型。治疗组中检测到的新血管数量多于对照组。
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摘要
摘要
大段骨缺损的修复仍然是一个严峻的临床难题，原因在于组织工程支架在修复过程中血管生成能力较差，导致血液供应不足，进而引起新生组织坏死。快速血管化是新生组织存活并与宿主原有组织整合的关键前提。 从头合成 在支架中生成血管结构是提高骨再生效率最关键的步骤之一，可使修复组织生长进入支架内部。为解决这一问题，常采用对生物材料支架进行遗传修饰的方法，以加速血管生成和成骨过程。然而，其可视化与追踪 体内 在实时和三维（3D）支架或新生骨组织中观察血管形成仍是骨组织工程领域的一大挑战。多光子显微成像技术（MPM）是一种新型生物成像方法，能够以高分辨率和最小侵入性的方式获取生物结构的三维体积数据。本研究旨在利用多光子显微成像技术可视化血管生成过程 体内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架。PLGA/nHAp支架经功能化处理，可实现生长因子的持续递送 pdgf-b 携带基因的慢病毒载体（LV-pdgfb）以促进血管生成并增强骨再生。在颅骨临界骨缺损小鼠模型中植入支架后，PHp支架中的血管面积（BVAs）显著高于PH支架。此外，相关基因的表达水平 pdgf-b 以及血管生成相关基因， vWF 和 VEGFR2，相应增加。MicroCT 分析表明，与其余各组相比，PHp 组的新骨形成显著改善。据我们所知，这是首次在骨组织工程中应用多光子显微镜技术，用于研究三维可生物降解支架中的血管生成。 体内 并实时地。
引言
骨是一种高度血管化的组织，在个体一生中持续进行重塑1。由创伤、骨不连、肿瘤切除或颅面畸形导致的大段骨缺损的快速有效再生是一个复杂的生理过程。用于骨缺损修复的传统治疗方法包括自体移植和同种异体移植，但这些方法存在多种问题和局限性，例如供体来源有限、供区并发症显著、感染风险高以及宿主免疫排斥反应2,3。然而，人工骨移植物为克服这些局限性提供了有效的替代方案。人工骨移植物可由可生物降解材料制成，易于制备成具有合适孔径的结构，并可进行基因修饰4,5。
目前，多种组织工程支架已应用于组织工程骨的构建6,7。为了更有效地诱导骨修复与再生，结合生长因子的工程化生物材料应运而生，并取得了良好效果8,9。然而，生长因子的半衰期短、易失活以及为达到治疗效果所需的超生理剂量，限制了其临床应用10。为克服这些问题，递送生长因子基因而非生长因子本身，已被证明是维持生物活性、治疗骨缺损及相关疾病的有效策略11,12。由于具有高效的表达能力，病毒载体已成为组织再生领域中颇具前景的递送工具13。
在多种生长因子中，本研究选择了血小板源性生长因子（PDGF-BB），因为它不仅是间充质细胞和成骨细胞的有丝分裂原和趋化因子，还能促进血管生成14,15既往的临床前和临床研究显示，PDGF-BB 可安全有效地促进牙周骨缺损的骨组织修复16,17近期研究表明，PDGF-BB 通过促进内皮细胞迁移和增殖来刺激血管生成 体内18,19此外，PDGF-BB 还可使间充质干细胞（MSCs）具备向内皮细胞分化的潜能。20，这进一步凸显了间充质干细胞在新生血管形成中的潜在作用。因此，诱导间充质干细胞 从头合成 在骨组织工程中，含有PDGF-BB的支架内血管形成是修复支架内生长组织的重要步骤。
骨缺损修复是一个动态的组织形态发生过程，需要在修复部位协调成骨作用与血管生成21。新生血管长入植入的组织工程支架是为细胞提供营养和氧气以支持其生长与存活，并清除代谢废物的必要前提。目前常用于获取血管生成信息的成像方法包括X射线显微计算机断层扫描（microCT）、磁共振成像（MRI）、扫描电子显微镜（SEM）、光学相干断层扫描（OCT）和共聚焦激光扫描显微镜，这些方法可替代组织学检查22,23。然而，这些技术在可视化和测量骨组织工程中三维支架内新生血管结构方面仍面临多种挑战。多光子显微成像技术（MPM）是一种相对较新的生物成像技术，具有同时在活体条件下可视化细胞、细胞外基质及周围血管网络的独特优势。in vivo。该技术具备固有的三维成像能力，可实现深层组织穿透，且光损伤较低。因此，在过去十年中，MPM在生物医学研究中受到广泛关注24，已应用于神经科学、免疫学和干细胞动态等领域，但在骨科研究中的应用仍极为有限。
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方案
动物护理符合广东省《实验动物护理和使用指南》的要求。所有操作均在中华人民共和国科学院深圳先进技术研究院动物研究伦理委员会的监督和批准下进行。
1. 慢病毒（LV）的制备
- 使用 Spe I 和 Sal I 限制性酶切位点，将 pdgf-b cDNA 克隆至慢病毒表达载体（pLenti6/5-eGFP 或 LV-eGFP）中巨细胞病毒启动子下游的自定义多克隆位点，构建 pLenti6/5-PDGFB-eGFP 质粒（LV-pdgfb）25。
- 通过标准氯化钙法，将病毒包装质粒（pLP1、pLP2 和 pVSV-G）与 HEK-293FT 细胞共转染，并加入氯喹（终浓度：25 µM），以产生慢病毒颗粒（LV-pdgfb）25。
- 转染 48 小时后，收集并用滤膜（0.45 µm）过滤 500 mL 含病毒的上清液；随后在 89,000 × g 条件下超速离心 2 小时以浓缩病毒颗粒。用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，分装后于 -80 °C 保存。
- 为测定慢病毒滴度，将 HEK293T 细胞与系列稀释的慢病毒溶液孵育 24 小时，并按照先前所述方法计算慢病毒滴度25。
2. 3D打印PLGA/nHAp支架的制备及LV固定化
- 将20 g PLGA（聚D,L-乳酸-乙醇酸共聚物）材料溶解于20 mL 1,4-二氧六环中，形成均一溶液。向该溶液中加入2 g纳米级HAp（纳米羟基磷灰石）粉末（nHAp），PLGA与nHAp的质量比应为10:1（w/w）。
- 使用磁力搅拌器在室温下剧烈搅拌混合溶液（搅拌速度：1,500 rpm）16小时，形成均匀糊状物。利用计算机控制喷嘴的3D低温打印机，根据预设模型自下而上逐层沉积该糊状物，制备多孔PLGA/nHAp支架26；支架的孔径范围为200至400 µm。
- 将支架进行真空冷冻干燥48小时，尽可能完全去除溶剂。将支架浸泡于75%乙醇溶液中1小时以灭菌，随后冻干，获得中性无菌支架。
注意：真空冷冻干燥的主要参数包括冷凝温度（°C）和真空度（Pa）。在真空度为45 Pa的条件下，将PLGA/nHAp支架在-78 °C下真空冷冻干燥48小时，以彻底去除溶剂。 - 向每个PLGA/nHAp支架（4 mm × 4 mm × 2 mm）中加入10 µL LV颗粒（4.5 × 105），在37 °C湿润培养箱中孵育2小时，使颗粒充分吸附。
- 固定完成后，用PBS冲洗支架两次，以去除未结合的LV颗粒。将负载LV颗粒的支架在液氮中速冻，再次冻干后于-80 °C保存，以备后续使用。
3. 体外 支架中慢病毒颗粒释放动力学及慢病毒转导活性检测
- 将携带LV-绿色荧光蛋白（LV-eGFP，4.5 × 105 LV颗粒）的3D支架（4 mm × 4 mm × 2 mm）置于2.0 mL冻存管中，加入1 mL完全DMEM培养基，在37 °C条件下振荡孵育5天。
- 从孵育后12 h开始，每隔12 h取样1 mL，直至120 h，并更换培养基。每个时间点均加入1 mL新鲜培养基，替代1 mL原有孵育培养基。
- 使用收集的培养基与HEK293T细胞共孵育48 h以进行转导。通过流式细胞术测定GFP阳性HEK293T细胞数量，从而测定具有生物活性的LV颗粒数量27。
- 转导HEK293T细胞前，弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次。将含有从支架释放的慢病毒的收集培养基加入孔中（1 mL/孔），在37 °C、湿润培养箱中与HEK293T细胞共同培养48 h。
4. 体外 骨髓来源间充质干细胞（BMSC）迁移能力评估
- 迁移实验前，制备表达番茄荧光蛋白的骨髓间充质干细胞（BMSCs-T）和表达PDGF-BB蛋白的骨髓间充质干细胞（BMSCs-P）28。
- 使用24孔板和孔径为8 µm的聚碳酸酯滤膜，通过Boyden小室进行骨髓间充质干细胞迁移实验。
- 在上室中加入0.5 mL转染了表达番茄荧光蛋白的慢病毒（LV）的BMSCs（5 × 104）；在下室中加入0.5 mL转染了表达PDGF-BB蛋白的慢病毒（LV）的BMSCs（2 × 105）。
- 本实验设六个组，每孔下室加入500 µL处理液。
A. 空白对照组，仅含无血清培养基
B. FBS对照组，培养基中添加10% FBS
C. PDGF-BB对照组，无血清培养基中含4 ng/mL PDGF-BB
D. PDGF-BB阻断组，无血清培养基中含PDGF-BB（4 ng/mL）和抗PDGF-BB多克隆抗体（4 ng/mL）
E. BMSC组，无血清培养基中含2 × 105个BMSCs
F. BMSCs-P组，无血清培养基中含2 × 105个BMSCs-P。 - 在含5% CO2、37 °C的湿化培养箱中孵育48小时。随后，收集下室侧迁移的细胞，并通过流式细胞术定量分析BMSCs-T的数量。
- 使用细胞刮刀收集下室侧迁移的细胞，用2 mL PBS重悬，通过流式细胞术定量迁移的BMSCs-T数量29。
5. 小鼠颅骨临界骨缺损模型的建立与支架移植
注意：雄性 BALB/c 小鼠（7 周龄）购自中国广东医学实验动物中心（广东，中国）。
- 总共选取42只雄性小鼠进行颅骨缺损实验。将小鼠随机分为三组，每组14只，分别接受以下处理：A组，无植入物；B组，植入PH支架（PLGA/nHAp）；C组，植入PHp支架（PLGA/nHAp/LV-pdgfb).
- 用戊巴比妥钠（50 mg/kg）经腹腔注射麻醉动物。使用脱毛膏去除毛发，并在首次切口前用75%酒精溶液清洁头部皮肤。使用立体定位仪固定每只小鼠的头部，以确保手术过程中头部保持静止。
- 使用手术刀做初始切口，然后用剪刀扩大切口，形成一个1厘米长的直线皮肤切口。用无菌棉签刮除颅骨骨膜，暴露颅骨表面。
- 使用环钻在颅骨左侧制造一个直径为4 mm的临界尺寸缺损30将支架移植到骨缺损部位。
注意：临界尺寸缺损（CSDs）最初被定义为 "特定动物物种的某块骨骼中，在该动物寿命期间无法自行愈合的最小骨内伤口尺寸。" 在本实验中，4 mm直径的缺损属于临界尺寸骨缺损，依据先前的研究31,32. - 使用眼科镊子轻轻将骨膜复位以覆盖手术区域。每厘米切口皮肤缝合三针。
- 进行术后护理。给予镇痛剂布托啡诺（0.1 mg/kg）以缓解疼痛。使用加热垫维持动物体温，直至动物苏醒。随后，每天提供食物和水，并记录动物活动情况，直至实验结束。注意：根据当地动物护理委员会的指导原则，镇痛处理可在手术前给予。
6. 体内 利用多光子显微镜对骨缺损内血管生成进行成像
注意：根据之前的一项研究33，将生理盐水中含有的FITC标记的250 kD葡聚糖（10 mg/mL）静脉注射至小鼠体内，以获得高信噪比（signal-to-noise ratio）的新血管图像。 请注意，这是一项可存活手术操作。
- 组装用于双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波生成信号（SHG）成像的多光子显微系统。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对动物进行麻醉，并将其固定在加热板上，以在整个实验过程中维持体温在37 °C。在成像过程中，使用100%氧气中含3.0%的异氟烷气体以维持充分的麻醉和镇痛效果。成像前，通过腹腔注射生理盐水（200 µL/只）以防止脱水。
- 将飞秒钛宝石激光器调至860 nm。通过扫描一对检流计镜创建512 × 512 µm的采样区域，并使用NA1.0的水浸物镜将激发光束聚焦到样品中，同时收集背向散射的TPEF/SHG信号。
注：成像在自行搭建的多光子显微成像系统（MPM）上进行。成像过程中，将飞秒钛宝石激光器调至860 nm作为最佳激发波长。激光束通过一对检流计镜在样品平面上进行光栅扫描。光束经685 nm的二向色镜反射后，由20倍NA1.0物镜聚焦至样品。诱导产生的TPEF和SHG信号由同一物镜收集，再通过上述二向色镜与激发激光分离，并经680 nm短通滤光片净化。TPEF和SHG信号由光纤束收集并导入光谱仪。光谱仪上的探测器为线阵光电倍增管（PMT）。光谱仪与线阵PMT的组合可同时记录16个连续光谱波段（从400 nm到600 nm，间隔12.5 nm）的信号。因此，TPEF和SHG信号可同时被检测并在光谱域中分离。此外，为实现三维成像，使用轴向电机控制成像深度。每幅图像的面积设为512 × 512 µm，深度间隔设为2 µm（对照组为5 µm）。值得注意的是，每个缺损区域需扫描5个位点以获取具有统计学意义的数据，所选成像位点沿缺损区域均匀且随机分布。 - 在每个缺损区域扫描5个位点，以获取具有统计学意义的数据，用于评估血管形成情况。
- 沿缺损区域均匀且随机分布扫描位点。对于对照组，视野（FOV）应覆盖原始骨组织区域及缺损边缘；而对于PH和PHp组，视野应位于植入的支架上。
- 使用手术刀做1 cm的线性皮肤切口，并将切开的皮肤缝合固定，以暴露移植部位。使用注射器在浸入式物镜与移植组织之间滴加一滴水，形成水镜。
- 在2小时的成像期间，每隔12秒采集一次图像序列。使用自定义的MATLAB程序显示和分析三维数据，并利用ImageJ软件对血管面积进行定量分析34,35。
7. 通过RT-qPCR分析pdgf-b及血管生成相关基因的表达
注意：PCR 按照常规步骤进行：95 °C 预变性 30 秒，然后进行 40 个循环（95 °C 变性 5 秒，60 °C 退火延伸 30 秒）。PCR 结束后通过熔解曲线分析确认扩增产物的特异性，目标基因相对于 β-actin 的表达倍数变化被确定。每个样本的反应均重复检测三次。
- 在术后2、4和8周时，从实验小鼠体内收获植入的支架和组织36；对照组样本（n = 4）应在相同时间点取自邻近的骨组织。
注意：在每个时间点（2、4和8周），通过吸入CO2处死小鼠。解剖颅骨，随后从颅骨中取出并收获植入的支架。 - 根据制造商说明书，使用商用试剂从每个样本中提取总RNA。按照制造商说明书，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。
- 使用SYBR Green检测系统进行定量实时PCR；引物序列见表1。
| 引物 (5'–3') | |||||||
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 | |||||
| pdgfb | CATCCGCTCCTTTGATGATCTT | GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT | |||||
| vWF | CTCTTTGGGGACGACTTCATC | TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC | |||||
| VEGFR2 | GAAATGACACTGGAGCCTACA AG | TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G | |||||
| β-actin | GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG | GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT | |||||
表1：引物序列。
8. 骨再生的MicroCT分析
- 术后8周，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死。在通风良好的环境中，将每只小鼠轻轻放入洁净的小鼠笼中，向笼内通入CO2气体，使小鼠在安乐死前先被麻醉。
- 解剖颅骨，用于骨缺损区域的显微CT成像。实验中使用以下扫描参数：9 µm分辨率，Al 0.5 mm滤光片，50 kV电压，142 µA电流。
- 使用公司提供的商业软件对所有成像数据进行重建。利用CTAn软件的校准功能对扫描图像进行校准。
注意：每次扫描时，应在小鼠下方放置一个亨氏单位（HU）校准参照物。
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结果
制备了高度为 0.6 mm、直径为 4 mm 的圆柱形多孔 PLGA/nHAp 支架，并使用 3D 打印机制成。通过扫描电子显微镜和显微CT分析支架的形貌。图1A展示了植入支架的照片。显微CT扫描显示，超过85%的孔径尺寸在200至400 µm之间（图1B）。SEM图像表明，支架表面具有粗糙的微结构，表面存在微孔（直径约5–10 µm），并在支架内部相互连通（图1D–F）。从PLGA/nHAp支架释放的包被LV-eGFP颗粒总量中约有40%（4.5 × 105）在24小时内表现出初始突释效应。释放出的LV病毒生物活性在24小时达到峰值，随后持续下降，并在120小时时接近零（图2）。这些数据表明，大多数固定在支架上的LV颗粒的生物活性可维持长达96小时。采用FACS方法观察MSCs-T的迁移能力，以研究携带pdgf-b cDNA的LV是否能够表达并诱导BMSC趋化，结果如图3
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讨论
骨是一种高度血管化的组织，具有在个体一生中持续愈合和重塑的独特能力1。血管化程度对于成骨及缺损修复至关重要。低血管化限制了组织工程骨的广泛应用。根据仿生学理论构建高度血管化的组织工程骨，已成为修复大段骨缺损的有效手段。多种类型的支架材料已成功用于修复相对较小的骨缺损。然而，对于临界骨缺损，支架材料的应用仍面临挑战，主要原因是缺损修复过程中血液供应不足。因此，在修复大段骨缺损过程中改善血液供应，是组织工程领域的主要难题之一。
人们使用生物活性材料包被的支架来帮助建立必要的形态发生场，以刺激、募集并促进新生血管和骨形成所需细胞的趋化、分化和增殖37组织工程支架中的新生血管对于细胞获取氧气和营养物质、清除代谢废物，以及最终实现支架功能至关重要。本研究旨在探讨血管生成 体内 在基因修饰的3D打印PLGA/nHAp支架中应用双光子显微镜研究颅骨临界骨缺损修复，并利用显微CT评估骨再生效果
尽管在骨组织工程领域已取得显著进展，...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由以下项目资助：中国深圳孔雀计划（编号：110811003586331）、深圳市基础研究计划（编号：JCYJ20150401150223631、编号：JCYJ20150401145529020 和编号：JCYJ20160331190714896）、广东省公益研究与能力建设计划专项（编号：2015A020212030）、国家自然科学基金（编号：81501893）、国家重点基础研究发展计划（2013CB945503）以及中科院深圳先进技术研究院优秀青年人才创新项目（Y5G010）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G 比例 75:25，分子量 66000-107000 |
| 羟基磷灰石纳米颗粒 | Sigma | 702153 | 平均直径 < 200 nm |
| 磷酸氯喹二盐 | Sigma | C6628 | |
| FITC 标记的 250-kD 右旋糖酐 | Sigma | FD250S | |
| 1,4-二氧六环 | lingfeng,上海 | 0.45 微米 | |
| Stericup 滤器 | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB cDNA | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| 抗 PDGF-BB 小鼠多克隆抗体 | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB 重组蛋白 | 4489-50 | ||
| 磷酸钙转染溶液 | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| 青霉素-链霉素，液体 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 雄性 BALB/c 小鼠 | 广东省医学实验动物中心 | ||
| 戊巴比妥钠 | Merck | 1063180500 | |
| 多光子显微镜 | 由中国深圳先进技术研究院自制，用于检测双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波生成信号（SHG）。 | ||
| 异氟烷 | Keyuan，山东 | 401750169 | |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix（完美实时） | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus） | Takara | RR036B | |
| 苏木精和伊红 | Beyotime | C0105 | |
| 石蜡 | Leica | RM2235 | |
| 超速离心机 Optima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| 低温打印机 | 清华大学 | 由清华大学自制 | |
| LightCycler 480 仪器 | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| 商业软件 | Bruker | ||
| 丁丙诺啡 |
参考文献
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