Method Article

增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

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1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

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合并前体同位素标记和等压标记（cPILOT）是定量蛋白质组学战略，增强同量异位标记的样品复用能力。这个协议描述cPILOT的对组织从阿尔茨海默氏病小鼠模型中和野生型对照的应用。

Abstract

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有日益增加的需求，分析了大量生物标本用于疾病的理解和生物标志物发现。定量蛋白质组学策略，允许多个样品的同时测量已经普及，大大降低实验成本和时间。我们实验室开发了一种称为合并的前体同位素标记和同量异位素标记（cPILOT）技术，这增强了传统的同位素标记或同量异位的标记方法中的样品的复用。全球cPILOT可以应用于从细胞，组织，体液，或整个生物体始发样品和给出了关于在不同的样品条件相对蛋白质丰度的信息。 cPILOT使用低pH值的缓冲液条件的工作方式是1），以选择性地dimethylate肽的N-末端，并使用高pH缓冲液条件2）标记的赖氨酸残基的伯胺与市售的同量异序的试剂（参见材料/试剂的表 ）。度可用的样本复用取决于所使用的前体的标签的数量和同量异序标记试剂。这里，我们提出使用轻和重的二甲基六-PLEX等压试剂组合以分析来自小鼠组织的12个样品在一次分析中一个12-PLEX分析。增强的复用是用于减少实验时间和成本，并且更重要的是，允许在许多样品条件（生物学重复，疾病阶段，药物治疗，基因型，或纵向的时间点）相比具有较少实验偏差和误差有帮助的。在这项工作中，全球cPILOT方法来分析大脑，心脏和跨越生物学重复肝组织从阿尔茨海默氏症小鼠模型和野生型对照。全球cPILOT可应用于研究其他生物过程和适于增加样本复用大于20个样本。

Introduction

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蛋白质组学通常涉及用于更好地了解疾病过程许多样品，酶动力学，翻译后修饰，响应于环境刺激，响应于治疗性治疗，生物标志物发现，或药物机制的分析。可以使用定量方法测量通过样品中的蛋白质水平的相对差异，并且可以是无标记的，或涉及同位素标记（代谢，化学或酶）。稳定同位素标记方法已越来越流行，因为它们允许多个样品同时分析，并且适用于从不同的细胞，组织，体液，或整个生物体的样本。同位素标记方法1，2，3，4，5，6，7增加实验的吞吐量，同时减少了采集时间，成本和实验误差。这些方法使用前体的质谱测量从肽峰的蛋白质的相对丰度。相反，同量异序标记试剂8，9，10生成在MS / MS或MS检测任一报告物离子3 11光谱和这些峰被用于对蛋白的....

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Protocol

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伦理声明:小鼠从一个独立的，非盈利性的生物医学研究机构购买和放置在实验室动物资源在匹兹堡大学的分部。所有动物方案都得到了机构动物护理和使用委员会在美国匹兹堡大学获得批准。

1.蛋白提取和多肽的产生化学标记

  1. 从组织，细胞，或体液中提取的蛋白质。
    1. 与使用机械均化器8M尿素（500μL）匀化60-90毫克在磷酸盐缓冲盐水组织（ 例如脑，心脏，和肝）（1×PBS）的。蛋白酶或磷酸酶抑制剂如果需要可加入到缓冲液中。在这个项目中，他们并没有使用。使用下面的参数用于均化器:裂解矩阵A珠，4米/秒，20秒。心脏组织可能需要均质化的多达9个周期。
      注:蛋白酶或磷酸酶抑制剂 S可以根据需要添加到缓冲器。他们不是在这项研究中使用。
      1. 从裂解管去除组织匀浆并转移到微离心管中。用PBS冲洗100-500μL裂解管有8M尿素和结合用组织匀浆的漂洗溶液。
    2. 离心匀浆组织（9447×g下，4℃，15分钟），并收集上清液。
  2. 确定使用根据制造商的说明二喹啉甲酸（BCA）测定蛋白质浓度。
    注意:如果蛋白质浓度太高进一步的稀释用缓冲液是必需的。将得到的浓度从这些组织样品在6-13微克/微升之间。
    1. 可选:添加一个内部质量控制标准（ 例如，....

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Results

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cPILOT使用基于胺的化学化学键在N-末端和赖氨酸残基的肽标签和增强样品复用能力。 图2示出了从从阿尔茨海默氏病小鼠模型中和野生型对照脑，心脏和肝组织中的12-plex的cPILOT分析所获得的代表性MS数据。如表1所示，对于阿尔茨海默氏病和野生型小鼠的两个生物学重复被包括在这12个复合体的分析。 图2A示出了一个双电荷峰值对由指示单个二甲基被并入肽4 M / Z间距隔开。两者的光并且在该对重二甲基化的峰是独立分离和零散与CID。对于每个二甲基化的肽的MS / MS数据显示在图2B和C。搜索结果表明，该PAI峰的R的包含T（二甲基）ELNYFAK（同量异位的标签6）蛋白磷酸甘油酸激酶1，最激烈的碎片离子是Y 3+是用于既轻和重峰二甲基化的类似肽。这些峰对HCD-MS 3进一步分离和报告物离子（M / Z

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Discussion

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cPILOT允许多于12个独特的样品的同时测量。为了确保在肽的两个N-末端和赖氨酸残基的成功标记，就必须有正确的pH为每个组反应和首先执行二甲基化反应的肽标记。在N-末端选择性二甲基化是通过在〜2.5的pH（±0.2）中进行。这是通过利用氨基基团的pKa的对赖氨酸和差的N-末端来实现。在pH 2.5，赖氨酸是不活动的（PKA〜10.5）;然而，如果pH在温和的酸性（ 即 pH为5-7）或碱性的，这两个N端和赖氨酸残基将被二甲基化。此外，如果是在低pH值首先进行同量异位标记，N-末端将具有同量异序标签和赖氨酸残基将被二甲基化。这可以导致更少的片段被选择用于MS 3为b-离子将需要选择。二甲基的相对成本相比商业等压试剂通货膨胀的反应是价格便宜。尽管人们可以每100微克使用整个等压试剂瓶，我们用每100微克的试剂瓶的一半，可比的标记效率也有成功。这有助于减少显著为个人cPILOT实验的成本，并允许分析更多的样品。还需要注意的是其他的等压标记试剂可以发生在这个协议中使用的等压试剂可以作为我们先前已经证实14是很重要的。为确保高标记和标记效率，以试剂快速添加.......

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Disclosures

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作者有没有利益争夺。

Acknowledgements

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作者承认匹兹堡启动经费的大学和美国国立卫生研究院，NIGMS R01补助（GM 117191-01）到RASR。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
水 - MS 级Fisher ScientificW6-44 L 无需量
乙腈 - MS 级Fisher ScientificA955-44 L 量
乙酸J.T. Baker9508-01
氢氧化铵溶液 （28 - 30%）Sigma Aldrich320145-500ML
甲酸铵Acros Organics208-753-9
甲酸Fluka 分析94318-250ML-F
BCA 蛋白检测试剂盒Pierce Thermo Fisher Scientific23227
尿素Biorad161-0731
TrisBiorad161-0716
二硫苏糖醇 （DTT）Fisher ScientificBP172-5
碘乙酰胺 （IAM））Acros Organics144-48-9
L-半胱氨酸Sigma Aldrich，化学168149-25G
L-1-甲苯酰氨基-2 苯乙基胆胺酮 （TPCK） 处理的胰蛋白酶，来自牛胰腺Sigma Aldrich，生命科学T1426-100MG
甲醛 （CH2O） 溶液;36.5 - 38% 的 H2O SigmaAldrich，生命科学F8775-25ML
甲醛（13CD2O）溶液;D2O 中含量为 20 wt %，D为 98 原子 %，< 为 99 原子 % sup>13Sigma Aldrich，化学596388-1G
氰基硼氢化钠;试剂级，95%Sigma Aldrich156159-10G
氰基硼化钠;96 原子 % D， 98% CPSigma Aldrich，化学190020-1G
强阳离子交换 （SCX） 旋转头样品制备试剂盒Protea BioSciencesSP-155-24kit
碳酸氢铵三乙基铵 （TEAB） 缓冲液Sigma Aldrich，生命科学T7408-100ML
同量异位标记试剂盒（TMT 6 plex） - 6 次反应 （1 x 0.8 mg）Thermo Fisher Scientific90061
盐酸羟胺Sigma Aldrich，化学255580-100G
标准涡旋混合器Fisher Scientific2215365任何混合器均可使用
Oasis HLB 1 cc （10 mg） 萃取柱Waters186000383这些是 C18 小柱
Visiprep SPE 真空歧管，DL（一次性衬垫），24 端口型号Sigma Aldrich5726512端口型号也足够
Speed-vacThermo ScientificSPD1010任何品牌的速吸尘器都足够
水浴室Thermo Scientific2825/2826任何品牌的 具有受控温度的水浴室就足够了。
机械均质器 （i.e.e. FastPrep-24 5G）MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 自动进样器Sciex-此型号已停产。任何带有自动进样器的纳 LC 就足够了。
LTQ Orbitrap Velos 质谱仪Thermo Scientific-此型号已停产。可以使用其他高分辨率仪器（例如 Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos）。
蛋白质软件 （e.g. Proteome Discoverer）Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
分析天平梅特勒-托利多AL54
搅拌板VWR12365-382任何品牌的搅拌板都足够
pH 计（Tris 兼容）Fisher Scientific （Accumet）13-620-183任何品牌的 pH 计都足够
pH 10 缓冲液Fisher Scientific06-664-261任何品牌的 pH 缓冲液 10 都足够
了 pH 7缓冲液Fisher Scientific06-664-260任何品牌的 pH 缓冲液 7 就足够
1.5 mL eppendorf 管，500 包Fisher Scientific05-408-129任何品牌的 1.5 mL eppendorf 管就足够
0.6 mL eppendorf 管，500 件Fisher Scientific04-408-120任何品牌的 0.6 mL eppendorf 管就足够
0.65 µm Ultrafree MC DV 离心过滤装置EMD MilliporeUFC30DV00
2 mL 微量离心管，72 个装置Thermo Scientific69720
C18 包装材料 （5 &微;m， 100 Å）BrukerPM5/61100/000此产品已不再从 Bruker 提供。具有所列规格的替代包装材料将足够
C18 包装材料 （5 &微;m， 200 Å）BrukerPM5/61200/000Bruker 已停产。具有所列规格的替代包装材料就足够了
无需 了 了 了 了 装 了

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

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