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方法文章

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

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DOI：

10.3791/55417

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2017年3月24日

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

本文内容

摘要

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。

摘要

免疫系统对抗原表位的识别有助于理解中和抗体的保护机制，从而促进疫苗和多肽药物的开发。多肽扫描是一种简单高效的方法，可直接绘制单克隆抗体（mAb）识别的线性表位。本文中，作者介绍了一种表位鉴定方法，该方法结合连续截短的重组蛋白、合成多肽设计以及点印迹杂交技术，利用一种中和性单克隆抗体对神经系统坏死病毒衣壳蛋白进行抗原识别。该技术基于将合成多肽与单克隆抗体在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上进行点印迹杂交。通过逐步截短的多肽作图，可将RG-M56单克隆抗体识别的病毒衣壳蛋白最小抗原区域缩小至一个6个氨基酸残基的多肽表位。此外，还可通过丙氨酸扫描突变及残基替换，分析构成该表位的各个氨基酸残基在结合中的重要性。研究发现，表位位点两侧的残基在多肽构象调控中发挥关键作用。所鉴定出的表位多肽可用于构建表位多肽-抗体复合物晶体，以进行X射线衍射分析和功能竞争实验，或用于治疗用途。

引言

在免疫系统中，V、D 和 J 片段的重排使得抗体能够产生大量互补决定区（CDR），以识别并结合多种抗原，从而保护宿主免受病原体感染。抗体对抗原的中和防御作用依赖于抗体CDR与抗原表位之间的空间互补性。因此，理解这种分子相互作用将有助于预防性疫苗设计和治疗性多肽药物的开发。然而，这种中和作用可能受到单个抗原上多个抗原结构域以及抗体多个CDR的共同影响，从而使表位鉴定过程更加复杂。幸运的是，杂交瘤技术的发展——将单个抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合——能够获得持续分裂的细胞群体，分泌一种特异性抗体，即单克隆抗体（mAb）1。杂交瘤细胞产生的这些高纯度、高亲和力的单克隆抗体可特异性结合某一特定抗原的单一抗原结构域。在明确抗原-抗体对应关系后，可采用多种方法（包括多肽扫描）利用相应的单克隆抗体来确定抗原的表位。近年来合成多肽技术的进步使多肽扫描技术更易于实施且操作更为便捷。简而言之，根据目标抗原序列合成一组重叠的合成多肽，并将其固定于固相支持膜上用于单克隆抗体的杂交结合。多肽扫描不仅为定位抗体结合区域提供了简便方法，还可通过残基扫描或替换进行氨基酸（aa）定点突变，以评估表位多肽中每个氨基酸残基与抗体CDR之间的结合相互作用。

本研究描述了一种利用中和性单克隆抗体高效鉴定黄道斑纹神经坏死病毒（YGNNV）衣壳蛋白线性表位的实验方案2,3,4。该方案包括单克隆抗体的制备、逐级截短重组蛋白的构建与表达、重叠合成肽段的设计、点印迹杂交、丙氨酸扫描以及取代突变分析。考虑到多肽合成成本较高，本研究对目标蛋白的逐级截短重组蛋白步骤进行了优化，在进行合成肽阵列点印迹分析前，先将抗原区域缩小至约100至200个氨基酸残基范围内。

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方案

1. 单克隆抗体的制备

  1. 将RG-M56小鼠单克隆杂交瘤细胞2在无血清培养基中，于37 ºC、5% CO2条件下接种于175T培养瓶中进行培养。培养5天后，当培养基颜色变为黄色时，收集上清液。
    注意：使用无血清培养基培养杂交瘤细胞，以避免胎牛血清中的抗体污染。
  2. 在4 ºC条件下，以4,500 × g离心上清液30分钟，弃去细胞碎片沉淀。
  3. 向5 mL层析柱中加入2 mL蛋白G琼脂糖（以50%悬液形式提供），并用10倍柱体积（10 mL）的冰预冷PBS进行平衡。
  4. 将200 mL抗体上清液（步骤1.2）上样至层析柱中，弃去穿流液。
  5. 向层析柱中加入10 mL冰预冷PBS进行洗涤，重复两次。
  6. 向层析柱中加入10 mL 50 mM甘氨酸（pH 2.7）以洗脱与蛋白G结合的抗体。将洗脱液以每管900 µL分步收集至已加入100 µL 10倍中和缓冲液（1 M Tris、1.5 M NaCl和1 mM EDTA，pH 8.0）的微量离心管中。
  7. 将纯化后的抗体溶于含0.03% NaN2的50%甘油中，于-20 ºC保存。

2. 连续截短重组蛋白的构建与表达

  1. 配制PCR反应混合液：5 µL 10x Pfu 缓冲液，每种dNTP 0.2 mM，0.2 µM 正向引物3，0.2 µM 反向引物3，MgSO4 2 mM，pET20b-1A593 质粒DNA 1 ng，以及 Pfu DNA聚合酶 2.5 U（单位）；加入ddH2O至终体积为50 µL。
    1. 在自动热循环仪中运行样品，程序如下：第1个循环（94 ºC 5分钟）；第2-36个循环（94 ºC 30秒，63 ºC 30秒，72 ºC 60秒）；第37个循环（72 ºC 7分钟）。
  2. 使用PCR纯化试剂盒5提取聚合酶链式反应（PCR）产物，以便进行后续的限制性内切酶消化。
  3. 用NdeI 和 XhoI 限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段，并将各DNA片段连接至经NdeI 和 XhoI 酶切的pET-20b(+)载体中。将构建物转化至Escherichia coli DH-5α感受态细胞6。
    1. 在消化缓冲液（20 mM 醋酸-Tris，10 mM Mg(CH3COO)2，50 mM KCH3COO，1 mM DTT，pH 7.9）中配制消化混合液，包含1 µg PCR扩增的DNA或pET-20b(+)载体DNA，以及2 U的NdeI 和 XhoI 限制性内切酶，终体积为20 µL。
    2. 轻轻混匀消化混合液并短暂离心。在干浴中37 ºC孵育2小时，以确保限制性酶切位点完全切割。
    3. 使用PCR纯化试剂盒5提取经限制性内切酶消化的DNA片段，以便进行后续质粒构建。
    4. 在连接缓冲液（66 mM Tris，5 mM MgCl2，1 mM ATP，5 mM DTT，pH 7.5）中配制连接混合液，包含100 ng预消化的PCR扩增DNA，10 ng预消化的pET-20b(+)载体DNA，以及5 U T4 DNA连接酶，终体积为10 µL。
    5. 轻轻混匀连接混合液并短暂离心。在水浴中16 ºC孵育18小时。
    6. 将10 µL连接产物加入100 µL DH-5α感受态细胞中，轻轻混匀，然后将微量离心管置于冰上30分钟。将微量离心管在干浴中42 ºC放置90秒以进行热激7。立即转移至冰上放置2分钟。
    7. 向管中加入900 µL LB（Luria-Bertani）培养基（1% Bacto胰蛋白胨，0.5% Bacto酵母提取物，0.5% NaCl，pH 7.0）。在37 ºC、150 rpm振荡条件下孵育45分钟。在4,000 x g离心10分钟收集菌体，并弃去上清液。
    8. 用50 µL LB培养基重悬菌体沉淀，将每次转化产物涂布于预先温育的含100 µg/mL氨苄青霉素的LB平板上。在37 ºC孵育16小时。
    9. 用200 µL枪头挑取单个菌落，转移至含100 µg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养基中（置于松盖的15 mL离心管中）。在37 ºC、150 rpm振荡条件下孵育12小时。
    10. 从各培养物中提取质粒DNA8，并使用T7启动子和T7终止子引物进行测序，以确认序列正确性9。
  4. 测序确认后，取含有不同长度YGNNV衣壳蛋白基因的pET-20b(+)质粒DNA 10 ng，通过热激法7转化至E. coli BL-21 (DE3)菌株中。按照步骤2.3.6–2.3.8进行转化操作。
  5. 从每种转化后的E. coli BL-21菌落中挑取单个菌落，转移至含100 µg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养基中（置于松盖的15 mL离心管中）。在37 ºC、150 rpm振荡条件下培养。
  6. 当培养物OD600值约为0.6时，将培养物冷却至25 ºC，并加入IPTG至终浓度为0.4 mM，以诱导重组蛋白表达。在25 ºC、200 rpm振荡条件下继续孵育4小时。
  7. 取1 mL培养物转移至微量离心管中。在12,000 x g离心1分钟收集菌体，并弃去上清液。
  8. 用移液器吸取100 µL变性缓冲液（8 M 尿素，20 mM 磷酸钠，0.5 M NaCl，pH 7.4）反复吹打重悬菌体沉淀。剧烈涡旋混匀。
    注：样品溶液此时应呈半透明、略带黏性，可用于点印迹杂交实验。

3. 重叠肽的设计与合成

  1. 设计并合成3一系列20个氨基酸长度的肽段，每段与其后续肽段在YGNNV衣壳蛋白的195-338氨基酸区域上重叠10个氨基酸残基，通过点印迹法缩小RG-M56单克隆抗体的表位区域。
  2. 设计并合成3三种8个氨基酸长度的肽段（195VNVSVLCR202、197VSVLCRWS204 和 199VLCRWSVR206），每段与下一个合成肽段重叠6个氨基酸残基，通过点印迹法进一步缩小195-206氨基酸区域的表位范围。
  3. 设计并合成37个氨基酸长度的肽段（196NVSVLCR202 和 195VNVSVLC201）、6个氨基酸长度的肽段（195VNVSVL200、196NVSVLC201 和 197VSVLCR202）以及5个氨基酸长度的肽段（195VNVSV199、196NVSVL200、197VSVLC201 和 198SVLCR202），分别与其相邻肽段重叠6、5和4个氨基酸残基，通过点印迹法最小化确定表位区域。

4. 点印迹杂交

  1. 将每种合成的多肽溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为 10 mg/mL。
    注意：为克服合成多肽溶解度的差异，所有合成多肽均应使用 DMSO 溶解。DMSO 是一种良好的溶剂，可完全溶解疏水性或亲水性多肽。
  2. 用甲醇浸泡聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 2 分钟。
    注意：PVDF 膜对 DMSO 的耐受性可达 100%；其他膜可能不具备此特性。
  3. 用改良的 Towbin 缓冲液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸和 0.1% SDS，pH 8.3）平衡 PVDF 膜 2 分钟。
    注意：可在改良 Towbin 缓冲液中加入 10–20%（v/v）的甲醇，以提高转膜效果。
  4. 用改良 Towbin 缓冲液冲洗一张层析滤纸。将 PVDF 膜置于层析滤纸上。待 PVDF 膜表面的改良 Towbin 缓冲液完全消失后，再进行下一步操作。
  5. 使用 10 µL 枪头，向膜上添加 2 µL 每种多肽样品。将 PVDF 膜在层析滤纸上室温晾干 10 分钟。应缓慢且逐步地将每种多肽样品加至膜上，以避免扩散过度。
  6. 在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液（0.05%（v/v）Tween-20、20 mM Tris 和 150 mM NaCl，pH 7.4）中，室温轻摇封闭膜 30 分钟。
  7. 将 RG-M56 单克隆抗体以 1:1,000 的终浓度加入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液中，加入膜上。37 ºC 轻摇孵育 1 小时。
  8. 移除抗体溶液。用 TBST 缓冲液轻摇洗涤膜 5 分钟，重复两次。
  9. 将二抗（山羊抗小鼠 IgG Fc 碱性磷酸酶偶联抗体）以 1:5,000 的终浓度加入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液中，加入膜上。37 ºC 轻摇孵育 1 小时。
  10. 弃去抗体溶液。用 TBST 缓冲液轻摇洗涤膜 5 分钟，重复洗涤步骤两次。
  11. 在避光条件下，室温使用 BCIP/NBT 显色底物溶液显色 15 分钟。当信号出现后，用 ddH2O 洗涤膜以终止显色反应。
  12. 将膜晾干，并使用成像系统采集点印迹图像。
  13. 使用图像分析软件3测量每个点印迹的信号强度。

5. 丙氨酸扫描与替换

  1. 设计并合成3丙氨酸和甲硫氨酸取代肽。将8-mer肽195VNVSVLCR202中的每个氨基酸残基依次替换为丙氨酸，合成以下肽段：195ANVSVLCR202、195VAVSVLCR202、195VNASVLCR202、195VNVAVLCR202、195VNVSALCR202、195VNVSVACR202、195VNVSVLAR202和195VNVSVLCA202。将第200位的亮氨酸残基替换为甲硫氨酸，以生成SJNNV基因型表位肽195VNVSVMCR202。
  2. 按照第4节进行丙氨酸扫描和取代突变点印迹分析。

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结果

本实验的目的是通过点印迹法（dot blotting）利用单克隆抗体（mAb）鉴定一个抗原表位。为了快速高效地缩小mAb识别的抗原区域，采用大肠杆菌（E. coli）PET表达系统表达了带有C端6xHis融合标签的全长及一系列截短形式的YGNNV重组衣壳蛋白10（图1A）。将获得的重组蛋白点样至PVDF膜上，并使用RG-M56单克隆抗体及抗6xHis抗体进行点印迹杂交检测。点印迹结果显示，1-338个氨基酸（全长）、51-338个氨基酸以及195-338个氨基酸的重组蛋白呈阳性信号，而1-100个氨基酸或1-200个氨基酸的重组蛋白则无信号（图1B）。利用抗6xHis抗体对点阵进行杂交，证实了所有重组蛋白均成功表达。这些结果表明，RG-M56单克隆抗体所识别的表位位于YGNNV衣壳蛋白C端附近一段144个氨基酸的重组蛋白区域（195-338个氨基酸）。

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讨论

本方案提供了一种快速且简便的技术，用于鉴定单克隆抗体（mAb）识别的线性表位。在进行肽段扫描分析之前，为降低肽段合成成本并提高合成效率，可通过表达一系列截短的重组蛋白来缩小病毒衣壳蛋白的抗原区域。因此，采用可靠高效的 E. coli pET 表达系统来生产这些系列截短的重组蛋白，因为该系统可轻松表达分子量在 10 至 50 kDa 之间的重组蛋白。通过这种方法，可将表位快速缩小至一个更易处理的 100 至 200 个氨基酸的区域。本研究特别选用 pET-20b(+) 载体，因其含有编码 6xHis 标签表达的序列，使得所表达的 6xHis 标签融合蛋白可通过抗-6xHis 抗体进行免疫检测，从而确认重组蛋白的表达。随后，利用 RG-M56 单克隆抗体通过点印迹杂交实验对所获得的重组衣壳蛋白进行分析。另一种确定重组蛋白表位的方法是：通过固定化金属离子亲和层析10纯化表达的重组蛋白，使用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离重组蛋白，并进行蛋白质印迹分析3。

为了进一步精细定位由...

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披露

作者与本报告无任何利益冲突。

致谢

作者感谢中国台湾中央研究院细胞与个体生物学研究所（ICOB）核心设施的林静君女士和林黛安娜女士，她们分别为本研究提供了肽合成和DNA测序方面的专业技术支持。本研究由中央研究院资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Hybrid-SFM 培养基Gibco12045-076
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)Gibco21600-069
Pfu DNA 聚合酶 Thermo Scientific EP0502 含缓冲液
T4 DNA 连接酶Roche10799009001含缓冲液
NdeI New England BiolabsR0111S含缓冲液
XhoI New England BiolabsR0146S含缓冲液
pET-20b(+) 载体Novagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α 感受态细胞RBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) 感受态细胞RBC BioscienceRH217
氨苄青霉素Amresco0339-25G
LB 培养基 Invitrogen12780-052
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
甲醇Merck Millipore106009
聚氧乙烯 20 山梨醇单月桂酸酯 (Tween-20)J.T.BakerX251-07
二甲基亚砜 (DMSO)SigmaD2650
甘氨酸Amresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
甘油Amresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
山羊抗小鼠 IgG Fc 片段抗体Jackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (聚偏氟乙烯, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Protein G Agarose 快速流速树脂Merck Millipore16-266
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28106
UVP BioSpectrum 600 成像系统UVPn/a
VisionWorks LS 分析软件 版本 6.8UVPn/a
MyCycler 梯度 PCR 仪BioRad1709713

参考文献

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