利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

摘要

本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。

摘要

本方案描述了一种无需使用生物材料、仅利用细胞进行心脏组织三维生物打印的方法。首先分离、计数心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，并按所需比例混合。将混合后的细胞接种于超低吸附96孔板的各个孔中进行共培养。3天内可形成跳动的球状体。随后，利用真空负压通过喷嘴吸取这些球状体，并使用三维生物打印机将其组装到针阵列上。球状体在针阵列上进一步融合。三维生物打印3天后，可将完整的心脏组织片取出，该组织片已具备自发跳动能力。三维打印的心脏组织片实现了各组成球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病三维模型方面具有广阔前景。

引言

3D 生物打印有多种不同的方法^1,2,3。3D 生物打印通常根据打印技术进行分类¹，例如喷墨生物打印、微挤出生物打印、激光辅助生物打印、多种方法的组合或更新的技术方法。3D 生物打印也可分为无支架法和依赖支架法⁴。大多数3D生物打印方法属于依赖支架法，需要使用生物材料，例如 生物墨水⁵ 或支架材料⁶。然而，依赖支架的3D生物打印面临诸多问题和局限性^4,7，例如支架材料的免疫原性、专有生物墨水的成本高昂、打印速度慢以及降解产物的毒性等。

已有研究尝试采用球状体进行无支架心脏组织工程⁸，以克服依赖支架的组织工程技术存在的上述缺点。然而，正如该论文作者所指出的，在生物制造过程中，稳定地操作和将球状体精确定位于固定位置仍存在困难。结合使用3D生物打印与基于球状体的组织工程技术有望克服这些难题。在本方案中，我们描述了一种仅使用球状体形式的细胞、不添加其他生物材料的3D生物打印心脏组织的方法。

无支架类球体三维生物打印技术⁹能够利用真空负压吸取单个类球体，并将其精确定位于针阵列上。这种在三维生物打印中将类球体定位在针阵列上的构想，灵感来源于日本传统插花艺术“生花”（ikebana）中使用的针阵列（称为"kenzan"）。该系统可实现类球体在任意构型下的精确排布，且各个类球体在短时间内即可融合为一体，形成三维生物打印的组织。因此，该方法使得类球体的操作更加简便，为未来无支架器官生物制造的发展提供了潜在可能。

方案

1. 心肌细胞的制备

1. 按照已描述的方法¹⁰，在包被有基底膜基质的6孔板上培养人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。
2. 采用先前所述方法^11,12将hiPSCs分化为hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）。
3. 分化后第19天，每孔加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，在室温下作用5分钟，以分离心肌细胞。
4. 在光学显微镜下观察心肌细胞，监测细胞解离情况。
5. 加入2 mL 0.0125%胰蛋白酶抑制剂以中和胰蛋白酶活性。
6. 收集分离的心肌细胞，并使用电动移液器将其转移至一个50 mL锥形离心管中。
7. 将细胞悬液在室温下以250 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。
8. 用5 mL添加了B-27的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基（RPMI/B-27细胞培养基）重悬细胞沉淀。
9. 取20 µL细胞悬液，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。
10. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。

2. 成纤维细胞的制备

1. 启动人源心肌成纤维细胞（HCF）（成年心室型）细胞系¹³。
2. 根据HCF培养方案进行传代和分离¹³。
3. 用移液器吸取20 µL含细胞的培养基，并加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。
4. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对新制备的细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。

3. 内皮细胞的制备

1. 按照文献¹⁴所述方法启动人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系，并根据文献¹⁴所述的HUVEC培养方案进行传代和分离。
2. 用移液器吸取20 µL含细胞的培养基，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。
3. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。

4. 共培养：

1. 将三种细胞类型（hiPSC-CM、HCFs 和 HUVECs）混合于 RPMI/B-27 细胞培养基中，在 50 mL 锥形管中制备混合细胞悬液，细胞比例为 hiPSC-CM:HCF:HUVEC = 70:15:15，细胞浓度为每毫升 165,000 个细胞。
2. 使用多通道移液器将混合细胞悬液以每孔 200 µL（即每孔 33,000 个细胞）分配至超低吸附 96 孔圆底板中。
3. 将 96 孔板置于 37°C、5% 二氧化碳、95% 湿度条件下培养 3 天。
4. 在光学显微镜下观察各孔底部中央是否存在混合细胞多细胞球体。
   注意：在二维显微投影中，这些球体呈圆形（图 1）。细胞接种至超低吸附 96 孔板后 24 小时内应形成球体，48 小时内应开始搏动。未出现搏动的球体不应用于 3D 生物打印，以确保最终生成的 3D 生物打印心肌补片具有功能活性。可对球体进行连接蛋白 43（Cx43）和肌钙蛋白的免疫荧光染色，以评估球体的细胞组成与质量¹⁵。

5. 无支架心脏组织的3D生物打印

1. 将含有球状体的培养板装入无支架球状体三维生物打印机的载片架中。
2. 开启三维生物打印机，并运行三维生物打印软件。
   1. 依次点击 "Auxillary"、"Operation Preparation"、"Inspect Mode"，然后点击 "Home Return"。
   2. 点击 "Start" 下方的绿色图标，开始球状体检测。
   3. 观察屏幕上 "(2) Dia (µm)" 列下显示的球状体直径。
3. 为估算最接近的100 µm的平均球状体直径，点击 "Initial settings"，并将平均球状体直径输入至 Stack Z pitch (µm) 中。
4. 点击 "Total"，"Layers" 下的数值应自动重新调整。点击 "Apply" 以确认设置。
5. 点击 "Needle Array Map"，进入 "Layer No."，选择所需的三维生物打印层，并通过选择单个球状体位置，在屏幕左侧的地图上绘制所需的三维生物打印设计。点击 "Apply" 以确认三维生物打印设计。
6. 点击 "Needle Array Check" 开始针阵列检测。若针阵列失焦，请在 "OffsetZ (µm)" 中输入0至500 µm之间的数值以调整相机焦距，建议从500 µm开始，每次递减100 µm直至0 µm。
7. 点击 "Inspection Parameters"、"Type 1"，并设置 "Diameter (µm)" 为所需的直径范围。将 "Roundness (%)" 和 "Smoothness (%)" 设置为所需的百分比值。点击 "Apply" 以确认设置。
   注：此处球状体直径设置为450 µm至550 µm。"Roundness (%)" 和 "Smoothness (%)" 是计算机对每个单独球状体的评估参数。此处 "Roundness (%)" 设置为60%，"Smoothness (%)" 设置为70%。
8. 点击 "Presence"，并将 "Diameter (µm)" 更新为与上一步相同的设置。点击 "Apply" 以确认设置。
9. 点击 "Stack Mode"，然后点击 "Start" 下方的绿色图标，启动三维生物打印机喷嘴通过真空吸力拾取球状体，并将其精确放置于针阵列中的指定位置。
   注：对于由81个球状体（9×9）组成的 cardiac patch，三维生物打印过程大约需要20至30分钟。
10. 打印完成后，使用无菌镊子夹取含有三维生物打印组织片的针阵列，转移至盛有150 mL RPMI/B-27 细胞培养基的250 mL无菌烧杯中。
11. 将带有针阵列的三维生物打印组织片在37°C、5%二氧化碳、95%湿度条件下孵育3天。

6. 从针阵中取出3D生物打印补片及补片成熟

1. 孵育 3 天后，一手握住针阵列的底部，另一手放在补片下方的塑料盖上，轻轻向上滑动塑料盖，将 3D 生物打印补片从针阵列上取下。
   注意：如有需要，可在执行此步骤前用磷酸盐缓冲液（PBS）对针进行润滑，以便更顺畅、更容易地取下。
2. 使用无菌镊子夹起带有 3D 生物打印补片的塑料盖，将补片和塑料盖一起转移至含有 RPMI/B-27 细胞培养基的 35 mm 培养皿中。
3. 用镊子夹住塑料盖，在 RPMI/B-27 细胞培养基中轻轻晃动带有补片的塑料盖，使补片脱离并释放到培养基中。
4. 在光学显微镜下检查 3D 生物打印补片，观察其是否跳动，以确认该 3D 生物打印补片具有功能。
5. 将 3D 生物打印补片置于 35 mm 培养皿中继续孵育 3 天或更长时间（37°C，5% 二氧化碳，95% 湿度）。
   注意：3 天后，球状体将融合在一起，补片中原本针穿过的孔洞应不再可见。

结果

在步骤 4.4（共培养）结束时，每个孔中的细胞应通过重力作用聚集在超低吸附 96 孔圆底板的底部，形成球状体。这些球状体包含 hiPSC-CM、HCFs 和 HUVECs，可在光学显微镜下进行肉眼观察，其二维投影应呈圆形（图 1）。在步骤 6.3 结束时，3D 生物打印的心脏贴片应存在组织空隙，这是由针阵列穿刺形成的针孔所致（图 2，左图）。此时，球状体之间的边界应变得模糊不清，且贴片应开始自发搏动，表现出球状体之间的机械整合。在步骤 6.5 结束时，组织空隙应被周围组织填充（图 2，右图），同时 3D 生物打印的心脏贴片应持续自发搏动。

讨论

使用能够搏动的功能性球状体进行3D生物打印至关重要。如果球状体无法搏动，继续使用将 invariably 导致打印出的3D生物补片无功能。

这种方法的一个优点是可以通过改变类球体中心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的总数量及所占百分比，来调控贴片的细胞组成。这使得能够打印出具有不同组织学特性和力学性能的多种类型心脏贴片。

该方法还可用于制备包含不同类型球状体的补片，并可实现具有复杂三维结构的心脏补片的3D生物打印。通过3D生物打印实现精确的球状体定位，可构建出结构复杂的最终三维结构，而通过轻柔旋转悬浮的球状体⁷或将球状体简单模压成圆柱形三维结构¹⁶则难以达到此种复杂程度。

该方法的局限性在于，由于针阵列中针之间的距离固定为400 µm，所形成的球状体直径相对固定，介于450至550 µm之间；此外，若球状体直径过大，可能导致细胞活力下降。补片在从针阵列取出后机械强度较弱，但随着培养...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Geltrex	Invitrogen	A1413202
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Thermo Fisher	15400054
0.0125% 定义型胰蛋白酶抑制剂	Thermo Fisher	R007100
RPMI 细胞培养基	Invitrogen	11875-093	添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基
B-27 添加剂	Thermo Fisher	17504044	添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10227
人源心肌成纤维细胞（成年心室型）	Sciencell	6310
人脐静脉内皮细胞	Lonza	CC-2935
PrimeSurface 超低吸附96孔圆底板	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D 打印机	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
0.4% 台盼蓝溶液	Thermo Fisher	15250061
肌钙蛋白 T 抗体	Thermo Fisher	701620
连接蛋白 43 (Cx43) 抗体	Chemicon	MAB3068
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher	P36935