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方法文章

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

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DOI：

10.3791/55406

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2017年5月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

本文内容

摘要

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。

摘要

随着对疾病机制理解及生物标志物发现的需求日益增长，需要分析大量的生物样本。能够同时检测多个样本的定量蛋白质组学策略已得到广泛应用，显著降低了实验成本和时间。本实验室开发了一种名为前体同位素标记与等重标记联用（combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging, cPILOT）的技术，该技术增强了传统同位素标记或等重标记方法的样本多重分析能力。全局cPILOT可应用于来源于细胞、组织、体液或完整生物体的样本，并提供不同样本条件下蛋白质相对丰度的信息。cPILOT的工作原理包括两个步骤：1）在低pH缓冲条件下选择性地对肽段N端进行二甲基化；2）在高pH缓冲条件下使用商业化的等重试剂对赖氨酸残基的伯胺进行标记（见材料/试剂表）。可用的样本多重分析程度取决于所使用的前体标记种类和等重标记试剂的类型。本文展示了一种12重分析方法，结合轻型和重型二甲基化标记与六重等重试剂，用于在单次分析中检测来自小鼠组织的12个样本。增强的多重分析能力不仅有助于减少实验时间和成本，更重要的是，能够在多个样本条件（如生物学重复、疾病阶段、药物处理、基因型或纵向时间点）之间进行比较，从而降低实验偏差和误差。在本研究中，采用全局cPILOT方法分析了阿尔茨海默病小鼠模型和野生型对照组的脑、心脏和肝脏组织在生物学重复间的差异。全局cPILOT还可用于研究其他生物学过程，并可进一步优化以实现超过20个样本的多重分析。

引言

蛋白质组学通常涉及对大量样本的分析，以更深入地理解疾病过程、酶动力学、翻译后修饰、对环境刺激的响应、对治疗干预的响应、生物标志物的发现或药物作用机制。可采用定量方法来测量不同样本间蛋白质水平的相对差异，这些方法可以是无标记的，也可以涉及同位素标记（代谢标记、化学标记或酶法标记）。稳定同位素标记方法因其能够同时分析多个样本，并适用于来自不同细胞、组织、体液或完整生物体的样本，而日益受到青睐。同位素标记方法1,2,3,4,5,6,7能够提高实验通量，同时减少数据采集时间、成本和实验误差。这些方法利用前体离子质谱图，通过肽段峰来测量蛋白质的相对丰度。相比之下，等压标记试剂8,9,10会产生报告离子，这些报告离子在MS/MS或MS3 11质谱图中被检测，其峰强度用于反映蛋白质的相对丰度。

目前蛋白质组学多重分析的最高水平为10重检测12 或12重等压标签分析13. 增强的样本多重检测即 >10个样本）的方法已由我们实验室针对组织开发14,15,16,17以及其他研究人员用于细胞分析的方法18,19,20组织 21或靶向肽22我们开发了一种增强型多重分析技术，称为结合前体同位素标记与等重标记（combined precursor isotopic labeling with isobaric tagging, cPILOT）。全局cPILOT可用于获取不同样本条件（≥12）下所有蛋白质相对浓度的信息。14. 图1 展示了一般的cPILOT工作流程。在低pH条件下，胰蛋白酶或Lys-C肽段的N端通过二甲基化被选择性标记2 并在高pH条件下使用6重plex试剂标记赖氨酸残基。该策略使可分析样本数量增加一倍，从而降低使用等重试剂的实验成本，同时减少实验步骤和时间。

cPILOT 具有良好的灵活性，我们已开发出其他方法用于研究氧化型翻译后修饰，包括3-硝基酪氨酸修饰的蛋白质14以及含S-亚硝基化半胱氨酸的肽段（oxcyscPILOT）23。我们还建立了一种氨基酸选择性方法——半胱氨酸cPILOT（cyscPILOT）17。采用MS3扫描模式结合前导离子（top-ion）11或选择性y1-离子方法15，有助于减少报告离子干扰，提高cPILOT定量的准确性。在采集方法中使用MS3需要配备Orbitrap质量分析器的高分辨率仪器，尽管低分辨率的离子阱仪器也可能适用24。

此前，cPILOT 已被用于研究阿尔茨海默病小鼠模型的肝脏蛋白质16。本文中，我们描述了如何利用脑、心和肝组织匀浆进行全局 cPILOT 分析，以研究外周系统在阿尔茨海默病中的作用。该实验包含生物学重复。由于 cPILOT 具有广泛的适用性，感兴趣的用户可将其应用于其他组织，以研究多种生物学问题和系统。

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方案

伦理声明：小鼠购自一家独立的非营利性生物医学研究机构，并饲养于匹兹堡大学实验动物资源部。所有动物实验方案均经匹兹堡大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 蛋白质提取及用于化学标记的肽段制备

  1. 从组织、细胞或体液中提取蛋白质。
    1. 使用机械匀浆器将60–90 mg组织（例如脑、心脏和肝脏）在含8 M尿素的磷酸盐缓冲液（1× PBS）中匀浆（500 µL）。如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本项目中未使用此类抑制剂。匀浆参数如下：使用裂解基质A珠子，速度4 m/s，时间20 s。心脏组织可能需要最多9个匀浆循环。
      注意：如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本研究中未使用。
      1. 将组织匀浆液从裂解管中取出，转移至微量离心管中。用100–500 µL含8 M尿素的PBS冲洗裂解管，并将冲洗液与组织匀浆液合并。
    2. 将匀浆后的组织在9,447 × g、4 °C条件下离心15分钟，并收集上清液。
  2. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。
    注意：若蛋白质浓度过高，可能需要用缓冲液进一步稀释。本实验中这些组织样品的最终浓度介于6–13 µg/µL之间。
    1. 可选：加入内标质量控制标准品（例如牛α-酪蛋白或其他外源性蛋白质），比例为1 µg标准品 : 100 µg蛋白样品。

2. 样品消化

  1. 从每个样品中取100 µg（100 × 10-6 g）蛋白质，加入分别标记的微量离心管中。体积取决于蛋白质浓度（见步骤1.2）。
  2. 向每个样品中加入二硫苏糖醇（DTT）（试剂与样品的摩尔比为40:1）。在37 °C孵育2小时。摩尔比的计算基于牛血清白蛋白（BSA）的蛋白质分子量，即66.5 × 103 g/mol。
  3. 向每个样品中加入碘乙酰胺（IAM）（试剂与样品的摩尔比为80:1）。在冰上避光孵育2小时。此反应在冰上进行2小时，以防止副反应发生。
  4. 向每个样品中加入L-半胱氨酸（试剂与样品的摩尔比为40:1）。在室温下孵育30分钟。
  5. 加入含10 mM CaCl2 的20 mM Tris缓冲液（pH 8.2），将尿素稀释至终浓度为2 M。
  6. 向每个样品中加入经TPCK（L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）处理的胰蛋白酶（底物与酶的摩尔比为50:1），在37 °C孵育24小时。
  7. 通过将样品在液氮中快速冷冻以终止蛋白质消化反应，并在-80 °C保存，待后续处理。

3. 样品脱盐

  1. 通过加入甲酸（FA）重新酸化样品。加入足量甲酸，使最终浓度达到0.1%。如果样品原本保存在-80 °C，应在重新酸化前将样品置于冰上解冻。
  2. 使用C18亲水-疏水平衡（HLB）10 mg小柱对肽段进行脱盐，方法如前所述16。
  3. 通过真空离心（5 Torr，45 °C，77 × g）将样品干燥至体积约为10 µL。

4. 二甲基化标记（N-末端）

  1. 用高效液相色谱（HPLC）级或超纯水溶解的1%乙酸溶液（0.25 µg/µL）重悬多肽。取50 µg转移至新的微量离心管（1.5 mL）中，其余部分储存于-80 °C。
  2. 为进行轻或重二甲基标记，分别向样品中加入8 µL的60 mM（4%）CH2O（37% wt/v）或60 mM（4%）13CD2O（20% wt/v）。通常每25 µg多肽加入4 µL试剂（见步骤4.2、4.3、4.6）。
  3. 分别向经轻或重二甲基标记的样品中加入8 µL的24 mM NaBH3CN或24 mM NaBD3CN。
  4. 涡旋混匀，并在室温下于振荡器上震荡约10分钟。
  5. 加入16 µL的1%氨水（~28–30% v/v）反应5分钟以终止反应。通常每25 µg多肽加入8 µL试剂。
  6. 加入8 µL的5%甲酸（98% v/v）重新酸化反应体系。
  7. 合并轻链和重链二甲基化多肽（图1），共生成六个样品。本研究所用样品标记与混合策略详见表1。
  8. 按照步骤3.2和3.3进行样品脱盐处理。

5. 同重标记（赖氨酸残基）

  1. 将100 µg二甲基化肽段（1 µg/µL）溶解于100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液（pH ~8.5）中。
  2. 按照生产商说明书配制等重标记试剂（见材料/试剂表）。
  3. 向肽段中加入溶解后的等重标记试剂（41 µL），涡旋约10秒。在微型离心管振荡器上震荡样品约1小时。用8 µL羟胺（10% w/v）终止反应，并在室温下孵育15分钟。
  4. 将六个标记后的样品合并为单一混合物，并进行脱盐处理（步骤3.1–3.3），或于-80 °C保存以备后续使用。
    注意：为提高蛋白质组覆盖度和深度，建议采用多维分离策略，例如强阳离子交换（SCX）。

6. 强阳离子交换

  1. 按照制造商的说明书进行SCX（参见 材料表).
    1. 配制约 1 mL 的甲酸铵溶液（20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM、250 mM） & 500 mM) 加入10%乙腈（ACN）、0.1%甲酸（FA）（pH 3）
    2. 取下移液器吸头顶部的红色帽，轻敲装有填料浆液的移液器吸头，确保填料位于移液器吸头的底部。
      注意：关键步骤：在整个实验方案结束前，请勿丢弃移液器吸头。
    3. 将离心机适配器置于微型离心管（2 mL）顶部，并将移液器吸头固定于其中。
    4. 向移液器吸头中加入 150 µL SCX 重悬缓冲液。
    5. 将移液器吸头在室温下离心6分钟（4,000 × g）。重复此步骤两次，弃去废液。
    6. 将多肽溶解于150 µL的SCX复溶缓冲液中，确保pH为3。
    7. 将多肽加入移液器吸头中，离心（参见6.1.5），并保留洗脱液。
    8. 将滤膜和移液头转移至新的微量离心管（2 mL）中，加入150 µL 20 mM甲酸铵溶液。室温下离心6 min（4,000 × g），收集洗脱液。
    9. 重复步骤 6.1.8 七次，依次使用不同浓度（即 40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM、250 mM 和 500 mM 的甲酸铵
  2. 将八份SCX组分转移至微量离心管（1.5 mL）中，并通过离心浓缩法进行浓缩（参见步骤3.3）。

7. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和 MS3

  1. 用含0.1%甲酸（FA）的质谱级水溶解肽段，过滤后置于自动进样瓶中。按如下步骤过滤肽段：
    1. 将重悬的肽段加入含有0.65 µm滤膜的微量离心管中（见材料表）。
    2. 在12,000 × g下离心1分钟。移除滤膜并弃去，将滤过的肽段转移至自动进样瓶中。
  2. 按如下方法配制流动相缓冲液：含0.1% FA的3%（v/v）乙腈（A）和含0.1% FA的100%乙腈（B）。
  3. 将每份SCX分级样品各6 µL注入填充有C18材料（5 µm，200 Å孔径）至2 cm长度的捕获柱中。
    注：捕获柱上的样品清洗条件如下：0% B，3分钟；流速3 µL/min，使用二维液相色谱系统（见材料表）。
  4. 运行分析分离程序。使用内径75 µm、长度13.2 cm、激光拉制尖端的熔融石英毛细管柱，填充C18 材料（5 µm，100 Å）。梯度设置如下：0–5分钟，10% B；5–40分钟，10–15% B；40–90分钟，15–25% B；90–115分钟，25–30% B；115–130分钟，30–60% B；130–135分钟，60–80% B；135–145分钟，80% B；145–150分钟，80–10% B；150–180分钟，10% B；流速300 nL/min，总运行时间180分钟。
  5. 在运行分析分离程序的同时进行质谱仪的数据采集。
    注：MS一级扫描参数如下：质荷比（m/z）范围400–1,600，分辨率60,000，自动增益控制（AGC）目标值1 × 106离子，最大注入时间500 ms。CID–MS/MS参数如下：前1–7或前8–14个离子进行数据依赖性采集（DDA），隔离宽度3 m/z，最低信号强度500，归一化碰撞能量（NCE）35%，激活q值0.25，激活时间10 ms，AGC目标值3 × 104，最大注入时间50 ms。HCD–MS3 参数如下：最低信号强度200，隔离宽度4 m/z，NCE 60%，激活时间0.1，AGC目标值3 × 105，注入时间（IT）250 ms，MS/MS选择范围300–1,300 m/z，排除未碎裂的母离子。
  6. 对前1–7和前8–14的每次运行均进行双重复分析。
    注：对于在较新型号的Orbitrap或三合一质谱仪上运行的样品，DDA参数会有所不同，可优化以包含更多的MS/MS和MS3扫描。此外，对于三合一质谱仪，应采用同步前体选择（SPS）-MS3模式。

8. 数据分析16

  1. 使用蛋白质分析软件，针对适当数据库（如小鼠 Uniprot 数据库）搜索 RAW 文件。
    注意：为检测轻链和重链二甲基化肽段，需为每个 RAW 文件建立两个搜索流程。
  2. 使用以下参数搜索 RAW 文件：胰蛋白酶消化，允许两个漏切位点；肽段质量范围为 300–6,000 Da；母离子质量容差为 15 ppm，碎片离子质量容差为 1 Da。固定修饰：肽段 N 端轻链二甲基化（+28.031 Da）或重链二甲基化（+36.076 Da）、半胱氨酸羧氨甲基化（+57.021 Da, C）。
    注意：有时重链二甲基化峰的质量偏移约为 7 Da（+35.069 Da，肽段 N 端），源自轻链二甲基化峰，因此应在重链二甲基化肽段的搜索流程中纳入此质量偏移。动态修饰：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da, M）、6-plex 同重标记（229.163 Da, K）。包含反向数据库搜索以计算错误发现率（例如 1% 和 5%），并添加定量节点以提取同重标记的报告离子强度。
  3. 统计分析
    1. 将数据导出至电子表格程序，用于标准化蛋白质报告离子值。对每种蛋白质，将其报告离子比值的中位数或原始报告离子强度分别除以内标蛋白质的报告离子比值中位数或内标蛋白质的原始报告离子强度中位数。使用适当的统计软件（如电子表格程序、Perseus 或 R）分析不同样本条件之间的显著性差异。

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结果

cPILOT 采用基于胺的化学方法，在肽段的N端和赖氨酸残基上进行化学标记，从而增强样本多重检测能力。 图2 展示了来自阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组脑、心脏和肝脏组织的12重cPILOT分析所获得的代表性质谱数据。如图所示 表1在此12重分析中，包含了阿尔茨海默病小鼠和野生型小鼠的两个生物学重复。 图2A 显示一对双电荷峰，其间隔为 m/z 4 的间距表明肽段中引入了一个单二甲基化基团。该对中的轻链和重链二甲基化峰被分别独立地进行隔离，并通过 CID 碎裂。每种二甲基化肽段的 MS/MS 数据如图所示 图2B 和 C搜索结果显示，这对峰属于T(二甲基)ELNYFAK(同重标签)6) 蛋白质磷酸甘油酸激酶1的肽段。最强烈的碎片离子为 y3+ 其在轻链和重链二甲基化峰中表现相似。这些峰进一步被分离用于HCD-MS分析3 ...

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讨论

cPILOT 可实现对 12 个以上不同样本的同时检测。为确保肽段的 N 末端和赖氨酸残基均能成功标记，必须为每组反应设置合适的 pH 值，并优先进行肽段标记的二甲基化反应。通过将 pH 控制在约 2.5（±0.2），可实现对 N 末端的选择性二甲基化。该方法利用了赖氨酸侧链氨基与肽段 N 末端氨基 pKA 值的差异。在 pH 2.5 条件下，赖氨酸残基处于非活性状态（pKA ~10.5）；然而，若 pH 呈弱酸性（即 pH 5–7）或碱性，则 N 末端和赖氨酸残基均会被二甲基化。此外，若在低 pH 条件下先进行等重标记，则 N 末端将被等重标签标记，而赖氨酸残基则被二甲基化。这可能导致在 MS3 分析中可选的碎片离子减少，因为需要选择 b 离子。与商业化的等重试剂相比，二甲基化反应的成本相对较低。虽然每 100 µg 样本可使用一整瓶等重试剂，但我们此前已成功使用每 100 µg 样本仅用半瓶试剂，且标记效率相当。这显著降低了单次 cPILOT 实验的成本，使可分析的样本数量增加。还需注意，其他等重标记试剂也可替代本方案中使用的等重试剂，我们此前已有验证14<...

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致谢

作者感谢匹兹堡大学的启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）R01 资助（GM 117191-01）对 RASR 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水 - 质谱级Fisher ScientificW6-44 L 的量并非必需
乙腈 - 质谱级Fisher ScientificA955-44 L 的量并非必需
乙酸J.T. Baker9508-01
氨水溶液（28 - 30%）Sigma Aldrich320145-500ML
甲酸铵Acros Organics208-753-9
甲酸Fluka 分析94318-250ML-F
BCA蛋白检测试剂盒Pierce 赛默飞世尔科技23227
尿素伯乐（Bio-Rad）161-0731
Tris伯乐（Biorad）161-0716
二硫苏糖醇（DTT）Fisher ScientificBP172-5
碘乙酰胺（IAM）Acros Organics144-48-9
L-半胱氨酸Sigma Aldrich，化学168149-25G
经TPCK处理的牛胰蛋白酶Sigma Aldrich，生命科学T1426-100MG
甲醛（CH2O) 溶液；H 中含 36.5 - 38%2OSigma Aldrich，生命科学F8775-25ML
甲醛（13CD2O) 溶液；20 wt % 于 D2O，98 原子％ D，99 原子％ 13CSigma Aldrich，化学596388-1G
氰基硼氢化钠；试剂级，95%Sigma Aldrich156159-10G
氰基硼氘化钠；96 原子% D，98% 化学纯Sigma Aldrich，化学190020-1G
强阳离子交换（SCX）离心柱样品制备试剂盒Protea BioSciencesSP-155-24试剂盒
三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液Sigma Aldrich，生命科学T7408-100ML
等压标签试剂盒（TMT 6重标记）— 6次反应（1 × 0.8 mg）赛默飞世尔科技90061
盐酸羟胺Sigma Aldrich，化学255580-100G
标准涡旋混合器Fisher Scientific2215365任何混匀器均可使用
Oasis HLB 1 cc（10 mg）萃取小柱Waters186000383这些是 C18 盒式装置
Visiprep SPE 真空萃取装置，DL（一次性衬管），24 孔型号Sigma Aldrich5726512 端口型号也足够使用
Speed-vac赛默飞世尔科技SPD1010任何品牌的真空浓缩仪均可满足要求
水浴室赛默飞世尔科技2825/2826任何品牌的  温度可控的水浴装置即可满足要求。
机械匀浆器（即 FastPrep-24 5GMP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D 超高效液相色谱系统配备 Nano LC AS-2 自动进样器Sciex-此型号已不再提供。任何配备自动进样器的纳米液相色谱仪均可满足需求。
LTQ Orbitrap Velos 质谱仪赛默飞世尔科技-此型号已不再提供。其他高分辨率仪器（例如 Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos 均可使用。
蛋白质软件例如 Proteome Discoverer赛默飞世尔科技IQLAAEGABSFAKJMAUH 
分析天平Mettler ToledoAL54
磁力搅拌器VWR12365-382任何品牌的磁力搅拌器均可满足要求
pH计（Tris兼容）Fisher Scientific（Accumet）13-620-183任何品牌的pH计均可使用
pH 10 缓冲液Fisher Scientific06-664-261任何品牌的pH 10缓冲液均可满足要求
pH 7 缓冲液Fisher Scientific06-664-260任何品牌的pH 7缓冲液均可满足要求
1.5 mL 离心管，500 个/包Fisher Scientific05-408-129任何品牌的 1.5 mL 离心管均可使用
0.6 mL 离心管，500 个/包Fisher Scientific04-408-120任何品牌的 0.6 mL 离心管均可使用
0.65 µm Ultrafree MC DV 离心滤过装置EMD MilliporeUFC30DV00
2 mL 微量离心管，72 个单位赛默飞世尔科技69720
C18 填充材料（5 µ米，100 Å)BrukerPM5/61100/000此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足要求
C18 填充材料（5 µ米，200 Å)BrukerPM5/61200/000此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足需求

参考文献

  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

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