本文介绍了一种利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子，结合活细胞视频显微镜和流式细胞术，实时评估原代人免疫细胞抗真菌活性的实验方案。所获得的数据可揭示宿主细胞与Aspergillus之间的相互作用，包括杀菌活性、吞噬作用、细胞迁移以及对真菌生长的抑制等过程。
本文内容
摘要
摘要
Aspergillus fumigatus 是一种机会性真菌病原体，在免疫功能低下宿主中可引起侵袭性感染，且病死率较高。体外检测特定免疫细胞抗真菌活性的一致且可靠的检测方法的缺乏，限制了针对 A. fumigatus 免疫应答的研究。本文描述了一种新方法，利用荧光曲霉报告菌（FLARE）分生孢子评估来自人供体的原代单核细胞和中性粒细胞对 A. fumigatus 的抗真菌活性。这些分生孢子含有一种基因编码的dsRed报告蛋白，活的FLARE分生孢子可组成性表达该蛋白；同时其表面标记了Alexa Fluor 633，该染料在吞噬溶酶体内具有抗降解性，从而可区分活的与死亡的 A. fumigatus 分生孢子。随后通过视频显微镜和流式细胞术观察分生孢子与天然免疫细胞之间的相互作用，在评估杀真菌活性的同时，还可获得关于吞噬细胞迁移、吞噬作用以及真菌生长抑制的大量信息。这一新技术已为原代免疫细胞与 A. fumigatus 之间宿主-病原体相互作用提供了令人振奋的新见解。值得注意的是，实施该检测所需的实验室条件，包括必要的显微镜和流式细胞术设备，以及处理人供体血液和基因改造真菌的能力。然而，该检测能够产生大量数据，并可深入揭示抗真菌免疫应答的细节。本方案已成功用于研究原代免疫细胞与 A. fumigatus 之间的宿主-病原体相互作用。
需要注意的是，进行本实验所需的实验室配置，包括必要的显微镜和流式细胞术设备，以及处理人源血液和基因改造真菌的能力。然而，该实验能够产生大量数据，并可揭示抗真菌免疫反应的详细信息。本方案已成功用于研究原代免疫细胞与A. fumigatus之间的宿主-病原体相互作用。
引言
Aspergillus fumigatus 是一种机会性真菌病原体，也是免疫功能低下宿主发生侵袭性肺部感染最常见的真菌病因1,2。了解宿主免疫细胞如何识别并清除Aspergillus是真菌研究的重要领域，然而目前可用的杀菌活性检测方法存在显著局限性。常用的杀菌活性检测方法包括比色法和菌落形成单位测定3,4。但这些方法仅能提供单一时间点的真菌存活信息，而无法观察宿主与病原体之间的动态相互作用。因此，这些方法无法区分真菌是被杀死，还是其生长或代谢活性仅受到抑制（暂时性抑制）。我们开发了一种能够直接观察杀菌活性的方法，同时可详细记录吞噬作用、吞噬细胞迁移以及真菌生长抑制的信息。
此前，已发表一项利用实时成像技术来测量吞噬作用的实验方案 白色念珠菌 由一种小鼠巨噬细胞系5这一概念现已得到进一步发展，以弥补我们对相关知识空白的理解 曲霉属 利用荧光与免疫细胞相互作用 曲霉属 REporter (FLARE) 分生孢子6,7,8这些分生孢子表达一种红色荧光蛋白（dsRed），并标记有第二种荧光染料（Alexa Fluor 633）。当FLARE分生孢子死亡后，其停止产生dsRed，残留的dsRed荧光逐渐减弱，而AF633仍保持荧光并稳定结合在分生孢子上。这在活细胞成像和流式细胞术中可清晰区分活与死的真菌细胞，并能够追踪单个分生孢子在与免疫细胞相互作用后的命运。
所述检测方法可有效可视化宿主免疫细胞与Aspergillus之间的相互作用，对于解析天然免疫细胞中抗真菌效应机制所涉及的细胞信号通路具有重要价值。其他应用包括可视化Aspergillus生长状态的变化（例如从静止分生孢子转变为肿胀分生孢子，或从肿胀分生孢子转变为菌丝）如何影响吞噬细胞的识别与功能。
以下方案详细描述了如何获取人单核细胞和中性粒细胞；如何制备FLARE分生孢子；以及如何利用视频显微镜和流式细胞术捕捉它们的反应。尽管本文描述的是从供体血液中分离的人免疫细胞的使用方法，但该技术在使用多种小鼠细胞群体时同样有效。
方案
获取中性粒细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的实验方案基于先前发表的方法9。使用健康志愿者血液样本的研究已获得阿伯丁大学人类研究伦理委员会的批准。在开始实验前，请确保已获得从健康志愿者和/或患者采集血液样本用于本实验描述目的的全部伦理审批。尽可能将细胞置于冰上以提高其存活率。
1. A. fumigatus 培养与培养条件
- 按文献所述方法制备葡萄糖最低限度琼脂培养基10。
- 使用 1 M NaOH 将培养基 pH 调至 6.5，并在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
- 冷却至 65 °C。
- 在无菌操作台中，将 30 mL 冷却后的培养基倒入 T75 培养瓶中，将瓶口置于一支 25 mL 移液管上，使其形成斜面并冷却凝固。
- 将 dsRed Af293-A. fumigatus 菌株划线接种于琼脂斜面上，在 37 °C 及 5% CO2 条件下培养 7 天。两个培养瓶可获得约 109 个分生孢子（悬浮于 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，标记生物素前）。
2. A. fumigatus 标记与制备
注意：首次进行此实验时，需准备亲本Af293-A. fumigatus菌株。将两种菌株分别取样至微量离心管中，并仅对每种菌株中的一管按以下说明进行标记。这样可获得无颜色的对照分生孢子，以及单一颜色（dsRed或AF633）的分生孢子，用于测试实验设置和仪器设备。
- 通过加入 30 mL PBS + 0.05% Tween-80 浸没培养物来收获 A. fumigatus 分生孢子。将所得悬液经 40 µm 细胞筛过滤至 50 mL 离心管中，以去除菌丝碎片。
- 以 805 × g 离心 10 分钟，弃上清液，并用 20 mL 无菌 PBS 洗涤一次。在洗涤步骤中合并来自两块相同菌株平板的分生孢子。
- 洗涤后，将沉淀重悬于 5 mL PBS 中，并将 1 mL 分生孢子悬液分装至微量离心管中。每种菌株通常取 1 mL 悬液即可用于活细胞成像。将剩余分装样品用铝箔包裹，于 4 °C 保存。
- 将分生孢子悬液分装样品在室温下以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL 0.05 M NaHCO3（pH 8.3）中。
- 通过将 25 mg 生物素溶于 500 µL 二甲基亚砜（DMSO）配制 10 mg/200 µL DMSO 储存液。向微量离心管中加入 10 µL 生物素/DMSO 储存液，用铝箔包裹，在 4 °C 摇床上孵育 2 小时。
- 将剩余的生物素/DMSO 储存液分装后于 -20 °C 冻存，以供后续实验使用。
- 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）中，孵育 1 小时以灭活游离生物素。
- 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。用 1 mL 无菌 PBS 洗涤沉淀两次，最后将沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
- 将 1 mg 链霉亲和素-AF633 溶于 0.5 mL PBS 中，配制成 2 mg/mL 储存液。每 1 mL 分生孢子悬液中加入 10 µL 2 mg/mL 链霉亲和素-AF633，于室温在铝箔包裹的摇床上孵育 40 分钟。剩余的链霉亲和素-AF633 可分装后冻存，用于后续实验。
- 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL PBS 中，使用血细胞计数板在 1:1,000 稀释度（先 1:100，再 1:10）下计数分生孢子。用不含 CO2 的培养基将分生孢子浓度调整至 3.6 × 106/mL，用铝箔包裹后于 4 °C 保存。
注：此时分生孢子已标记 AF633，后续称为 FLARE 分生孢子。 - 可选步骤：若需使用膨胀分生孢子进行刺激，在完成分生孢子计数（步骤 2.9）后，将分生孢子用酵母氮源基础（YNB）培养基稀释至 7.2 × 106/mL，并将 500 µL 分生孢子悬液加入含 4.5 mL YNB 培养基的灭菌 50 mL 锥形瓶中。盖好瓶口，置于摇床培养箱中（37 °C，200 rpm）孵育 6 小时。
- 将培养液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 805 × g 离心 10 分钟，用 PBS 洗涤一次。再次离心后，将沉淀重悬于 1 mL 不含 CO2 的培养基中，得到浓度为 3.6 × 106 个分生孢子/mL 的悬液。
注意：分生孢子在膨胀后常发生聚集，导致准确计数困难，建议根据初始静止状态分生孢子的计数结果进行计算。
- 将培养液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 805 × g 离心 10 分钟，用 PBS 洗涤一次。再次离心后，将沉淀重悬于 1 mL 不含 CO2 的培养基中，得到浓度为 3.6 × 106 个分生孢子/mL 的悬液。
3. 人中性粒细胞和单核细胞的分离
- 从健康志愿者体内抽取20 mL静脉血，分别加入两支含有乙二胺四乙酸（EDTA）的10 mL采血管中。针对每位供体，将20 mL血液转移至50 mL离心管中，并加入15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
- 用注射器和铁针将15 mL淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）注入血液下方。将针头置于试管底部，缓慢推出淋巴细胞分离液。以630 × g离心20分钟，不启用刹车，加速度设为低。
- 配制预冷的 PBS，置于冰上。
注意：步骤 3.4 和 3.5 必须同时进行，以分别生成单核细胞（3.4）和中性粒细胞（3.5）。 - 使用移液管收集PBMC层。该层位于黄色血清（上层）与透明淋巴细胞分离液（下层）之间的中间层，将其转移至一个新的50 mL离心管中。
- 将PBMC用预冷的PBS补至50 mL，于582 × g离心10分钟。弃上清，用预冷的PBS洗涤两次，每20 mL初始献血者血液使用1 mL PBS重悬。
- 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 通过将26 mL热灭活的胎牛血清（FCS）和2.1 mL 0.5 M EDTA加入500 mL HBSS中，配制缓冲液。将细胞以515 × g离心10分钟，并按每1 × 10⁶个细胞加入40 µL缓冲液的比例重悬细胞。7 细胞
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，每1 × 10⁷个细胞加入10 µL CD14磁珠7 细胞，充分混匀，在 4 °C 孵育 15 分钟，每 5 分钟轻柔混匀一次。
- 通过每 1 x 10⁶ 个细胞加入 1 mL 缓冲液洗涤细胞7 细胞，515 × g 离心 10 分钟。
- 吸弃上清液，完全去除后重悬至最多 1 x 108 500 µL 缓冲液中的细胞
- 每个样本放置一列于磁性分离器上，具体操作请参照制造商说明书。首先用500 µL缓冲液对柱子洗涤一次。
- 用移液器将500 µL细胞悬液通过柱子，待柱子干燥后，用缓冲液重复此操作三次进行洗涤。
- 将新的15 mL离心管置于柱下方，从磁力分离器上取下分离柱，然后用1 mL缓冲液将细胞从柱中冲洗至离心管中。
- 加入4 mL缓冲液，515 × g离心10分钟，然后重悬于1 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中。
- 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 将细胞浓度调整至 6 x 105/mL RPMI 培养基重悬，取 200 µL 接种于 35 mm 玻璃底成像培养皿中，37 °C、5% CO₂ 条件下培养过夜2.
- 第二天成像前，移除 RPMI 培养基，并加入 200 µL CO₂2 独立培养基
注意：这些单核细胞在成像前也可分化为多种巨噬细胞亚群。若拟探索该技术，建议以 Ohradanova-Repic 近期发表的论文作为良好起点 等11.
- 收获PBMC层后，移除所有血清和大部分淋巴细胞分离液，但需小心不要移去红细胞沉淀物顶部的白色薄层，因为其中含有大部分中性粒细胞。
- 通过加入83 g NH₄Cl，配制10倍浓缩的低渗裂解缓冲液储备液4Cl 和 10 g KHCO₃3 在1升无菌水中。4 °C保存。
- 将该储备液用无菌水稀释10倍后加入各试管中。然后轻轻颠倒混匀3次，置于冰上孵育15分钟。
- 在冰上以 394 x g 离心 10 分钟，然后在低渗裂解缓冲液中重悬 10 分钟。
- 在 394 × g 条件下离心，并用冷的 PBS 洗涤两次。重悬于 1 mL CO2 每位供体独立的培养基
- 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 进行流式细胞术时，将浓度调整至 6 x 105/mL，取400 µL细胞悬液加入24孔板中。用于显微镜观察时，取200 µL相同细胞悬液加入35 mm玻璃底成像培养皿中。
注意: 由于中性粒细胞在未受刺激时易于发生凋亡，因此应立即进行成像或流式细胞术检测。若无法立即检测，应将中性粒细胞置于冰上保存，并尽快使用（限当日内）。
4. 流式细胞术
- 向24孔板中的细胞加入200 µL浓度为1.2 × 106/mL的FLARE分生孢子，然后加入100 µL浓度为20 µg/mL的伏立康唑。加入300 µL RPMI培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育16小时。
注意：添加伏立康唑以防止分生孢子萌发。 - 向每孔加入25 µL浓度为1 mM的Calcofluor-white储备液，使终浓度为25 µM，在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。
- 以582 × g离心10分钟，弃去上清液，并用PBS洗涤两次。
- 为收集贴壁细胞（单核细胞），向每孔加入含3 mM EDTA的1 mL PBS，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。用移液器轻柔吹打使细胞脱离培养板，并将细胞收集至离心管中。
- 用FACS缓冲液（PBS中含2%胎牛血清）洗涤一次，然后重悬于FACS缓冲液中进行流式细胞术分析。
- 进行流式细胞术分析时，首先使用单色补偿管（包括无荧光标记的分生孢子：dsRed+分生孢子、AF633+分生孢子和Calcofluor White+分生孢子（按步骤4.2制备））调整流式细胞仪的补偿参数，并设定阳性门控。
- 根据前向散射光和侧向散射光设置游离分生孢子门控（使用无荧光标记的分生孢子），再通过排除游离分生孢子门控范围来设定细胞门控。
- 记录10,000个事件以分析样本管。
注意：与活分生孢子结合的细胞将呈dsRed+和AF633+；与死亡分生孢子结合的细胞仅呈AF633+；未与分生孢子相互作用的旁观细胞则为dsRed-和AF633-。进一步通过Pacific Blue通道检测Calcofluor White染色情况，分析与分生孢子结合的细胞群体。位于细胞外的分生孢子呈Calcofluor White+，而已被内化的分生孢子则呈Calcofluor White-。
5. 活细胞视频显微镜技术
注意：显微镜的选择将取决于本地可用的设备，但显微镜配置需包含倒置镜台、维持在37 °C的环境培养室，以及适用于dsRed（532/561 nm）和AF633（633 nm）的相应激发/发射滤光片。 FLARE 分生孢子在检测 dsRed 时不能使用 488 nm 激光替代 532/561 nm 激光。首次进行本实验时，应使用无荧光标记及单色标记的对照分生孢子，以检测 dsRed 与 AF633 通道之间的背景荧光及荧光串扰。
- 实验前打开显微镜加热器，并留出足够时间使环境控制腔室升温至 37 °C。不同显微镜系统的腔室温度稳定所需时间可能有所不同。
- 打开显微镜和计算机，启动成像软件。将成像培养皿安装到显微镜载物台上，并调节焦距以找到人中性粒细胞或单核细胞。
- 对于 dsRed 和 AF633，将采集设置中的激光功率设为 10%，曝光时间设为 1 秒。
- 取下成像载片，向相应孔中加入 100 µL 浓度为 3 × 106/mL 的 FLARE 分生孢子悬浮液（每孔总体积为 300 µL）。记录 FLARE 分生孢子加入培养皿的时间。
- 将载片放回载物台，调节 dsRed 和 AF633 的相机灵敏度，以清晰观察分生孢子但不使图像过曝。如需多点采集，设置载物台点位列表。
- 当所有点位均已聚焦、各通道参数优化完毕，且循环时间和成像持续时间设定后，开始成像。成像的循环时间和持续时间取决于具体实验问题。目标是使循环时间尽可能短（≤2 分钟），1 分钟的循环时间可支持对吞噬动力学进行深入分析。
结果
以下展示的是按照所述实验方案获得的代表性结果。图1 显示了一段代表性的人类中性粒细胞与FLARE分生孢子共孵育6小时的活细胞成像视频。分生孢子自身表达dsRed（红色），同时被AF633（品红色）标记。
图2 是与 图1 所示类似的动态影像中单个时间点的图像，用于说明活体与死亡FLARE分生孢子之间的差异。死亡的分生孢子因失去dsRed（红色）信号但仍保留明亮的AF633（品红色）荧光，从而可与活体分生孢子区分开来。A. fumigatus 分生孢子常可在吞噬细胞内存活超过6小时。因此，为了有效量化杀伤效果，图3 展示了16小时孵育期的流式细胞术图谱。该数据以肺泡巨噬细胞系为例获得，但也可使用任何其他细胞类型进行实验。图4 展示了人中性粒细胞在刺激后第一小时内的迁移情况，以及其迁移速度和定向运动。图5 显示了吞噬了1、2、3个或更多分生孢子的中性粒细胞和单核细胞所占的百分比，而 图6 则展示了发育为菌丝的分生孢子数量。
图 1：人中性粒细胞与 FLARE 分生孢子的活细胞视频显微成像。从中性粒细胞从人血液中分离后，与 FLARE 分生孢子以 1:3 的比例共同接种于 CO2 无关培养基中。成像实验在 37 °C 下立即使用转盘共聚焦显微镜开始。在 6 小时内，以 1 分 55 秒的时间间隔采集图像。比例尺 = 10 µm。放大视频分别显示各通道，以明确 FLARE 分生孢子的作用：左上为 DIC，右上为 dsRed（红色），左下为 AF633（绿色），右下为合并视频。请点击此处下载该视频。
图 2：单时间点图像，展示活体与死亡 FLARE 分生孢子之间的差异。人中性粒细胞经 FLARE 分生孢子刺激后，使用转盘共聚焦显微镜成像，并从生成的视频中截取图像。死亡分生孢子通过失去 dsRed 信号（红色：右上）但仍保留 AF633 荧光信号（绿色：左下）与菌丝区分开来。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：烟曲霉（A. fumigatus）分生孢子吞噬与杀伤作用的定量分析与验证。 将小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）与 FLARE 分生孢子以 1:1 的比例在伏立康唑存在下共孵育 16 小时。与活孢子相关的 MH-S 细胞显示在红色门控区域（dsRed+AF633+），与死孢子相关的 MH-S 细胞显示在蓝色门控区域（dsRed-AF633+），旁观者 MH-S 细胞显示在金色门控区域。Calcofluor White 是一种不可穿透细胞膜的荧光染料，可结合真菌细胞壁，用于区分细胞外分生孢子（Calcofluor White+）和细胞内分生孢子（Calcofluor White-）。为对本方法进行额外验证，结果显示，使用 2 µM 细胞松弛素 D 处理可抑制 MH-S 细胞对分生孢子的摄取。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：人中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus分生孢子的迁移作用。从中性粒细胞从人血液中分离后，与FLARE标记的分生孢子以1:3的比例共同接种于CO2非依赖性培养基中。使用旋转盘共聚焦显微镜在37 °C条件下立即开始成像，每1分55秒采集一次图像，持续6小时。通过手动追踪软件，对每个视野中所有单个中性粒细胞相对于静止（A）和膨胀（B）分生孢子的迁移情况进行1小时的追踪。数据代表同一供体每种条件下的一帧细胞图像。使用相同软件进一步量化了迂回系数（C，用于衡量定向运动能力）和迁移速度（D）。结果显示了3名供体的平均值±标准误（SEM），每名供体分析30个细胞，共进行2次独立实验。*：p < 0.05（经Welch校正的t检验）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：人类中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus分生孢子的吞噬作用。从中性粒细胞和单核细胞从人血中分离后，分别以1:3的比例与FLARE标记的分生孢子共同接种于CO2非依赖性培养基中。实验在37 °C条件下立即使用旋转盘共聚焦显微镜开始成像。图像采集间隔为1分55秒，持续6小时。吞噬作用通过刺激4小时后含有FLARE标记分生孢子的细胞比例来衡量。数据来自两次独立实验，包含3名供体，每名供体取3个视野，以均值±标准误表示。请点击此处查看该图的高清版本。
图 6：中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus分生孢子萌发的抑制作用。从中人血液中分离中性粒细胞和单核细胞，并分别以1:3的比例与FLARE分生孢子共同接种于无CO2培养基中。使用旋转盘共聚焦显微镜在37 °C条件下立即开始成像，每1分55秒采集一次图像，持续6小时。通过测定共培养2、4和6小时后萌发的分生孢子百分比来评估真菌萌发的抑制情况。数据来自两次独立实验，每项实验包含3名供体，每名供体分析3个视野，以均值±标准误表示。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该方法描述了一种创新的 体外 研究人类原代吞噬细胞抗真菌活性的方法 A. fumigatus 使用荧光 曲霉属 REporter（FLARE）分生孢子、活细胞成像和流式细胞术。先前的研究已证明使用FLARE分生孢子的附加价值 体内 在小鼠实验性真菌感染中 体外 抗真菌免疫评估6,7将FLARE分生孢子与这种新一代活细胞成像技术相结合，可建立一种用于在动态相互作用过程中测量单个分生孢子活力的实验体系。 体外.
所述方法有可能深入研究免疫细胞特定细胞过程在其抗真菌反应中的具体作用和重要性。此外，还可更详细地评估免疫系统中存在特定单一组分缺陷的患者其吞噬细胞的抗真菌反应。通过长达6小时的连续成像，可对非常早期的初始抗真菌反应进行细致研究。该方法能够检测出细微差异，例如吞噬细胞向真菌迁移的速度、内化速率以及杀菌事件的动力学特征12，而这些差异在传统吞噬作用检测方法中难以分辨。
任何细胞类型均可使用此方法；此处选用的细胞类型是因为这些吞噬细胞构成了人体呼吸道抵御病原体的第一道和第二道防线 A. fumigatus13有趣的是，单核细胞与中性粒细胞在识别静止态和肿胀的分生孢子及菌丝时表现出极为明显的差异。单核细胞几乎不向分生孢子迁移，而中性粒细胞则表现出更强的迁移活性。本实验还可加入其他荧光标记物，例如免疫细胞的活-死染色标记，以探究吞噬细胞在与真菌结构相互作用后的存活情况 曲霉属该技术未来潜在的有趣应用包括不同宿主细胞类型的共培养，以及对抗真菌反应的影响（例如，上皮单层上的巨噬细胞，单核细胞来源的树突状细胞与中性粒细胞共培养），以及刺激后活性氧生成或中性粒细胞胞外诱捕网形成的实时检测 曲霉属.
使用本方案时需注意以下几点，首先是所需的实验室配置：配备倒置显微镜、可稳定维持在 37 °C 的环境培养箱，以及适用于 dsRed（532/561 nm）和 AF633（633 nm）的激发/发射滤光片。由于成像时间较长，应定期监测显微镜保持细胞聚焦的能力以及浸油物镜的稳定性（在多点采集过程中尤为重要）。如需定量分析真菌杀灭活性，则需要具备流式细胞术检测条件。此外，开展健康供体和患者来源血液样本以及基因改造真菌的相关实验前，必须获得相应的机构许可和伦理审批。强烈建议使用新鲜血液样本（当日采集当日使用），以提高细胞存活率并维持其功能活性。理想情况下，应在采集血液后立即进行细胞分离，并在分离后立即对中性粒细胞进行成像观察。
总之，这是一种用于详细评估吞噬细胞抗真菌活性的下一代活细胞成像技术 A. fumigatus 如上所述。该技术可为早期先天免疫防御中单个细胞与真菌相互作用提供独特见解 曲霉属.
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了英国医学研究理事会（MRC）和阿伯丁大学（MRC医学真菌学中心）以及惠康基金会战略奖——医学真菌学与真菌免疫学（SFB、JMB、JK、AW）的支持。特别感谢Chloe基金提供的支持。TMH获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号RO1 093808）的资助，纪念斯隆-凯特琳癌症中心获得了NIH资助P30 CA008748的支持。此外，TMH还获得伯勒斯·威康基金资助的传染病发病机制研究项目的资助。我们谨向阿伯丁显微镜与组织学平台提供帮助和支持表示感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甘油 | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 培养瓶 | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| 吐温-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm 滤膜 | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon 管 | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon 管 | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | 纳米纯水具有类似效果。http://www.merckmillipore.com/ |
| 生物素 | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| 链霉亲和素-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | 截至目前，AF633 是唯一经测试后在吞噬体中仍可见的荧光染料。https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA 抗凝采血管 | Greiner Bio-One | 455036 | 任何含抗凝剂的采血管均可使用；我们更偏好此方法，因其可获得高纯度单核细胞且操作简便。http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 磁珠 | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | 也可使用其他单核细胞分离方法；我们更偏好此方法，因其可在无需繁琐操作的情况下获得稳定高纯度的单核细胞。http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS 柱 | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | 参见 CD14 磁珠注释。http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 无需依赖的培养基 | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | 若成像过程中 CO2 交换不足时必需使用。https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 孔玻璃底培养皿 | Ibidi | 80827 | 这是我们所使用的成像培养皿，但任何尺寸合适的玻璃底成像培养皿均可使用。http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D 活细胞成像系统 | Perkin Elmer | L7267000 | 包含用于图像采集与分析的 Volocity 软件。http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor White | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| 伏立康唑 | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | 所使用的流式细胞仪。https://www.bdbiosciences.com/ |
参考文献
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196(2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912(2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940(2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55(2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
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