一种简便的芥子油苷提取与高效液相色谱（HPLC）分析方法

摘要

本文详细描述了一种从研磨的植物材料中提取芥子油苷的成熟且可靠的方案。提取物经柱上硫酸酯酶处理后，洗脱脱硫芥子油苷，并通过高压液相色谱进行分析。

摘要

芥子油苷是一类研究较为深入且结构高度多样的天然植物化合物。它们在植物抗性、油菜籽油品质、食品调味以及人类健康方面发挥着重要作用。当植物组织受损时，芥子油苷会与黑芥子酶（myrosinase）接触，从而释放其生物活性。这一过程产生具有辛辣味和毒性的降解产物，例如异硫氰酸酯和腈类化合物。目前已有超过130种结构不同的芥子油苷被鉴定。芥子油苷的化学结构决定了其降解产物的种类，进而影响其生物学活性。这种活性可能从有害（例如，前致甲状腺肿苷）到有益（例如，萝卜硫苷）不等。每种含芥子油苷的植物物种都具有其特有的芥子油苷谱型。因此，准确鉴定并可靠定量芸薹属叶、种子和根类作物中存在的不同芥子油苷，或在生态学研究中对其野生近缘种进行分析，显得尤为重要。本文介绍了一种经过充分验证、靶向性强且稳健的方法，可用于分析多种植物物种及植物器官中的芥子油苷谱型。将粉碎后的植物材料用甲醇-水混合液在高温下提取，以灭活黑芥子酶活性，从而获得完整的芥子油苷。随后，将所得提取物上样至离子交换柱进行纯化。经硫酸酯酶处理后，脱硫芥子油苷用水洗脱，洗脱液经冷冻干燥。残留物溶于精确体积的水中，通过高效液相色谱（HPLC）结合光电二极管阵列（PDA）或紫外（UV）检测器进行分析。通过与商业标准品的保留时间和紫外光谱进行比对，实现对目标物的检测与定量。浓度计算基于芥子油苷标准曲线以及已确立的响应因子。本文还讨论了该方法相较于更快、技术更先进的分析手段所具有的优缺点。

引言

据估计，植物能够产生超过20万种不同的化学化合物¹。其中只有少数化合物参与植物的初级代谢过程，为生长和繁殖提供能量；大多数化合物被称为次生代谢物。尽管名为“次生”，这些代谢物通常对植物的生存和繁殖至关重要，因为它们能够吸引传粉者，或帮助植物抵御病原体和草食性动物的侵害¹。

芥子油苷是一类高度多样化的次生代谢产物，已有超过150年的研究历史²。迄今为止，已鉴定出130多种结构不同的芥子油苷³。总体而言，芥子油苷可根据其合成所来源的氨基酸分为不同的类别。例如，吲哚类芥子油苷由色氨酸合成，而苯丙氨酸则为芳香族芥子油苷的合成提供基本骨架⁴。在各类别内部，由于生物合成途径中的连续链延长步骤（如在脂肪族芥子油苷类别中）或侧链修饰（例如羟基化），存在高度的结构多样性^4,5。一种含有芥子油苷的植物物种可能包含多达37种属于不同结构类别的芥子油苷⁶。尽管植物物种具有典型的芥子油苷谱型，但在个体和种群之间，芥子油苷的类型常表现出种内变异^6,7。完整的芥子油苷储存在植物细胞的液泡中，可在地上或地下任何器官中发现^7,8,9。当细胞破裂时（例如因植食性动物取食），芥子油苷被释放，并与酶黑芥子酶混合，从而触发“芥子油炸弹”反应¹⁰。由于黑芥子酶的活性，并取决于芥子油苷的结构、反应条件以及修饰酶的存在，会生成多种辛辣、有毒或有害的化合物，如腈类和（异）硫氰酸酯类¹¹。这些反应产物具有高度的生物活性；例如，它们可作为广食性昆虫植食者的驱避剂¹²。芥子油苷的遗传性和生物合成途径已被广泛研究，这主要归因于其在抵御植食性动物和病原体方面的意义、其作为芥末和卷心菜等作物风味成分的价值，以及其对人类健康产生的负面（如前致甲状腺肿素）和正面（如萝卜硫苷）影响^5,13,14。

由于人们对作为生物活性化合物的硫代葡萄糖苷具有极大兴趣，自20世纪80年代以来，通常采用配备紫外（UV）或光电二极管阵列（PDA）检测器的反相高效液相色谱（HPLC）方法进行其提取与检测¹⁵. 基于此方法，欧洲共同体发布了一项标准方案，并在多个实验室中对油料种子中芥子油苷的分析进行了测试与验证（Brassica napus，油菜，Canola¹⁶）。其他研究者对该方法进行了补充（例如， 通过测定油菜籽中不存在的硫代葡萄糖苷的额外响应因子¹⁷尽管用于芥子油苷分析的液相色谱-质谱联用（LC-MS）平台和高通量实验方案日益普及^18,19尽管如此，原始的HPLC-UV/PDA方法仍被科学家广泛使用。主要原因在于该方法操作简便、成本低廉，且对缺乏完善化学分析知识体系的实验室而言具有较高的可及性。为服务这一科研群体，本文详细阐述了从植物材料中提取硫代葡萄糖苷并利用HPLC-PDA分析其脱硫形式的实验方案。

方案

1. 芥子油苷提取所需溶液的制备

1. 在玻璃瓶中配制500 mL甲醇（MeOH）水溶液（70%，v/v，超纯水）。处理100个样品和5个标准品需使用420 mL 70% MeOH。
2. 通过加入0.82 g的NaOAc或1.36 g的NaOAc·3H₂O，配制20 mM醋酸钠（NaOAc）溶液（pH = 5.5）。₂将 NaOAc 溶于 500 mL 水中；用盐酸（HCl）调节 pH。将 NaOAc 溶液储存于冰箱中。配制 100 个样品和 5 个标准品所需水量为 370 mL 的 20 mM NaOAc 水溶液（pH = 5.5）。
3. 准备层析柱材料时，将10 g交联葡聚糖凝胶（G-25型）与125 mL超纯水混合，将所得混合物置于冰箱（4 °C）中保存。
4. 硫酸酯酶溶液的制备
   1. 溶解10,000单位芳基硫酸酯酶（H-1型，来源于 Helix pomatia) 溶于30 mL超纯水中，加入30 mL无水乙醇（EtOH）。充分混匀后，转移至一个250 mL离心管或多个较小的离心管中，具体取决于设备可用情况。
   2. 在室温（RT）下以2,650 × g离心混合物20分钟。将上清液转移至烧杯中，加入90 mL乙醇并混匀。将混合物置于一个或多个离心管中，在室温（RT）下以1,030 × g离心15分钟。
   3. 弃去上清液。将沉淀物溶解并合并于总共25 mL超纯水中。充分涡旋混匀，分装至1 mL离心管中，于-20 °C冰箱中保存；可稳定保存至少一年。
5. 芥子苷标准溶液的制备
   1. 使用精度为1 µg的天平称取约9 mg的芥子酸单水合物（sinigrin monohydrate）例如， 8.769 mg）。转移至10 mL容量瓶中，用10.0 mL超纯水溶解芥子苷一水合物。
   2. 计算储备液的摩尔浓度，并通过稀释该储备液配制50–750 µM范围内的5个芥子油苷标准溶液。具体示例如下 补充文件 S1.
   3. 将不同浓度的芥子油苷标准品分别加入1.5 mL反应管中，并在20 °C下冷冻保存。每个提取批次中均需包含一组五个芥子油苷标准品。在计算浓度时，务必使用当前所用芥子油苷标准品的正确摩尔浓度值。

2. 提取装置的准备

1. 为巴斯德吸管柱准备一个柱架（柱的制备参见步骤 3.1）。标记柱架或吸管柱以记录样品编号（见图 1）。
2. 准备一个可容纳相同数量已标记 2 mL 微离心管的管架（参见步骤 3.3 和 图 1）

图1：用于芥子油苷提取的支架装置。 芥子油苷提取所用的自制层析柱支架与底座的前视图（左）和顶视图（右）。高度：100 mm，错位孔之间的间距（用于固定巴斯德移液管层析柱）：30 mm（x轴）× 15 mm（y轴）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 准备色谱柱和微量离心管

1. 每个样品准备一列，另加五列用于五个芥子油苷参考样品。
   1. 在每个玻璃移液管中放入一块约1 cm × 1 cm的玻璃棉。使用木棒或玻璃棒将玻璃棉推至移液管变窄处。玻璃棉应防止柱材料流出，但用量不宜过多，否则会减慢洗脱速度。操作玻璃棉时应佩戴手套。
2. 将柱子放置在柱架上（见图1）。将柱架置于实验托盘（废液托盘）中，以收集连续柱洗涤过程中产生的洗脱液。
3. 剪去一个塑料1 mL移液枪头尖端的前5 mm，然后向每根柱中加入0.5 mL已制备的柱材料（水中的G-25凝胶，参见步骤1.3）。移液前需充分摇匀盛有柱材料的瓶子。若柱子发生泄漏（G-25材料穿过玻璃棉层流出），则弃用并更换新柱。
   1. 将柱材料加入柱子后，加入1 mL超纯水以冲洗并使材料沉降。
4. 为每个样品准备一个2 mL反应管，另加五个反应管用于五个芥子油苷参考样品，并进行标记。使用解剖针在管盖上打孔，以便后续冻干处理，并将准备好的反应管按与柱子完全相同的排列方式放入试管架中（步骤2.2，见图1）。

4. 芥子油苷的提取

1. 称取冻干并充分研磨的植物材料（通常为50.0–100.0 mg干重；提取液中最终硫代葡萄糖苷浓度应在标准曲线范围内），精确至0.1 mg，置于已标记的2 mL圆底反应管中。向每根管中加入两颗小金属珠（直径3 mm）作为防暴沸颗粒。
   注意：本方案也可用于经液氮研磨后迅速冷冻并保持冷冻状态直至提取的新鲜速冻材料。为补偿材料中水分带来的稀释效应，应增加称取的材料量，并将提取液中甲醇（MeOH）的比例提高至85%¹⁹。
2. 向每根管中加入1 mL 70% MeOH，短暂涡旋混匀。盖紧管盖并用安全盖密封，随后尽快将反应管放入90–92 °C的热水浴中加热数分钟（约5 min），直至70% MeOH刚开始沸腾。注意：此步骤操作时需佩戴护目镜！
3. 将样品管置于超声水浴中处理15 min。同时，从冰箱中取出硫酸酯酶及五份芥子苷标准品，于室温下解冻。
4. 超声处理后，在室温下以2,700 × g离心样品管10 min，每管应形成沉淀。将上清液转移至已标记的固相萃取柱中，并将五份标准品分别加样至不同的柱中。
   1. 加样上清液时，移液枪头应始终位于沉淀上方，避免吸入植物残渣。注意：若使用干燥样品，上清液体积将少于1.0 mL。
5. 向样品管中残留的沉淀加入1 mL 70% MeOH，涡旋混匀后再次放入超声水浴中处理15 min。按步骤4.4条件再次离心，并将所得上清液加入对应的固相萃取柱中；由于柱填料的特性，硫代葡萄糖苷所带的负电荷硫酸基团将被特异性保留在柱上。
6. 按以下三个连续步骤对柱子进行洗涤。
   1. 向每根柱中加入2 × 1 mL 70% MeOH。待液体完全流尽后再加入下一份1 mL；此步骤可去除提取物中更多非极性杂质（例如叶绿素）。
   2. 向每根柱中加入1 mL超纯水，以冲洗残留的MeOH。
   3. 向每根柱中加入2 × 1 mL 20 mM乙酸钠（NaOAc）缓冲液，为后续硫酸酯酶反应创造最佳条件。
7. 将装有柱子的支架从废液托盘中取出，用纸巾擦干支架底部。将支架放置于装有小瓶和已标记试管的支架上方，确保每根柱子的出口尖端对准相应编号的2 mL收集管（见图1）。
8. 向每根柱中加入20 µL硫酸酯酶溶液，确保酶液接触柱填料表面。随后向每根柱中加入50 µL NaOAc缓冲液，以冲洗柱壁上的酶液。用铝箔覆盖柱子，静置过夜。
   注意：由于硫酸酯酶的作用，硫代葡萄糖苷的硫酸基团将被去除，生成去硫酸化硫代葡萄糖苷并从柱上洗脱，随水相流出。详细机制参见Crocoll 等¹⁹。
9. 次日，通过向每根柱中加入2 × 0.75 mL超纯水，洗脱去硫酸化硫代葡萄糖苷。待所有柱子完全流干后，抬起柱架并将其从收集管上移开。
   1. 盖上收集管盖（确保盖子上有通气孔），在液氮或-80 °C冰箱中冷冻30 min。随后进行冷冻干燥12–24 h（时间取决于样品数量和冻干机容量），以完全去除水分。
10. 冻干完成后，将残留物精确溶解于一定体积（通常为1.0 mL）的超纯水中。将样品及五份芥子苷标准品转移至已标记的HPLC进样瓶中。样品可在冰箱（4 °C）中保存最多两周，或在冷冻柜（-20 °C）中保存最多一年，之后进行HPLC分析。
11. 让玻璃柱在通风橱中过夜干燥，干燥后予以废弃处理。从步骤4.5所用样品管中回收金属珠以重复使用，并将反应管放入废弃物处理箱中。

5. 提取样品的高效液相色谱检测

1. 使用反相C₁₈色谱柱（4.6 × 150 mm，3 µm，300 Å），以乙腈-水梯度洗脱（见表1），流速为0.75 mL/min，柱温为40 °C，分离芥子油苷。在229 nm处进行检测与定量。
2. 在同一色谱柱上测定芥子苷标准品，但采用优化的梯度方法以减少溶剂消耗（见表2）。首先依次进样五种芥子苷标准品，从最低浓度的标准品开始。随后进样待测样品，每检测十个样品后插入一次甲醇进样（空白），以清洗色谱柱并防止峰残留。

时间 [分钟]	流速 [mL/min]	% A 水	% B 乙腈
1	0.750	98	2
35	0.750	65	35
40	0.750	98	2
色谱柱温度 40 °C。

表1：反相高效液相色谱法分离与分析芥子油苷所用的乙腈-水梯度。

时间 [分钟]	流速 [mL/min]	% A 水	% B 乙腈
1	0.750	98	2
10	0.750	89.3	10.7
11	0.750	98	2
色谱柱温度 40 °C。

表2：用于芥子油苷定量分析的五种芥子苷参比物质的缩短型乙腈-水梯度洗脱程序。

6. 芥子油苷的鉴定与定量

1. 鉴定
   1. 将样品中各峰的紫外光谱（UV）和保留时间与市售的纯芥子油苷标准品进行比较。各种芥子油苷类别的紫外光谱示例见图2。
   2. 尽可能使用标准品或液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）^18,19 鉴定未知的芥子油苷。
   3. 尽可能通过核磁共振（NMR）鉴定未知的芥子油苷。
   4. 将样品中各峰的紫外光谱和保留时间与图2和表3、数据库或文献资料中的数据进行比对。

图2. 最常见的芥子油苷类化合物的紫外光谱。 六种去硫酸化芥子油苷（GSL）的紫外吸收光谱（200–350 nm），其溶液由商业可得的标准品制备，提取方法如本文所述，代表了最常见的结构类别。图中给出了通用名、结构名（括号内）以及结构类别。（A）黑芥子苷（2-丙烯基 GSL），烯基；（B）萝卜硫苷（4-甲硫基丁基 GSL），硫代烯基；（C）萝卜硫素前体（4-甲亚砜基丁基 GSL），亚砜基；（D）芥子芸苔苷（吲哚-3-基甲基 GSL），吲哚类；（E）葡糖异硫氰酸酯（2-苯乙基 GSL），芳香族；（F）芥子醛苷（4-羟基苄基 GSL），芳香族。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 定量分析
   1. 对五种芥子油苷标准品及样品的色谱峰面积进行积分。
   2. 根据积分得到的峰面积，绘制五种芥子油苷标准品的校准曲线。利用回归直线方程（见公式1）计算待测样品中芥子油苷的插值含量（见公式2）。
   3. 为计算不同芥子油苷的浓度，需将插值含量（x）乘以在229 nm检测波长下的响应因子（M），该因子可参考EC（1990）¹⁶、Buchner（1987）¹⁵ 或 Brown et al.（1993）¹⁷ 提供的数据；最常见脱硫芥子油苷的共识响应因子见表3。
      注：响应因子可能因检测系统不同而有所差异——这可能是不同文献中数值存在差异的原因（参见参考文献15–17）。尽管如此，这些数值通常较为接近，且在相同结构类别中处于相似范围。按照惯例，对于未鉴定的芥子油苷，其响应因子设为1；但对于紫外光谱与葡萄糖芸苔素及其他吲哚类芥子油苷相似的未知吲哚类芥子油苷（图2），建议采用0.25作为响应因子，以获得更真实的浓度估算值（表3）。
   4. 为计算样品中芥子油苷的最终含量（x_t），需考虑稀释倍数（D）以及用于分析的样品质量（w）（见公式3）。
      (1)
      (2)
      (3)
      y = 峰面积
      m = 五点标准品回归曲线的斜率
      c = 回归直线与y轴的截距
      x = 提取物中芥子油苷的含量
      x_t = 植物样品中芥子油苷的浓度
      D = 稀释倍数
      M = Buchner（1987）或 Brown et al.（1993）提供的229 nm检测波长下的响应因子
      w = 用于提取的样品质量

结果

该方法可实现对所有结构类别中常见去硫酸根芥子油苷的检测与分离（图3）。有害的2-羟基芥子油苷——前致甲状腺肿素在色谱图中出峰较早，并与有益的芥子油苷萝卜硫苷（glucoraphanin）明显分离，后者是本样品中唯一的甲基亚砜基芥子油苷。芥子苷（sinigrin）、芥子 napin（gluconapin）和芥子 brassicanapin（glucobrassicanapin）构成了一组随侧链长度增加（分别为C3、C4和C5）而依次洗脱的烯基芥子油苷系列。对于两种甲硫基烯基芥子油苷——芥子 iberverin（glucoiberverin，C3）和芥子 erucin（glucoerucin，C4），也可观察到类似的规律性序列。三种吲哚类芥子油苷——芥子 brassicin（glucobrassicin）及其衍生物4-羟基芥子 brassicin 和1-甲氧基芥子 brassicin（新芥子 brassicin，neoglucobrassicin）的峰也实现了清晰分离。需要注意的是，由于在提取物混合过程中加入了根部提取物，该 Brassica 提取物中，新芥子 brassicin（neoglucobrassicin）和芥子 erucin（glucoerucin）以及本样品中唯一的芳香族芥子油苷——芥子 nasturtiin（gluconasturtiin）的峰特别高⁹。

图3：芥子油苷提取物的色谱图 高效液相色谱（HPLC）色谱图的细节（1–32 分钟），源自对根和茎组织混合样品的分析结果 黑芥，芜菁 和 B. oleracea 峰标签表示保留时间及已鉴定去硫酸化硫代葡萄糖苷（GSL）的缩写：PRO = 原告芥素（2-羟基-3-丁烯基 GSL）；RAPH = 萝卜硫素（4-甲基亚砜丁基 GSL）；SIN = 芥子油苷（2-丙烯基 GSL）；GNA = 芥子苷（3-丁烯基 GSL）；4OH = 4-羟基芸苔葡糖苷；IBV = 葡糖苷异伯韦林（3-甲基硫代丙基 GSL）；GBN = 芸苔葡糖苷（4-戊烯基 GSL）；ERU = 芥子油苷（4-甲基硫代丁基 GSL）；GBC = 芸苔葡糖苷（吲哚-3-基甲基 GSL）；NAS = 芥子油苷（2-苯乙基 GSL）；NEO = 新芸苔葡糖苷（1-甲基羟基芸苔葡糖苷）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

长链甲基亚砜基葡糖苷（methylsulfinyl glucosinolates）在模式植物Arabidopsis中常见，也表现出洗脱序列规律，如在Rorippa austriaca的根提取物中所见。色谱图上依次出现葡糖芸苔宁（glucohesperalin，C6）、葡糖芥子宁（glucosiberin，C7）、葡糖毛芥素（glucohirsutin，C8）和葡糖芸苔苷（glucoarabin，C9），呈规律性间隔分布（图4）。结合各峰的紫外光谱，此类具有洗脱序列规律的化合物可用于对未知葡糖苷进行分类和初步鉴定。

图4：Rorippa austriaca 根提取物中脱硫硫代葡萄糖苷的色谱图（9–30 分钟片段）。 峰标注显示了保留时间及已鉴定脱硫硫代葡萄糖苷（GSL）的缩写。HES = 葡萄糖芸香苷（6-甲基亚砜基己基GSL）；SBE = 葡萄糖芥苷（7-甲基亚砜基庚基GSL）；GBC = 葡萄糖莱菔素（吲哚-3-基甲基GSL）；HIR = 葡萄糖毛芥苷（8-甲基亚砜基辛基GSL）；ARA = 葡萄糖阿拉伯苷（9-甲基亚砜基壬基硫代葡萄糖苷）；NEO = 新葡萄糖莱菔素（1-MeOH-葡萄糖莱菔素）。请点击此处查看此图的放大版本。

通用名	侧链结构	Rt (min)*	229 nm	参考文献#
脂肪族硫代葡萄糖苷
Glucocapparin	甲基	3.5	1	Brown
Sinigrin	2-丙烯基	5.5	1	Brown, EC
Gluconapin	3-丁烯基	9.5	1.11	EC
Glucobrassicanapin	4-戊烯基	13.5	1.15	EC
Glucoiberverin	3-甲硫丙基	10.9	0.8	Brown
Glucoerucin	4-甲硫丁基	14.0	0.9	Brown
Glucoiberin	3-甲基亚砜丙基	3.7	1.2	Brown
Glucoraphanin	4-甲基亚砜丁基	4.9	0.9	Brown
Glucoalyssin	5-甲基亚砜戊基	7.6	0.9	Brown
Glucohesperin	6-甲基亚砜己基	10.5	1	Brown
Glucosiberin	7-甲基亚砜庚基	13.5	1	Brown
Glucohirsutin	8-甲基亚砜辛基	16.8	1.1	Brown
Glucoarabin	9-甲基亚砜壬基	20.5	1
Glucocheirolin	3-甲基磺酰丙基	4.2	0.9	Brown
Progoitrin	2(R)-OH-3-丁烯基	4.5	1.09	Buchner, EC
Gluconapoleiferin	2-OH-5-戊烯基	8.3	1	EC
吲哚类硫代葡萄糖苷
4-羟基硫代葡萄糖苷芥	4-羟基吲哚-3-基甲基	11.2	0.28	Buchner, EC
硫代葡萄糖苷芥	吲哚-3-基甲基	15.3	0.29	Buchner, EC
4-甲氧基硫代葡萄糖苷芥	4-甲氧基吲哚-3-基甲基	18.2	0.25	Buchner, EC
新硫代葡萄糖苷芥	1-甲氧基吲哚-3-基甲基	22.5	0.2	Buchner, EC
芳香族硫代葡萄糖苷
Sinalbin	4-羟基苄基	8.1	0.5	Buchner
Glucosibarin	2(R)-OH-2-苯乙基	12.1	0.95	见下一项
Glucobarbarin	2(S)-OH-2-苯乙基	12.7	0.95	Buchner
Glucotropaeolin	苄基	13.8	0.95	Buchner, EC
Gluconasturtiin	2-苯乙基	18.0	0.95	Buchner, EC
未知 - 具有类似脂肪族/芳香族的紫外光谱			1	EC
未知 - 具有类似吲哚的光谱			0.25	EC
* 近似保留时间（Rt）四舍五入至最接近的0.1分钟（±0.3分钟，取决于色谱柱和洗脱液质量）。保留时间在配备C18色谱柱（150 × 4.6 mm，3微米粒径）和C18预柱（10 × 4.6 mm，5微米粒径）的ThermoFisher/Dionex Ultimate高效液相色谱平台上测定，梯度程序如表1所示。
# 响应因子参考文献：Buchner, R.，载于《油菜籽中的硫代葡萄糖苷》（J.P. Wathelet主编），第50–58页（Martinus Nijhoff Publishers, 1987）；Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M. & Gershenzon, J. 拟南芥不同器官及发育阶段中硫代葡萄糖苷积累的变异。Phytochemistry. 62 (3), 471–481, doi:10.1016/S0031-9422(02)00549-6, (2003)；EC. 油料种子—硫代葡萄糖苷的高效液相色谱测定法。欧洲共同体官方期刊。L 170/28. 附件VIII 03.07.27–34 (1990)。

表3：植物提取物中最常见的去硫酸化硫代葡萄糖苷的响应因子及其在C₁₈色谱柱上的近似保留时间。 流动相、梯度洗脱程序、柱温与流速同表1。

讨论

该方法成熟且被广泛使用，其最大优势在于稳定性好、操作相对简单，且每个样品的成本较低。提取和分析所需的大部分设备在标准实验室中都具备，或可自行搭建，仅高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-PDA）除外。另一个优点是，脱硫芥子油苷溶于水后，若保存在低温、密闭的（HPLC）小瓶中，化学性质相当稳定，因此提取物可方便地寄送至其他地方进行HPLC分析。与液相色谱-质谱联用（LC-MS）平台相比，后者需要专门的培训以及丰富的软件操作和数据分析经验，而高效液相色谱-紫外/光电二极管阵列检测器（HPLC-UV/PDA）仅需短期培训即可操作。这不仅降低了操作成本，也使该方法更易于被广大科研人员（包括学生）所采用。

通常情况下，若严格按照上述步骤操作，应极少出现问题。一般而言，色谱图中的芥子油苷峰分离效果良好。若分离不佳，可通过降低洗脱液中乙腈浓度的上升速率来调整梯度程序。 alternatively，更换新的保护柱（200-500次进样后）或色谱柱（1,500-2,000次进样后）也可能解决此问题。有时，同一批次中的个别样品色谱图可能显示峰极小或无峰，这通常是由于添加硫酸酯酶时发生移液误差所致例如， 出现漏列或磺酸酯酶未充分洗脱至柱中）。或者，实验材料中的硫代葡萄糖苷浓度可能低于预期，导致提取所用材料量不足。若为后一种情况，可将进样体积增加至100 µL，或使用精确的等分试样（例如， 800 µL）的提取物可进行浓缩。后者可通过冷冻干燥提取物，然后将残留物溶解于较小体积中实现。例如， 100 µL）水，并使用相同的参考曲线重新进样。在计算提取物原始浓度时，所得数值应乘以稀释倍数。如果此方法仍无法解决问题，则应使用更多起始材料重新提取。若起始材料超过100 mg，应相应增加提取溶剂的体积和试管的规格，以保持提取效率。

另一个优点是该方法已得到充分验证。由于该方法已被描述为油菜籽中芥子油苷定量的标准方法，其操作步骤和准确性已在多个实验室中得到确认¹⁶此外，芥子油苷的遗传背景、生物合成及其生物学功能在模式植物物种中正受到广泛而深入的研究。 拟南芥 以及其他^4,6,12因此，相对于芥子油苷，用于精确量化脱硫芥子油苷的多种响应因子均已明确定义并公开可查。^15,17尽管基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法通量更高、灵敏度更高，并且能够（初步）鉴定尚无标准品的 glucosinolates^18,19,20，液相色谱-质谱法缺乏通用的响应因子，限制了对芥子油苷浓度的准确定量¹⁸此外，这些方法通常不包含冷冻干燥步骤，且在计算中未考虑新鲜植物材料中的含水量，导致准确定量变得困难。最后，由于我们的提取方法包含基于层析柱的纯化和浓缩步骤，因此也可应用于 "脏的" 葡萄糖苷含量较低的样品，例如土壤²¹.

与通常采用新鲜冷冻材料、使用96孔板进行提取且不包含硫酸酯酶步骤的基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法相比^18,19，本方法相对耗时较长且劳动强度较大。借助本文所述的柱架装置，单人每天可处理约100至150个样品。洗脱（次日）、冷冻干燥（过夜）及重新溶解过程可在接下来的两天内完成。若使用自动HPLC进样器，每次进样的运行与平衡时间为40至45分钟，且无意外情况发生，则获取该样本集数据需时3至4天。当HPLC软件支持基于芥子苷标准曲线的自动定量时，对100个样品的色谱图及峰归属进行人工核查可能仅需额外1至2小时，之后数据即可用于统计分析。

尽管芥子油苷标准品的可获得性日益增加，但目前130多种候选化合物中仅有少数可商业购得。然而，若每种生物合成类别均有若干参考文献，并可获取文献数据库中关于此前已在该植物物种中发现的化合物信息，例如， 法黑 等²²）；色谱原理的基础知识，例如洗脱剂系列的原理（例如， 随着脂肪族化合物侧链上Cs数目的增加， 图3 和 4）以及在液相色谱-质谱联用仪上对单个样品进行验证¹⁹ 或分离的芥子油苷在核磁共振波谱中的分析²³，人们可以轻松克服这一限制。大多数芥子油苷分析方案均采用内标标准曲线（即， 一定浓度的芥子油苷或白芥子苷提取溶剂^16,17,19）。原则上，内参标准曲线更适用于校正各样品在处理过程中的个体误差，因此理论上具有更高的精确度。尽管具有这一优势，我们仍倾向于使用五点外参标准曲线，因为我们经常分析不同的野生种，其中一些含有较高水平的芥子油苷（sinigrin）例如，Brassica nigra²⁴）或芥子苷（sinalbin）例如，Sinapis alba²⁵），这两种葡萄糖苷类化合物已有可用的响应因子。此外，由于高纯度的葡萄糖苷类参考标准品通常价格昂贵，向每个样品中添加内标物会增加分析成本。

总之，尽管步骤较为耗时，该方案仍提供了一种简单且易于实施的方法，用于从植物样品中提取并定量芥子油苷。然而需要注意的是，芥子油苷含量本身仅能反映其潜在的生物活性，这种活性依赖于与黑芥子酶的反应，且单一芥子油苷可能产生不同的反应产物¹¹。必须通过验证实验来确认其生物学相关性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于高效液相色谱的甲醇HiPerSolv CHROMANORM®梯度级	VWR	20864.320
乙酸钠（NaOAc）	Sigma-Aldrich	W302406-1KG-K
HCl	VWR	1.09057.1000
Sephadex	Sigma-Aldrich	A25120-10G
（−）-芥子碱水合物 来自山葵	Sigma-Aldrich	S1647-500MG
芳基硫酸酯酶	Sigma-Aldrich	S9626-10KU
乙醇	VWR	20816.298
巴斯德移液管	Carl Roth	4518.1
玻璃棉	Carl Roth	7377.1
玻璃/木棒	VWR	HERE1080766
2 mL反应管	VWR	211-2120
解剖针	Carl Roth	KX93.1
Rotilabo培养皿	Carl Roth	0772.1	废液盘
Rotilabo密封夹	Carl Roth	N217.1
Freezone 12 L冷冻干燥机	Labconco	7960030
乙腈超梯度级	VWR	83639.320
水浴锅	VWR	462-5112
超声波清洗仪	Fisher Scientific	FB 15061
pH电极	Thermo Fisher Scientific	STARA2115
Centrifuge Heraeus Multifuge X1离心机	Thermo Fisher Scientific	75004210
预柱	Thermo Fisher Scientific	69697	C18柱（4.6 × 10 mm，5 µm，300 Å）
Acclaim 300色谱柱	Thermo Fisher Scientific	60266	C18柱（4.6 × 150 mm，3 µm，300 Å）
HPLC Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific		配备柱温箱和紫外或PDA检测器
1,000 mL烧瓶	VWR	215-1595
芥子油苷标准品	Phytoplan	多种	http://www.phytoplan.de/