方法文章

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人血脑屏障模型

DOI：

10.3791/55390

⸱

2017年4月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的迁移 体外.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

淋巴细胞向中枢神经系统（CNS）的外渗对于免疫监视至关重要。与疾病相关的淋巴细胞外渗改变可能导致中枢神经系统的病理生理变化。因此，研究淋巴细胞向中枢神经系统的迁移对于理解炎症性中枢神经系统疾病以及开发新的治疗策略具有重要意义。本文介绍了一种 体外 人血脑屏障模型用于研究淋巴细胞外渗。人脑微血管内皮细胞（HBMEC）在多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯Transwell小室上融合生长，以模拟血脑屏障的内皮层。屏障功能通过闭合蛋白免疫组织化学染色、跨内皮电阻（TEER）测量以及伊文思蓝渗透分析进行验证。该模型可用于研究罕见淋巴细胞亚群（如CD56）的穿内皮迁移过程。明亮的CD16dim/- 自然杀伤细胞。此外，还可研究其他细胞、细胞因子和趋化因子、疾病相关改变以及不同治疗方案对淋巴细胞迁移能力的影响。最后，可分析炎症刺激以及不同治疗方案对内皮屏障的影响。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

淋巴细胞从血液迁移至组织对于免疫监视至关重要。一系列特定的分子相互作用确保了淋巴细胞向小肠、皮肤、淋巴结、中枢神经系统（CNS）及其他组织的特异性外渗1。淋巴细胞迁移的异常参与了多种广泛性疾病的发生发展机制2。进入免疫豁免部位中枢神经系统的过程受到严格调控，因此该过程的改变与脑脊髓炎3、视神经脊髓炎、脑卒中和多发性硬化症（MS）等中枢神经系统相关疾病密切相关2,4,5,6,7。因此，研究淋巴细胞外渗对于深入理解疾病的发病机制以及开发减轻疾病负担的干预手段具有重要意义8,9,10,11,12。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的细胞培养

  1. 细胞培养瓶的包被
    1. 配制纤连蛋白溶液：向一个15 mL离心管中加入10 mL PBS，再加入150 µL纤连蛋白，充分混匀。
    2. 在T-25细胞培养瓶底部加入2 mL纤连蛋白溶液，以覆盖瓶底。将细胞培养瓶置于37 °C培养箱中孵育至少3小时。纤连蛋白包被的培养瓶可在37 °C、5% CO₂条件下保存2周。2.
  2. HBMEC的接种与细胞培养
    1. 吸出细胞培养瓶底部的纤连蛋白溶液。加入 7.2 x 104 以6 mL ECM-b培养基（即添加5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%内皮细胞生长补充剂的ECM-b）悬浮HBMEC/cm²。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2每天使用显微镜检查细胞生长情况。
    2. 每3天更换一次培养基。当HBMEC细胞融合度达到约80%时进行收获或传代。为避免生理特性丧失，HBMEC应在第1至第15代之间使用。
  3. 收获 HBMEC。
    1. 通过将accutase（1x）与PBS按1:1比例混合配制accutase溶液。将accutase溶液置于37 °C水浴中保温，待用。
    2. 将ECM-b培养基从细胞培养瓶转移至15 mL离心管中。向细胞培养瓶底部加入5 mL PB....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代表性结果展示利用人血脑屏障模型进行的NK细胞和T细胞亚群的跨膜迁移图1A) 显示。通过紧密连接分子ZO-1染色、跨内皮电阻（TEER）测量以及伊文思蓝渗透实验验证HBMEC单层的完整性。图1B）。经过3-4天培养后，HBMEC表达了紧密连接分子ZO-1（图1B，左侧）。此外，HBMEC 以单层形式生长，表现出跨内皮电阻（图1B 中段）以及伊文思蓝的通透性降低（图1B，右侧）。利用HBMEC单层研究NK细胞（包括CD56）的跨内皮迁移明亮的CD16dim/- 和 CD56暗淡CD16+ NK细胞亚群及包括CD4在内的T细胞+ 和 CD8+ T细胞作为两个例子（图1D+E分别）。迁移细胞的百分比通过流式细胞术获得的细胞计数计算，并使用流式计数荧.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种研究淋巴细胞跨人血脑屏障迁移的技术。体外分析淋巴细胞向中枢神经系统迁移对于研究淋巴细胞渗出的基本过程、潜在的疾病相关改变以及新的治疗策略具有重要意义。

血脑屏障模型有多种可能的改进方式。例如，可分析上室中的细胞，以研究未迁移细胞群体的组成。此外，可在检测前24小时用IFN-γ和TNF-α处理HBMEC单层细胞，以模拟炎症状态下的血脑屏障，从而研究炎症性中枢神经系统疾病的影响。21,25类似地，使用其他物质处理HBMEC或淋巴细胞可用来研究这些物质对淋巴细胞渗出的影响（例如 它们对黏附分子的影响30,31可使用整合素或其配体的阻断抗体来研究某些黏附分子的参与情况32此外，本文所述的实验装置可用于分析趋化因子或星形胶质细胞及其他细胞来源的上清液所产生的趋化效.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明本文的研究、撰写和/或发表存在以下潜在利益冲突：A.S.-M. 和 U.B. 无任何财务披露。T. S.-H. 收到了来自百健（Biogen）的差旅和会议费用。N.S. 收到了来自百健（Biogen）和诺华制药（Novartis Pharma）的演讲酬金和顾问委员会酬金，以及来自百健（Biogen）的差旅费用。H.W. 因担任拜耳医疗（Bayer Healthcare）、百健（Biogen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）的科学顾问委员会/指导委员会成员而获得报酬。此外，他还从拜耳维塔尔有限公司（Bayer Vital GmbH）、拜耳先灵制药（Bayer Schering AG）、百健（Biogen）、CSL 贝林（CSL Behring）、费森尤斯医疗（Fresenius Medical Care）、葛兰素史克（Glaxo Smith Kline）、GW 制药（GW Pharmaceuticals）、灵北制药（Lundbeck）、默克雪兰诺（Merck Serono）、Omniamed、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）获得演讲酬金和差旅资助。他作为百健（Biogen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）的顾问获得了酬金。H.W. 还获得了来自拜耳维塔尔（Bayer Vital）、百健（Biogen）、健赞（Genzyme）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）、赛诺菲-安万特德国公司（Sanofi-Aventis Germany）和赛诺菲美国公司（Sanofi US）的研究资助。C.C.G. 因参加健赞（Genzyme）、诺华制药有限公司（Novartis Pharma GmbH）和拜耳医药保健（Bayer Health Care）的会议并发表演讲，获得了演讲酬金和差旅费用。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由合作研究中心CRC TR128“多发性硬化症中的启动/效应与调节机制——迈向攻克疾病”（项目A9资助H.W.和C.C.G.，项目B1资助N.S.）提供支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBSGibco14190-094不含 CaCl2 或 MgCl2
纤连蛋白 1 mg/mLSigmaF1141-5MG来源于牛血浆
T-25 细胞培养瓶Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
青霉素/链霉素ScienCell1001-b
内皮细胞生长补充剂ScienCell1001-b
TranswellCorning3472透明，直径 6.5 mm，孔径 3.0 µm
96 孔平底板Corning3596
伊文思蓝SigmaE2129-10G储存液：1 g/50 mL PBS
B27Gibco17504-04450 倍浓缩
Infinite M200ProTecan
96 孔黑色平底板Greiner BioOne675086
48 孔板Corning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Flow Count FluorospheresBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10 色流式细胞仪Beckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-αPeprotech300-01A
IFN-γPeprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430克隆号 UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692克隆号 N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330克隆号 3G8
CD4-FITCBiolegend300506克隆号 RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332克隆号 B9.11

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-1....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CD56bright CD16dim NK

相关文章