通过多光子显微镜观察血管生成 在体 内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架

摘要

此处，我们介绍一种用于可视化血管形成的实验方案 体内 通过多光子显微镜在三维支架中实时观察。在转基因支架中的血管生成研究采用小鼠颅骨临界骨缺损模型。治疗组中检测到的新血管数量多于对照组。

摘要

大段骨缺损的修复仍然是一个严峻的临床难题，原因在于组织工程支架在修复过程中血管生成能力较差，导致血液供应不足，进而引起新生组织坏死。快速血管化是新生组织存活并与宿主原有组织整合的关键前提。 从头合成 在支架中生成血管结构是提高骨再生效率最关键的步骤之一，可使修复组织生长进入支架内部。为解决这一问题，常采用对生物材料支架进行遗传修饰的方法，以加速血管生成和成骨过程。然而，其可视化与追踪 体内 在实时和三维（3D）支架或新生骨组织中观察血管形成仍是骨组织工程领域的一大挑战。多光子显微成像技术（MPM）是一种新型生物成像方法，能够以高分辨率和最小侵入性的方式获取生物结构的三维体积数据。本研究旨在利用多光子显微成像技术可视化血管生成过程 体内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架。PLGA/nHAp支架经功能化处理，可实现生长因子的持续递送 pdgf-b 携带基因的慢病毒载体（LV-pdgfb）以促进血管生成并增强骨再生。在颅骨临界骨缺损小鼠模型中植入支架后，PHp支架中的血管面积（BVAs）显著高于PH支架。此外，相关基因的表达水平 pdgf-b 以及血管生成相关基因， vWF 和 VEGFR2，相应增加。MicroCT 分析表明，与其余各组相比，PHp 组的新骨形成显著改善。据我们所知，这是首次在骨组织工程中应用多光子显微镜技术，用于研究三维可生物降解支架中的血管生成。 体内 并实时地。

引言

骨是一种高度血管化的组织，在个体一生中持续进行重塑¹。由创伤、骨不连、肿瘤切除或颅面畸形导致的大段骨缺损的快速有效再生是一个复杂的生理过程。用于骨缺损修复的传统治疗方法包括自体移植和同种异体移植，但这些方法存在多种问题和局限性，例如供体来源有限、供区并发症显著、感染风险高以及宿主免疫排斥反应^2,3。然而，人工骨移植物为克服这些局限性提供了有效的替代方案。人工骨移植物可由可生物降解材料制成，易于制备成具有合适孔径的结构，并可进行基因修饰^4,5。

目前，多种组织工程支架已应用于组织工程骨的构建^6,7。为了更有效地诱导骨修复与再生，结合生长因子的工程化生物材料应运而生，并取得了良好效果^8,9。然而，生长因子的半衰期短、易失活以及为达到治疗效果所需的超生理剂量，限制了其临床应用¹⁰。为克服这些问题，递送生长因子基因而非生长因子....

方案

动物护理符合广东省《实验动物护理和使用指南》的要求。所有操作均在中华人民共和国科学院深圳先进技术研究院动物研究伦理委员会的监督和批准下进行。

1. 慢病毒（LV）的制备

1. 使用 Spe I 和 Sal I 限制性酶切位点，将 pdgf-b cDNA 克隆至慢病毒表达载体（pLenti6/5-eGFP 或 LV-eGFP）中巨细胞病毒启动子下游的自定义多克隆位点，构建 pLenti6/5-PDGFB-eGFP 质粒（LV-pdgfb）²⁵。
2. 通过标准氯化钙法，将病毒包装质粒（pLP1、pLP2 和 pVSV-G）与 HEK-293FT 细胞共转染，并加入氯喹（终浓度：25 µM），以产生慢病毒颗粒（LV-pdgfb）²⁵。
3. 转染 48 小时后，收集并用滤膜（0.45 µm）过滤 500 mL 含病毒的上清液；随后在 89,000 × g 条件下超速离心 2 小时以浓缩病毒颗粒。用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，分装后于 -80 °C 保存。
4. 为测定慢病毒滴度，将 HEK293T 细胞与系列稀释的慢病毒溶液孵育 24 小时，并按照先前所述方法计算慢病毒滴度²⁵。

结果

采用 3D 打印机制备了高度为 0.6 mm、直径为 4 mm 的圆柱形多孔 PLGA/nHAp 支架。通过扫描电子显微镜和微计算机断层扫描（microCT）分析支架的形貌。图 1A 显示了植入支架的照片。微计算机断层扫描结果显示，超过 85% 的孔径尺寸在 200 至 400 µm 范围内（图 1B）。扫描电镜图像显示，支架表面具有粗糙的微结构，表面存在微孔（直径约 5–10 µm），并在支架内部相互连通（图 1D–F）。包被在 PLGA/nHAp 支架上的 LV-eGFP 颗粒总量（4.5 × 10⁵）中，约有 40% 在 24 小时内以初始突释效应开始释放。释放的慢病毒生物活性在 24 小时达到峰值，随后持续下降，并在 120 小时接近零（图 2）。这些数据表明，大多数固定在支架上的慢病毒颗粒的生物活性可维持长达 96 小时。采用 FACS 方法观察 MSCs-T 的迁移能力，以研究携带 pdgf-b<.......

讨论

骨是一种高度血管化的组织，具有在个体一生中持续愈合和重塑的独特能力¹。血管化程度对于成骨及缺损修复至关重要。低血管化限制了组织工程骨的广泛应用。根据仿生学理论构建高度血管化的组织工程骨，已成为修复大段骨缺损的有效手段。多种类型的支架材料已成功用于修复相对较小的骨缺损。然而，对于临界骨缺损，支架材料的应用仍面临挑战，主要原因是缺损修复过程中血液供应不足。因此，在修复大段骨缺损过程中改善血液供应，是组织工程领域的主要难题之一。

人们使用生物活性材料包被的支架来帮助建立必要的形态发生场，以刺激、募集并促进新生血管和骨形成所需细胞的趋化、分化和增殖³⁷组织工程支架中的新生血管对于细胞获取氧气和营养物质、清除代谢废物，以及最终实现支架功能至关重要。本研究旨在探讨血管生成 体内 在基因修饰的3D打印PLGA/nHAp支架中应用双光子显微镜研究颅骨临界骨缺损修复，并利用显微CT评估骨再生效果

尽管在骨组织工程领域已取得显著进展，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)	Sigma	P1941	L/G 比例 75:25，分子量 66000-107000
羟基磷灰石纳米颗粒	Sigma	702153	平均直径 < 200 nm
磷酸氯喹二盐	Sigma	C6628
FITC 标记的 250-kD 右旋糖酐	Sigma	FD250S
1,4-二氧六环	lingfeng,上海		0.45 微米
Stericup 滤器	Merck Millipore Corporation	SLHV033RB
PDGF-BB cDNA	Sino Biological, Inc	MZ50801-G
抗 PDGF-BB 小鼠多克隆抗体	BioVision, Inc	5489-30T
PDGF-BB 重组蛋白		4489-50
磷酸钙转染溶液	Promega Corporation	E1200
L-DMEM	Hyclone	SH30021.01
DPBS	Hyclone	SH30028.01
青霉素-链霉素，液体	Thermo Fisher Scientific	15140122
FBS	Thermo Fisher Scientific	10099-141
Transwell	Corning	3422
雄性 BALB/c 小鼠	广东省医学实验动物中心
戊巴比妥钠	Merck	1063180500
多光子显微镜			由中国深圳先进技术研究院自制，用于检测双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波生成信号（SHG）。
异氟烷	Keyuan，山东	401750169
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596018
PrimeScript RT Master Mix（完美实时）	Takara	RR420B
SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）	Takara	RR036B
苏木精和伊红	Beyotime	C0105
石蜡	Leica	RM2235
超速离心机 Optima L-100XP	Beckman Coulter	L-100XP
低温打印机	清华大学		由清华大学自制
LightCycler 480 仪器	Roche	5815916001
microCT	Bruker	1176
商业软件	Bruker
丁丙诺啡