本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种无需使用生物材料、仅利用细胞进行心脏组织三维生物打印的方法。首先分离、计数心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，并按所需比例混合。将混合后的细胞接种于超低吸附96孔板的各个孔中进行共培养。3天内可形成跳动的球状体。随后，利用真空负压通过喷嘴吸取这些球状体，并使用三维生物打印机将其组装到针阵列上。球状体在针阵列上进一步融合。三维生物打印3天后，可将完整的心脏组织片取出，该组织片已具备自发跳动能力。三维打印的心脏组织片实现了各组成球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病三维模型方面具有广阔前景。
引言
3D 生物打印有多种不同的方法1,2,3。3D 生物打印通常根据打印技术进行分类1，例如喷墨生物打印、微挤出生物打印、激光辅助生物打印、多种方法的组合或更新的技术方法。3D 生物打印也可分为无支架法和依赖支架法4。大多数3D生物打印方法属于依赖支架法，需要使用生物材料，例如 生物墨水5 或支架材料6。然而，依赖支架的3D生物打印面临诸多问题和局限性4,7，例如支架材料的免疫原性、专有生物墨水的成本高昂、打印速度慢以及降解产物的毒性等。
已有研究尝试采用球状体进行无支架心脏组织工程8，以克服依赖支架的组织工程技术存在的上述缺点。然而，正如该论文作者所指出的，在生物制造过程中，稳定地操作和将球状体精确定位于固定位置仍存在困难。结合使用3D生物打印与基于球状体的组织工程技术有望克服这些难题。在本方案中，我们描述了一种仅使用球状体....
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方案
1. 心肌细胞的制备
- 按照已描述的方法10，在包被有基底膜基质的6孔板上培养人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。
- 采用先前所述方法11,12将hiPSCs分化为hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）。
- 分化后第19天，每孔加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，在室温下作用5分钟，以分离心肌细胞。
- 在光学显微镜下观察心肌细胞，监测细胞解离情况。
- 加入2 mL 0.0125%胰蛋白酶抑制剂以中和胰蛋白酶活性。
- 收集分离的心肌细胞，并使用电动移液器将其转移至一个50 mL锥形离心管中。
- 将细胞悬液在室温下以250 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。
- 用5 mL添加了B-27的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基（RPMI/B-27细胞培养基）重悬细胞沉淀。
- 取20 µL细胞悬液，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。
- 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。
2. 成纤维细胞的制备
- 启....
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结果
在步骤 4.4（共培养）结束时，每个孔中的细胞应通过重力作用聚集在超低吸附 96 孔圆底板的底部，形成球状体。这些球状体包含 hiPSC-CM、HCFs 和 HUVECs，可在光学显微镜下进行肉眼观察，其二维投影应呈圆形（图 1）。在步骤 6.3 结束时，3D 生物打印的心脏贴片应存在组织空隙，这是由针阵列穿刺形成的针孔所致（图 2，左图）。此时，球状体之间的边界应变得模糊不清，且贴片应开始自发搏动，表现出球状体之间的机械整合。在步骤 6.5 结束时，组织空隙应被周围组织填充（图 2，右图），同时 3D 生物打印的心脏贴片应持续自发搏动。
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讨论
使用能够搏动的功能性球状体进行3D生物打印至关重要。如果球状体无法搏动，继续使用将 invariably 导致打印出的3D生物补片无功能。
这种方法的一个优点是可以通过改变类球体中心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的总数量及所占百分比，来调控贴片的细胞组成。这使得能够打印出具有不同组织学特性和力学性能的多种类型心脏贴片。
该方法还可用于制备包含不同类型球状体的补片，并可实现具有复杂三维结构的心脏补片的3D生物打印。通过3D生物打印实现精确的球状体定位，可构建出结构复杂的最终三维结构，而通过轻柔旋转悬浮的球状体7或将球状体简单模压成圆柱形三维结构16则难以达到此种复杂程度。
该方法的局限性在于，由于针阵列中针之间的距离固定为400 µm，所形成的球状体直径相对固定，介于450至550 µm之间；此外，若球状体直径过大，可能导致细胞活力下降。补片在从针阵列取出后机械强度较弱，但随着培养.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢以下资助来源：心血管研究 Magic That Matters 基金和马里兰干细胞研究基金（2016-MSCRFI-2735）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| 0.0125% 定义型胰蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI 细胞培养基 | Invitrogen | 11875-093 | 添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基 |
| B-27 添加剂 | Thermo Fisher | 17504044 | 添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基 |
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | |
| 人源心肌成纤维细胞（成年心室型） | Sciencell | 6310 | |
| 人脐静脉内皮细胞 | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface 超低吸附96孔圆底板 | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D 打印机 | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher | 15250061 | |
| 肌钙蛋白 T 抗体 | Thermo Fisher | 701620 | |
| 连接蛋白 43 (Cx43) 抗体 | Chemicon | MAB3068 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36935 |
参考文献
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16
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重印与许可
