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方法文章

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

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DOI：

10.3791/55390

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2017年4月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

此处，我们描述了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的跨膜迁移 体外.

摘要

淋巴细胞向中枢神经系统（CNS）的外渗对于免疫监视至关重要。与疾病相关的淋巴细胞外渗改变可能导致中枢神经系统的病理生理变化。因此，研究淋巴细胞向中枢神经系统的迁移对于理解炎症性中枢神经系统疾病以及开发新的治疗策略具有重要意义。本文介绍了一种 体外 人血脑屏障模型用于研究淋巴细胞外渗。人脑微血管内皮细胞（HBMEC）在多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯Transwell小室上融合生长，以模拟血脑屏障的内皮层。屏障功能通过闭合蛋白免疫组织化学、跨内皮电阻（TEER）测量以及伊文思蓝渗透分析进行验证。该模型可用于研究罕见淋巴细胞亚群（如CD56）的穿内皮迁移。明亮CD16dim/- 自然杀伤细胞。此外，还可研究其他细胞、细胞因子和趋化因子、疾病相关改变以及不同治疗方案对淋巴细胞迁移能力的影响。最后，可分析炎症刺激以及不同治疗方案对内皮屏障的影响。

引言

淋巴细胞从血液迁移至组织对于免疫监视至关重要。一系列特定的分子相互作用确保了淋巴细胞向小肠、皮肤、淋巴结、中枢神经系统（CNS）及其他组织的特定位点外渗1。淋巴细胞迁移的异常参与了多种广泛性疾病的发生发展机制2。向免疫豁免的中枢神经系统迁移受到严格调控，因此该过程的改变与脑脊髓炎3、视神经脊髓炎、脑卒中和多发性硬化症（MS）等中枢神经系统相关疾病密切相关2,4,5,6,7。因此，研究淋巴细胞外渗过程对于深入理解疾病的发病机制以及开发减轻疾病负担的干预手段具有重要意义8,9,10,11,12。

淋巴细胞通过不同的途径迁移进入中枢神经系统。已有研究描述了淋巴细胞通过脉络丛内的血-脑脊液屏障，经由后微静脉渗出至蛛网膜下腔，以及穿越血脑屏障的过程1,13,14,15。淋巴细胞穿越血脑屏障的过程依赖于其与内皮细胞的相互作用14。与外周组织中的内皮细胞不同，中枢神经系统内的内皮细胞表达大量紧密连接分子，从而严格限制了能够穿越血脑屏障的细胞和蛋白质的数量16。炎症可导致紧密连接松动，并诱导黏附分子的表达，从而促进淋巴细胞向中枢神经系统的迁移1,17,18。

通过血脑屏障的外渗是一个多步骤过程。淋巴细胞首先与内皮细胞发生黏附，随后主要在选择素介导下沿内皮表面滚动1,15随后，内皮细胞分泌的趋化因子与淋巴细胞表面相应趋化因子受体之间的相互作用诱导整合素发生构象改变，从而促进淋巴细胞与内皮细胞的牢固黏附。1最后，淋巴细胞要么沿着内皮屏障逆血流方向爬行，随后迁移至血管周围间隙，要么在牢固黏附的部位立即停滞并直接迁移。1,19,20所有这些淋巴细胞外渗步骤均可进行分析 体外 采用不同的技术21时间推移视频显微镜用于研究初始的黏附和滚动过程15黏附实验可提供关于细胞牢固黏附于内皮屏障的详细信息22迁移实验（Transmigration assays）如本演示所示，可用于分析免疫细胞的迁移过程21,23,24,25,26,27,28,29.

使用人类 体外 血脑屏障模型，我们最近研究表明，CD56 具有更强的迁移能力明亮CD16dim/- 与CD56相比的NK细胞暗度CD16+ 其对应部分在鞘内腔室中以该NK细胞亚群占主导地位为特征21因此，我们的实验装置似乎适合用于模拟 体内 情况

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方案

1. 人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的细胞培养

  1. 细胞培养瓶的包被
    1. 为制备纤连蛋白溶液，向一个15 mL离心管中加入10 mL PBS。加入 150 µL 纤连蛋白并充分混匀。
    2. 在T-25细胞培养瓶底部加入2 mL纤连蛋白溶液以覆盖瓶底。将细胞培养瓶于3 h以上孵育 37 °C 在培养箱中。纤连蛋白包被的培养瓶可在 37 °C / 5% CO₂2.
  2. HBMEC的接种与细胞培养
    1. 吸弃细胞培养瓶底部的纤连蛋白溶液。加入 7.2 x 104 每平方厘米 HBMEC 细胞悬于 6 mL ECM-b 培养基中（即 ECM-b 添加 5% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素和 1% 内皮细胞生长补充物）。于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 37 °C / 5% CO₂2每天使用显微镜检查细胞生长情况。
    2. 每3天更换一次培养基。当HBMEC细胞达到约80%融合度时进行传代或收获。为避免生理特性的丧失，HBMEC应在第1至第15代之间使用。
  3. 收获 HBMEC。
    1. 通过将accutase（1x）与PBS按1:1比例混合，配制accutase溶液。将accutase溶液置于 37 °C 置于水浴中直至进一步使用。
    2. 将ECM-b培养基从细胞培养瓶转移至15 mL离心管中。向细胞培养瓶底部加入5 mL PBS洗涤HBMEC细胞。吸除PBS，重复洗涤步骤两次。
    3. 加入2 mL预热的accutase溶液，于37°C孵育 37 °C 2 分钟后，通过轻轻敲击细胞培养瓶数次使 HBMEC 重新悬浮。使用显微镜观察细胞脱落情况
    4. 先前储存在15 mL离心管中的ECM-b培养基，在HBMEC细胞开始脱落时立即加回至细胞培养瓶中。反复冲洗瓶底，直至大部分HBMEC细胞重新悬浮。
    5. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中。在室温下以300 x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL ECM-b培养基中。计数细胞，并稀释细胞悬液以获得3 x 10⁶个细胞/mL的最终浓度。5 每毫升 ECM-b 培养基中含 HBMEC。

2. 细胞培养小室的制备

  1. 细胞培养小室的包被
    重要提示：避免触碰细胞培养小室的膜。
    1. 向每个细胞培养小室（图1A）以及96孔平底板中的一个孔（光学对照孔）加入100 µL纤连蛋白溶液（见1.1.1）。在37 °C下孵育至少3小时。孵育后吸除纤连蛋白溶液。
    2. 向细胞培养小室及光学对照孔中加入100 µL HBMEC悬液。向细胞培养小室的下室加入600 µL ECM-b培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育3–4天，直至形成屏障完整性（图1B），通过显微镜观察光学对照孔中HBMEC的生长情况来评估细胞生长。注意：不建议细胞培养超过四天。
    3. 可选步骤：为模拟炎症条件，在迁移实验前24小时，吸除下室培养基，并更换为添加了500 U/mL IFN-γ/TNF-α的ECM-b培养基。

3. 转移实验当天使用伊文思蓝进行质量控制

  1. 伊文思蓝溶液的制备
    1. 使用15 mL离心管，将10 mL PBS与200 µL B27添加剂混合，配制PBS/B27溶液。用PBS/B27将伊文思蓝储备液（20 mg/mL PBS）按1:1,000稀释。
  2. 伊文思蓝通透性实验
    1. 吸取含有融合人脑微血管内皮细胞（HBMEC）单层的一次性细胞培养小室下室中的培养基，随后吸取上室中的培养基。向上室中加入100 µL伊文思蓝溶液。
    2. 向下室中加入600 µL PBS/B27，并在37 °C / 5% CO2条件下孵育60分钟。用镊子小心取出细胞培养小室。
  3. 伊文思蓝检测
    1. 从下室中移除PBS/B27，并将各100 µL转移至黑色聚苯乙烯96孔平底板的两个孔中。将该板插入Tecan Infinite M200 Pro酶标仪，确定最佳z轴位置。
    2. 使用相应参数测定伊文思蓝的激发光信号（例如：激发波长：620 nm，发射波长：680 nm，激发带宽：9 nm，发射带宽：20 nm，增益：175倍，闪光次数：25次，积分时间：20 µs）。
    3. 为评估HBMEC屏障功能，将所获得的数据与标准曲线进行比较，该曲线显示细胞接种后不同时间点伊文思蓝穿过HBMEC的情况（图1B，右图）。

4. 迁移实验

  1. 外周血单个核细胞（PBMC）的制备
    1. 向一个15 mL离心管中加入10 mL RPMI 200 µL B27 添加剂。计数 PBMC 并在 300 × g 离心 5 分钟。将 PBMC 重悬至终浓度为 5 × 106 细胞/mL RPMI/B27
  2. 迁移实验的建立
    1. 从含有融合的 HBMEC 单层细胞的细胞培养小室的下室开始，吸出培养基，然后吸出上室的培养基。图1A。每位供体添加 100 µL 将PBMC悬液分别加入细胞培养小室以及每24孔板的一个孔中体外 对照组
    2. 添加 600 µL 将RPMI/B27加入细胞培养插件的下室 500 µL 到PBMC的 体外 对照并孵育 6 小时于 37 °C / 5% CO₂2.
  3. 收获迁移的PBMC
    1. 使用镊子取出细胞培养小室，并用缓冲液小心冲洗底部 400 µL 用 PBS 冲洗，避免接触膜。弃去细胞培养小室。
    2. 添加 20 µL 流式计数荧光微球（约1,000个微球/µL)加入细胞培养小室的下室以及 体外 对照并充分混匀。取1 mL所得PBMC悬液转移至流式细胞术管中。

5. 流式细胞术

  1. 样品制备
    1. 将PBMC在室温下以300 × g离心5分钟。
    2. 通过将荧光染料偶联的抗体加入到 100 µL 流式细胞术缓冲液（PBS/1% BSA/2 mM EDTA）每样本。以下展示的结果 1 µL CD4-FITC, 1 µLCD3-PerCP/Cy5.5 1 µL CD56-PC7, 1 µL CD8-A700，以及 1 µL 每份样品使用 CD16-A750。
    3. 重悬 PBMC 于 100 µL 抗体溶液中孵育30分钟 4 °C.
    4. 添加 250 µL 流式细胞术缓冲液，300 × g 离心 5 分钟。
  2. 样本采集
    1. 将PBMC重悬于所需体积的流式细胞术缓冲液中（体积因所用流式细胞仪而异）。
    2. 使用流式细胞仪在525至700 nm波长范围内具有活性检测器的条件下获取染色后的PBMC，以检测流式计数荧光微球（激发波长488 nm，发射波长525 - 700 nm）。
      （以下步骤以使用配备 Kaluza G 软件的 Gallios 流式细胞仪为例：（1）启动计算机。（2）操作系统完全加载后，按下“打开细胞仪”按钮以启动流式细胞仪。（3）按下“打开方案”按钮，加载相应的采集方案。（4）选择所需方案并点击“打开”。（5）在虚拟转盘中显示的方案上单击鼠标右键，然后左键单击“复制”字段，为每个样本复制该方案。（6）在样本列表中标记每个样本。（7）将样本放置于转盘的指定位置，并开始采集。）
  3. 样品分析
    1. 使用相应软件打开流式细胞术数据结果。确定已迁移的外周血单个核细胞（PBMC）以及来自 体外 使用相应的分析软件对对照孔和流式计数荧光微球进行分析。
      （结果部分给出了一个设门策略的示例（图1 C：为了分析NK细胞亚群的迁移，首先在侧向散射通道（SSC）与前向散射通道（FSC）图中圈选淋巴细胞。随后在CD3与CD56图中显示淋巴细胞，并显示CD56+CD3- NK细胞被选出。为了区分NK细胞亚群，将NK细胞在CD56与CD16图中显示，并分析CD56明亮CD16dim/- 以及 CD56暗淡CD16+ 选择NK细胞。此外，从FSC与SSC图中选取流式计数荧光微球，随后在发射波长介于525至700 nm的通道与时间的关系图中显示，以确定其数量。
    2. 为计算各样本的总细胞数，使用流式计数荧光微球对检测到的细胞数量进行归一化：
      细胞定量公式；使用流式细胞术和荧光微球参照的细胞计数方程
    3. 以迁移细胞总数与细胞总数的比值计算迁移细胞百分比 体外 对照

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结果

使用人血脑屏障模型显示NK细胞和T细胞亚群跨膜迁移的代表性结果（图1A) 显示。通过紧密连接分子 ZO-1 染色、跨内皮电阻（TEER）测量以及伊文思蓝渗透实验，验证了 HBMEC 单层的完整性。图1B）。经过 3 - 4 天培养后，HBMEC 表达了紧密连接分子 ZO-1（图1B，左侧）。此外，HBMEC 以单层形式生长，表现出跨内皮电阻（图1B 中段）以及伊文思蓝的通透性降低（图1B，右图）。利用HBMEC单层细胞研究NK细胞（包括CD56）的跨膜迁移明亮CD16dim/- 和 CD56暗淡CD16+ NK细胞亚群和T细胞，包括CD4+ 和 CD8+ T细胞作为两个例子（图 1D+E分别）。迁移细胞的百分比根据流式细胞术获得的细胞计数计算...

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讨论

本文介绍了一种研究淋巴细胞跨人血脑屏障迁移的技术。体外分析淋巴细胞向中枢神经系统迁移对于研究淋巴细胞渗出的基本过程、潜在的疾病相关改变以及新的治疗策略具有重要意义。

血脑屏障模型有多种可能的改进方式。例如，可分析上室中的细胞，以研究未迁移细胞群体的组成。此外，可在检测前24小时用IFN-γ和TNF-α处理HBMEC单层细胞，以模拟炎症状态下的血脑屏障，从而研究炎症性中枢神经系统疾病的影响。21,25类似地，使用其他物质处理HBMEC或淋巴细胞，可用来研究这些物质对淋巴细胞渗出的影响（例如 它们对黏附分子的影响30,31可使用整合素或其配体的阻断抗体来研究某些黏附分子的参与情况32此外，本文所述的实验装置可用于分析趋化因子或星形胶质细胞及其他细胞来源的上清液所产生的趋化...

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披露

作者声明本文的研究、撰写和/或发表存在以下潜在利益冲突：A.S.-M. 和 U.B. 无任何财务披露。T. S.-H. 收到了来自百健（Biogen）的差旅和会议费用。N.S. 收到了来自百健（Biogen）和诺华制药（Novartis Pharma）的演讲费和咨询委员会酬金，以及来自百健（Biogen）的差旅费用。H.W. 因担任拜耳医疗（Bayer Healthcare）、百健（Biogen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）的科学顾问委员会/指导委员会成员而获得报酬。此外，他还从拜耳维塔尔有限公司（Bayer Vital GmbH）、拜耳先灵制药（Bayer Schering AG）、百健（Biogen）、CSL 贝林（CSL Behring）、费森尤斯医疗（Fresenius Medical Care）、葛兰素史克（Glaxo Smith Kline）、GW 制药（GW Pharmaceuticals）、灵北制药（Lundbeck）、默克雪兰诺（Merck Serono）、Omniamed、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）获得演讲酬金及差旅资助。他作为百健（Biogen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）和赛诺菲-健赞（Sanofi-Genzyme）的顾问也获得了报酬。H.W. 还获得了来自拜耳维塔尔（Bayer Vital）、百健（Biogen）、健赞（Genzyme）、默克雪兰诺（Merck Serono）、诺华（Novartis）、赛诺菲-安万特德国公司（Sanofi-Aventis Germany）和赛诺菲美国公司（Sanofi US）的研究资助。C.C.G. 因参加健赞（Genzyme）、诺华制药有限公司（Novartis Pharma GmbH）和拜耳医药保健（Bayer Health Care）的会议而获得演讲酬金和差旅费用。

致谢

本研究得到了合作研究中心CRC TR128“多发性硬化症中的启动/效应与调节机制——迈向攻克疾病”（项目A9资助H.W.和C.C.G.，项目B1资助N.S.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBSGibco14190-094不含 CaCl2 或 MgCl2
纤连蛋白 1 mg/mLSigmaF1141-5MG来源于牛血浆
T-25 细胞培养瓶Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
青霉素/链霉素ScienCell1001-b
内皮细胞生长补充剂ScienCell1001-b
TranswellCorning3472透明，直径 6.5 mm，孔径 3.0 µm
96 孔平底板Corning3596
伊文思蓝SigmaE2129-10G储存液：1 g/50 mL PBS
B27Gibco17504-04450 倍浓缩
Infinite M200ProTecan
96 孔黑色平底板Greiner BioOne675086
48 孔板Corning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Flow Count FluorospheresBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10 色流式细胞仪Beckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-αPeprotech300-01A
IFN-γPeprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430克隆号 UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692克隆号 N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330克隆号 3G8
CD4-FITCBiolegend300506克隆号 RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332克隆号 B9.11

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