本方案可使研究人员分离并鉴定从饮食诱导的代谢紊乱模型中提取的各种典型炎症组织中的组织驻留巨噬细胞。
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摘要
摘要
肥胖会促进一种慢性炎症状态，这种状态主要由组织驻留型巨噬细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞介导。饮食诱导的肥胖（DIO）是研究巨噬细胞异质性作用的有价值模型；然而，从炎症组织中获得足够数量的巨噬细胞分离物十分困难。在本方案中，我们概述了基于我们研究所得的分离步骤及必要的故障排除指南，用于在小鼠接受18周高脂（HFD）或高脂/高胆固醇（HFHCD）饮食干预后，获取合适的组织驻留型巨噬细胞群体。本方案聚焦于肥胖与动脉粥样硬化研究中的三个标志性组织：肝脏、白色脂肪组织（WAT）和主动脉。我们强调了流式细胞术的双重应用如何实现对组织驻留型巨噬细胞的分离与表征的新维度。本方案的一个基础部分阐述了组织特异性酶消化与巨噬细胞分离的复杂细节，以及后续用于流式细胞分析的细胞表面抗体染色。本方案还针对荧光激活细胞分选（FACS）中存在的现有复杂性问题进行了说明，并提供了解析，以便从充分分选的细胞群体中获得广泛范围的表征结果。此外，方案中包含了用于细胞分选的替代富集方法，例如针对致密肝脏组织的方法，从而在使用FACS时提高灵活性并优化时间管理。简而言之，本方案有助于研究人员在特定研究中评估多种炎症组织中的巨噬细胞异质性，并提供了已被证实有效的故障排除建议，以实现DIO介导炎症中免疫细胞的高效分离与表征。
引言
小鼠模型已被广泛用于研究人类疾病的动态过程。从处于疾病状态的小鼠中正确分离组织驻留细胞，可为理解疾病发病机制中的分子和细胞贡献提供平台1。其中一种至关重要的疾病是肥胖症。肥胖症的发病率在全球范围内持续上升，同时伴随胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病和脂肪肝病的发生2,3。过量的营养摄入与体力活动减少共同作用，引发脂肪组织发出异常信号，进而改变其他外周组织（如主动脉和肝脏）的细胞微环境4。这种代谢稳态的破坏导致慢性低度全身性炎症5。
已发现，主动脉和肝脏中常驻巨噬细胞的经典活化及其向白色脂肪组织（WAT）的募集，不仅会引发代谢信号的失调，还会持续促进炎症反应6,7。巨噬细胞在表型和功能上的异质性与肥胖相关共病的发生机制密切相关7。巨噬细胞极化具有动态可塑性，使其能够表现出多种活化表型，从而协调炎症的发生与消退过程8。经典活化的（M1）巨噬细胞参与炎症的延续，而替代性活化的（M2）巨噬细胞则与炎症消退及组织修复相关9,10。
当机体经历代谢应激时，白色脂肪组织会异常积聚。扩张的脂肪组织会募集并滞留炎性细胞，这些细胞显著改变正常脂肪细胞的功能，促进胰岛素抵抗、高血糖，最终导致2型糖尿病、胰岛素抵抗或高血糖11,12。与此同时，白色脂肪组织会响应浸润的、经典活化的（M1型）脂肪组织巨噬细胞（ATMs）所释放的炎症信号而发生重塑13,14。这一多细胞器官会释放一系列信号，破坏其他器官（如主动脉和肝脏）的正常功能4。
肝脏是一个代谢中枢器官，能够响应来自邻近功能失调的白色脂肪组织（WAT）的刺激而发生适应性变化15。肝内巨噬细胞（即库普弗细胞）在代谢变化的刺激下，会分泌促炎性细胞因子，从而改变实质性和非实质性肝细胞的表型，并促进组织重塑。肝脏脂质积聚、炎症反应、过量的细胞外基质沉积、坏死以及最终的功能丧失，均继发于持续的炎症损伤，这些病理变化共同构成了非酒精性脂肪性肝病相关的广泛肝损伤谱系16,17,18。
在机体经历慢性代谢应激的过程中，伴随着白色脂肪组织（WAT）和肝脏功能的受损，大动脉的动脉壁内会积聚脂质19。动脉内脂质积聚会触发活化的内皮细胞分泌趋化因子，并继而导致单核细胞的募集20。一旦被募集，单核细胞即增殖、分化，摄取脂蛋白并转化为泡沫细胞。动脉粥样硬化病变的启动和维持由募集的单核细胞来源巨噬细胞以及组织驻留的脂质负荷巨噬细胞所介导的促炎活性驱动。在这一致动脉粥样硬化微环境中传递的胞外和胞内应激信号作用下，这些巨噬细胞进而启动凋亡信号级联反应。当这些泡沫细胞死亡时，其富含脂质的内容物被释放至病变的坏死核心，最终导致斑块破裂、心肌梗死和脑卒中。
巨噬细胞表型的异质性在一定程度上调控了由脂肪组织（WAT）、肝脏和主动脉等失调组织中炎症变化所引发的肥胖8,21。对募集型和组织驻留型巨噬细胞进行表征，有助于揭示可调控巨噬细胞表型的潜在分子靶点1。为了有效表征肥胖诱导的炎症组织中的巨噬细胞，可通过酶消化法获得单细胞悬液。此类解离方案必须能够充分降解结缔组织，同时最大限度减少免疫细胞死亡，并获得理想的细胞得率。所用酶混合物的选择取决于组织类型及其结构组成。相较于肝脏和WAT，主动脉等结构较坚韧的组织需要更强的酶活性才能实现有效解离。从单细胞悬液中，可明确表征或分离组织驻留型巨噬细胞，用于后续分析，如转录谱分析。
本文介绍了一种组织特异性方案，该方案利用胶原酶依赖性组织消化和多色流式细胞术，有效分离并表征来自传统饮食诱导的肥胖、动脉粥样硬化、单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎小鼠模型中的组织驻留型巨噬细胞。通常使用针对白细胞（CD45 和/或 CD11b）及巨噬细胞（F4/80）特异性抗原的抗体对细胞表面标志物进行同时染色，以鉴定巨噬细胞群体22。荧光激活细胞分选（FACS）是一种强大策略，可用于高纯度地分选已鉴定的细胞群体。随后可通过下游分子分析（如定量实时聚合酶链式反应）对分选后的细胞群体进行表型特异性基因表达谱的评估23。尽管标准流式细胞术及基于流式细胞术的细胞分选技术在区分高度异质性细胞悬液中的巨噬细胞方面非常有效，但仍需对早期方案进行优化，以确保获得成功的实验结果。本研究描述了可有效分离和表征具有活性的组织特异性巨噬细胞的实验方案；更重要的是，本研究深入探讨了实验中常遇到的技术问题，并提供了预防和解决这些问题的前瞻性策略及故障排除方法。
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方案
所有实验方案（第1、1.2和1.3节）均经宾夕法尼亚州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
| 组织 | 解离缓冲液制备 | 终体积 | 保存条件 |
| 白色脂肪组织（WAT） | 解离缓冲液：2.5% HEPES、10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、3 mg/mL（0.3%）II 型胶原酶，溶于含 4.5 g/L 葡萄糖但不含 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中 | 500 mL | –80 °C（每份 10 mL 分装） |
| 肝脏 | 25 倍灌注缓冲液浓缩液（PBC）：3.55 M NaCl、168 mM KCl、240 mM HEPES、150 mM NaOH，溶于重蒸去离子 H2O | 500 mL | –20 °C（每份 40 mL 分装） |
| 保存缓冲液（PRB）：1% BSA 溶于 1× 灌注缓冲液 | 1 L | 4 °C | |
| 解离缓冲液：1× 灌注缓冲液中添加 4.76 mM CaCl2 和 72 U/mL IV 型胶原酶 | 每只小鼠 50 mL | 使用前立即配制 | |
| 主动脉 | 解离缓冲液：125 U/mL XI 型胶原酶、60 U/mL I 型透明质酸酶、60 U/mL DNase I、450 U/mL I 型胶原酶、20 mM HEPES，溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | 500 mL | –80 °C（每份 10 mL 分装） |
表1：组织特异性灌注缓冲液配方。
1. 组织分离与解离
- WAT 的分离与解离
- 按照组织特异性缓冲液的配方进行配制 表1，并按照所述方法保存。
- 配制以下试剂。
- 通过解冻适量的WAT解离缓冲液来配制消化缓冲液，并于4 °C保存备用。使用前立即将其升温至37 °C。通过配制含有2%胎牛血清（FBS）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）来制备FACS缓冲液。
- WAT 分离
- 用二氧化碳（CO₂）安乐死一只小鼠2) 填充室。在进入解剖步骤前，需检查其有效性。
- 将已处死的小鼠浸入盛有70%乙醇的烧杯中，短暂浸泡至完全湿润并被乙醇覆盖。将小鼠仰卧置于解剖台上，使用21 G针头将小鼠前肢和后肢的足爪固定在解剖板上。
- 用中等尖头镊子夹住尿道口前方的腹部皮肤，然后用锋利的解剖剪在夹住的腹部皮肤上剪开一个小口。
- 将剪刀的下刃插入皮肤与腹膜之间的小切口，从腹部向肋骨 cage 做一侧向切口。
- 轻轻向后牵拉皮肤以暴露完整的腹膜腔，通过腹膜做一侧向切口，将透明膜折叠翻起或切除组织，以暴露腹部白色脂肪组织（WAT）。
- 按照 Mann 所述方法收集周 gonadal 脂肪垫 等24
- 雄性小鼠的睾周脂肪垫与附睾和睾丸结合较松散。首先定位睾丸，然后用中号尖头镊夹住附睾头部，轻轻牵拉。
- 使用锋利的解剖剪，沿附睾（头部、体部和尾部）及睾丸表面剪下每侧附睾脂肪垫。
- 用镊子轻轻牵拉脂肪垫，同时剪断与附睾结构直接相连的结缔组织。
- 用镊子牢固夹住附着于附睾近端的脂肪垫末端，并轻轻将脂肪垫从性腺上剥离。
- 在雌性小鼠中，性腺周围脂肪垫与子宫体和子宫角疏松相连。
- 使用中号有齿镊夹住子宫旁脂肪组织，轻轻将其从子宫体和子宫角上分离。
- 使用锋利的解剖剪沿子宫体和子宫角剪下每一块脂肪垫。
- 将脂肪垫置于盛有PBS的培养皿中，并置于冰上以保持组织湿润。
- 脂肪组织解离为单细胞悬液
- 吸除培养皿中多余的 PBS，用单刃剃须刀片将腹部白色脂肪组织切成小块。
- 用剃须刀片的锋利边缘，轻轻将切碎的腹部白色脂肪组织刮入含有2 mL白色脂肪组织解离缓冲液的已标记15 mL聚丙烯收集管中。
- 将该组织消化缓冲液混合物置于37 °C下缓慢持续旋转孵育45分钟。
- 将消化后的组织通过70 µm细胞滤筛过滤至50 mL收集管中，同时用注射器活塞的橡胶头以环形运动方式不断研磨，持续将细胞悬液过滤通过滤筛。
- 用移液器将2 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）加入15 mL收集管中，轻轻吹打单细胞悬液，洗涤滤膜。
- 用预冷的DMEM再清洗滤膜两次，将单细胞悬液置于冰上。
- 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 8 分钟。
- 使用真空抽吸装置小心移除漂浮的脂肪细胞（先）及剩余的上清液，注意不要扰动已沉淀的基质血管组分（SVF）。
- 使用1,000 µL移液器，用氯化铵-钾（ACK）缓冲液轻轻重悬沉淀，以裂解红细胞，具体操作按照制造商说明书进行。
- 用DMEM稀释上述细胞悬液，在4 °C、300 g条件下离心8分钟。
- 用含2% FBS（FACS缓冲液）的冷PBS重悬细胞，并在布氏计数板/血细胞计数板中计数细胞。
- 转移 1 × 106 细胞（用于基础流式细胞术）或整个细胞悬液（用于FACS），加入至标记好的5 mL圆底聚苯乙烯管中。继续进行第2部分的流式细胞术染色方案。
- 肝脏组织的分离与解离
注意：本方案改编自 Smedsrød25.- 按照组织特异性缓冲液的配方制备缓冲液 表1 并按照所述方法储存。
- 配制以下试剂。
- 通过将40 mL PBC加入960 mL超纯水中，配制1×灌注缓冲液（PB）。2O. 灌注开始前，将装有50 mL PB的注射器在37 °C预热，排除其中存在的任何气泡。
- 为消除气泡，将注射器倒置，使鲁尔锁接头朝上。轻敲或弹击注射器，直至气泡升至注射器顶部。轻轻推动活塞以排出空气。
- 通过将 0.5 mL 的 476 mM CaCl₂ 稀释来配制消化缓冲液2 溶液 至49.5 mL 1×灌注缓冲液中。将3600 U的IV型胶原酶加入4.76 mM CaCl₂中2 – PB 溶液。灌注开始前，将装有 50 mL 消化缓冲液的注射器于 37 °C 预热。按照步骤 1.2.2.1.1 所述方法排除其中存在的任何气泡。
- 通过将 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 250 mL 1x 灌注缓冲液中，制备保存缓冲液（PRB）。4 °C 保存或冰上放置直至使用。
- 用1×PBS和2% FBS配制FACS缓冲液。
- 通过将40 mL PBC加入960 mL超纯水中，配制1×灌注缓冲液（PB）。2O. 灌注开始前，将装有50 mL PB的注射器在37 °C预热，排除其中存在的任何气泡。
- 肝脏组织分离
- 以 CO₂ 处死小鼠2 窒息处死小鼠后，用70%乙醇充分浸润小鼠以防止毛发污染腹腔器官。
- 将小鼠仰卧位固定于聚苯乙烯泡沫解剖板上，使用21 G针头将小鼠前肢和后肢的足爪固定在解剖板上。
- 使用中号尖头镊子夹住尿道口附近的腹部皮肤，以暴露胸壁和腹腔。然后用锋利的解剖剪在夹住的腹部皮肤上做一小切口。
- 将剪刀的下刃插入皮肤与腹膜之间的小切口，从腹股沟向下巴方向做一侧向切口。
- 轻轻向后牵拉皮肤，暴露完整的腹膜腔和胸壁，通过腹膜做一侧向切口，并切除该膜。
- 抬起胸骨，小心切开膈肌，注意不要损伤下腔静脉（IVC）。将胃肠道器官移向一侧，暴露肝下下腔静脉。使用止血钳夹闭肝上下腔静脉，以维持局部灌注。
注意：内脏白色脂肪组织过度积聚时常会遮蔽下腔静脉（IVC）。为更清晰地观察该血管，可切除下腔静脉旁的一小部分脂肪组织。在柔韧的脂肪组织上形成的切口窗口可置于下腔静脉上方，以暴露血管便于插管。 - 将装有预热PBS的注射器连接到23 G采血和输注套件上。轻推活塞，直至输液管和针头充满PBS。
- 将23 G针头平行于肝下腔静脉水平插入，用4 cm止血钳固定针头位置。
注意：在喂食饲料的小鼠中，优先选择下腔静脉（IVC）肝下插管，因为在此充满脂肪的腔隙中，IVC 更易于观察和插管。 - 轻轻推动针栓以开始灌注，若针头在血管内位置适当，肝脏颜色会迅速变浅（右叶先出现）。若针头正确插入肝下腔静脉，还可观察到肝叶肿大。
- 立即切断门静脉，以使磷酸盐缓冲液（PB）能够自由流经肝脏。
- 灌注肝脏直至看不到血液为止。必要时，用食指和拇指轻轻按摩肝叶以促进灌注。
注意：处理肝脏时，必须使用无锯齿的钝头工具，以防止组织损伤。 - 当注射器中剩余5 mL PB时，更换为装有预热解离缓冲液的注射器。在此过程中不得移动固定针头的位置。
注意：若肝脏明显增大且重量显著超过1.5 g，应使用更大体积的预热消化缓冲液进行灌注，以确保肝脏有效解离。 - 灌注肝脏直至完全消化。轻轻按摩肝叶以促进灌注。
注意：在消化成功的肝脏中，可观察到Glisson囊与实质组织的分离。为评估此现象，可用镊子的钝端轻轻按压左侧外叶表面，应可见组织表面出现压痕，且在移开镊子后压痕缓慢回填。 - 移除下腔静脉（IVC）肝下段的针头。不要移除夹住上腔静脉（IVC）肝上段的止血钳。
- 使用短直刃解剖剪小心剪断连接韧带，完整切除肝脏，并移除胆囊。
- 将整个肝脏置于含有10 mL冰冻保存缓冲液的10 cm培养皿中，并于4℃保存 оC，直至准备释放细胞。
- 肝细胞解离
- 将肝脏转移至含有10 mL冰冻DMEM的10 cm培养皿中。
- 用有齿镊夹住与切除肝脏相连的离断的肝上腔静脉。用中号尖头镊通过快速划动每个肝叶的方式，从格利森囊中释放细胞。
- 将饱和的DMEM通过连接在50 mL收集管上的70 µm细胞滤网过滤。
- 用移液器将10 mL冰冷的DMEM加入10 cm培养皿中，重复步骤1.2.4.1至1.2.4.3，直至不再观察到培养基饱和。将细胞悬液置于冰上或4 °C保存。
- 轻轻倒置收集管以混匀细胞悬液，然后在 4 °C 下以 54 × g 离心 2 分钟。
- 将上清液收集至一个洁净的50 mL收集管中。随后在4 °C下以54 × g离心细胞悬液2 min。
- 在进行步骤 1.2.4.8 之前，重复步骤 1.2.4.6 两次。
- 将上清液转移至干净的50 mL收集管中，于4 °C、300 x g离心10分钟。
- 将非实质细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，并使用血细胞计数板进行计数。
- 转移 1 × 106 细胞（用于基础流式细胞术）或 15 x 106 - 20 × 106 细胞（用于FACS）至标记的5 mL圆底聚苯乙烯管中。继续进行第2部分的流式细胞术染色方案。
- 主动脉分离与解离
注意：本方案改编自 Butcher 等.26- 根据所提供的配方制备组织特异性缓冲液 表1 并按照所述方法储存。
- 配制以下试剂。
- 通过解冻适量的WAT解离缓冲液来配制消化缓冲液，并在4 °C保存至使用。使用前立即将其预热至37 °C。
- 通过将肝素钠盐溶解于1×PBS中，配制浓度为200 U/mL的10×肝素溶液。用1×PBS将10×肝素储备液稀释，制备1×肝素溶液。将10×和1×肝素溶液于4 °C保存，待用。
- 用含2% FBS的1×PBS配制FACS缓冲液。
- 主动脉解剖
- 在充满二氧化碳的密闭容器中安乐死一只小鼠，并用70%乙醇冲洗。
- 将小鼠腹侧朝上置于解剖台上，展开其前肢和后肢，并使用21 G针头将其固定在解剖板上。
- 小鼠安乐死后立即进行心脏穿刺。如有需要，可参考步骤 1.3.3.4 至 1.3.3.9。
- 在胸骨下端定位剑突
- 为此，将手指置于动物颈部宽度方向的中点处，沿腹侧中线从颈部向胸骨尾端滑动，直至触及软骨延伸部分。
- 使用中等尖头镊子夹住软骨延伸部分，必要时可通过去除剑突区域的毛发或皮肤标记其位置。
- 在剑突下方以20-30°角部分插入26 G针头。
- 缓慢回抽注射器活塞以施加轻柔的负压，然后将针头进一步插入腔内，直至有血液流出。
- 若血流停止，应缓慢旋转针头或轻微进出移动。
- 用镊子夹住尿道口前方的腹部皮肤，使用一把锋利的解剖剪从腹股沟沿腹侧中线向前剪开，穿过腹膜直至下颌。
- 用手指或钝头镊子向后牵拉皮肤以暴露腹腔器官和肋骨，然后轻轻将腹腔器官移至一侧。
- 用镊子夹住剑突，抬起胸骨，并切开膈肌。
- 使用解剖剪在两侧剪断肋骨。抓住胸骨，将肋骨向上翻起，并剪断其连接的基部。移除肋骨，暴露下方的胸腔器官。
- 用连接10 mL注射器（内含1×肝素溶液）的26号针头灌注主动脉，将1–2 mL溶液注入心脏左心室（LV）。
注意：灌注时务必保持低速低压，以确保动脉粥样硬化性主动脉病变的完整性。 - 切除胸腺、肺和结缔组织。如有需要，参考步骤 1.3.3.16 和 1.3.3.17。
- 在心脏前方找到呈白色、双叶状（或蝶形）的器官，用镊子牢固夹住胸腺。将两个叶向上拉离体腔，并用剪刀在基部剪断。
- 用镊子夹住一个肺叶，将其从胸腔中轻轻拉出，并在基部切断。对剩余的每个肺叶重复此操作。
- 使用解剖显微镜和显微解剖工具，采集主动脉弓（包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉）、升主动脉、降主动脉、胸主动脉和腹主动脉。
- 在心脏左心室处定位升主动脉。
- 用一对尖端尺寸为 0.07 x 0.04 mm 的弯头镊子轻轻夹住从左心室发出的升主动脉部分。
注意：与周围呈黄色的脂肪组织相比，当用肝素溶液充分灌注后，主动脉将呈现为一条源自左心室的亮白色血管。- 如果通过心脏灌注未能充分冲洗主动脉，则在主动脉仍与体腔相连时再次冲洗。操作时，在心脏与主动脉连接处附近剪断，移除心脏，然后在腹主动脉下端水平剪断。将26 G针头插入升主动脉开口，用1×肝素溶液轻柔冲洗主动脉。
- 轻轻牵拉升主动脉，以更好地区分脂肪组织与嵌入的主动脉。
- 继续轻柔牵拉升主动脉，用闭合的弹簧解剖剪尖端清除包裹升主动脉和主动脉弓的脂肪组织。操作时，以闭合的剪尖轻轻划过脂肪组织，撕离相连的脂肪。
注意：在升主动脉和主动脉弓尚未清晰可见之前，禁止通过切割方式切除任何脂肪组织，以防止误伤主动脉。 - 如果升主动脉和主动脉弓能够与周围脂肪组织清晰区分，则使用弹簧解剖剪切除多余的脂肪组织。
- 用镊子轻轻夹住主动脉弓。再次使用弹簧剪的尖端，沿降主动脉、胸主动脉和腹主动脉右侧脂肪套膜的走向，从头端向腹主动脉尾端方向轻划，清除脂肪组织。
- 继续沿主动脉剥离脂肪时，应小心操作，动作轻柔，避免损伤主动脉。
- 轻轻地将主动脉向上方显微镜方向提起，使脂肪组织位于主动脉后方。
- 将合拢的剪刀刀片插入降主动脉前段腹侧的脂肪-主动脉交界处，通过钝性 sweeping motion 切断脂肪组织与主动脉表面的连接。
注意：建议在主动脉仍位于体腔内时，彻底清除多余的脂肪和结缔组织。 - 切除心脏，并在腹主动脉的尾端横向切断。取出整段主动脉。
- 将主动脉置于35 mm培养皿中，使用两根21号针头剥离主动脉上多余的脂肪组织。将剥离后的主动脉放入1.7 mL微量离心管中，置于冰上。
- 主动脉解离为单细胞悬液
- 将0.2 mL主动脉解离缓冲液移液至含有主动脉的离心管中。将弹簧剪刀片插入管子的锥形末端，迅速剪切主动脉以促进酶消化。
- 将组织-溶液混合物转移至15 mL收集管中，并用移液器加入1.8 mL主动脉解离缓冲液，使总体积达到2 mL。
注意：为便于转移组织悬液，可将标准1,000 µL枪头的锥形末端剪去1 cm。使用截短后的枪头配合移液器转移悬液。 - 将切碎的主动脉在主动脉解离缓冲液中于37 °C孵育55分钟，以220 rpm（0.514 × g）振荡。
- 将悬液通过50 µm细胞滤筛过滤至15 mL聚丙烯收集管中。使用注射器推杆的橡胶活塞辅助过滤。
- 用1 mL FACS缓冲液冲洗15 mL收集管，收集悬浮液并经细胞滤网过滤。
- 用 1 mL FACS 缓冲液将 50 µm 细胞滤筛再清洗两次。
- 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞。用预冷的 FACS 缓冲液重悬细胞。使用血细胞计数板（Burker chamber）计数细胞。
- 转移 1 × 106 （用于基础流式细胞术）将细胞或整个细胞悬液（用于FACS）加入已标记的5 mL圆底聚苯乙烯管中。继续进行第2节的流式细胞术染色方案。
2. 流式细胞术和FACS染色
| 荧光染料 | R-藻红蛋白 (PE) | PE/花青素 (Cy) 7 | PE/花青素 (Cy) 5 | 太平洋蓝 (PB) |
| 激光器 (nm) | 蓝色 (488 nm) / 黄色 (561–570 nm) - 绿色 (532 nm) | 蓝色 (488 nm) / 黄色 (561–570 nm) - 绿色 (532 nm) | 蓝色 (488 nm) / 黄色 (561–570 nm) - 绿色 (532 nm) | 紫色 (405 nm) |
| 最大激发波长MAX (nm) | 496 | 496 | 496 | 401 |
| 最大发射波长MAX (nm) | 578 | 785 | 667 | 455 |
| 表型标志物 | F4/80 | CD11c | CD11b | CD45 |
| EMR1, Ly71 | αX 整合素, 整合素 αX 链, CR4, p150, ITGAX | αM 整合素, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM | T200, Ly-5, LCA | |
| 靶向细胞类型 | 组织驻留型巨噬细胞 | 经典活化型 (M1) 巨噬细胞 | 单核细胞 / 巨噬细胞 | 白细胞（巨噬细胞 / 单核细胞、淋巴细胞和粒细胞） |
| 树突状细胞的一个亚群 | 树突状细胞、NK 细胞、活化 T 细胞以及肠上皮内淋巴细胞 (IEL) 的一个亚群 | 粒细胞、树突状细胞、NK 细胞以及 T 细胞和 B 细胞的某些亚群 | ||
| 稀释倍数 | 1:50 | 1:100 | 1:100 | 1:100 |
| 同型对照 | PE 大鼠 IgG2a | PE/Cy7 叙利亚仓鼠 IgG | PE/Cy5 大鼠 IgG2b | 太平洋蓝 大鼠 IgG2c |
表2：用于区分组织驻留巨噬细胞的荧光标记抗体列表。
- 准备并收集以下物品：FACS 缓冲液、5 mL 圆底聚苯乙烯管、抗小鼠 CD16/32 Fc 受体阻断抗体、荧光素偶联或非偶联的一抗、荧光素偶联的二抗（如需要）、1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。
注意：在染色大量细胞时，抗体浓度比细胞数量更为关键。例如，若染色 10 × 106 个细胞，染色缓冲液体积和抗体浓度应与在 100 µL 缓冲液中染色 1.0 × 106 个细胞时相同。若染色 1.0 × 108 个细胞，建议将抗体用量增加 5 倍。 - 如有需要，向每根 FACS 管中加入额外的预冷 FACS 缓冲液，于 4 °C 条件下以 751 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。离心后吸除上清液。
- 根据生产商说明书，向所有样品中加入抗小鼠 CD16/CD32 Fc 受体阻断抗体。于 4 °C 或冰上孵育 15 分钟。
- 将荧光素偶联的一抗混合物直接加入含 Fc 受体阻断抗体的细胞悬液中，于 4 °C 孵育 30 分钟。避光孵育以尽量减少荧光素偶联抗体的光漂白。
- 若使用了非偶联的一抗，则在完成步骤 2.4 后执行以下步骤。
- 将已染色的一抗样品于 751 × g、4 °C 离心 5 分钟进行洗涤。
- 倾去上清液，将沉淀重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。
- 向所有需要的样品中加入偶联的二抗，于 4 °C 孵育 30 分钟。然后进入步骤 2.5。
- 抗体孵育完成后，向样品中加入 2 mL 预冷的 FACS 缓冲液，于 4 °C 以 751 × g 离心 5 分钟。倾去上清液，并注意不要扰动沉淀。
- 轻柔混匀细胞，然后用 200–400 µL FACS 缓冲液重悬，避光保存于 4 °C，直至进行常规流式细胞术分析或细胞分选。
- 如需对染色后的细胞进行短期固定，请继续执行步骤 2.8 至 2.10。固定仅适用于常规流式细胞术。
- 在完成步骤 2.5 后立即进行，将细胞重悬于 0.5 mL 2–4% 多聚甲醛（PFA）中，于 4 °C 孵育 15–30 分钟。
注意：警告：PFA 是一种已知的刺激物，具有致癌性和毒性。使用 PFA 时务必格外小心，确保佩戴适当的个人防护装备并使用通风排气设备。 - 固定完成后，向所有样品中加入 2 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，于 4 °C 以 751 × g 离心 5 分钟。离心后去除上清液。
- 将固定后的细胞重悬于 200 µL 预冷的 FACS 缓冲液中，于 4 °C 保存。固定细胞可在 4 °C 保存最多 1 周，但建议在 48 小时内完成流式细胞术检测，以尽量减少自发荧光。
- 根据流式细胞仪生产商的说明书获取流式细胞术数据，或按照 Basu et al.23 所述方法进行荧光激活细胞分选。
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结果
使用载脂蛋白E缺陷型（ApoE KO）C57BL/6（BL6）小鼠，喂饲高脂高胆固醇饮食（HCHFD或HCD）18周后，当合并两个样本时，可分离得到1 × 104 - 2 × 104个CD45+F4/80+主动脉巨噬细胞。从喂饲HFHCD的ApoE KO小鼠中分离的肝脏可获得超过5 × 105个分选的库普弗细胞（具体数量取决于可用的分选时间）。使用喂饲高脂饮食（HFD）的野生型（WT）C57BL/6小鼠时，可从基质血管组分（SVF）中分选5 × 105至1 × 106个驻留型脂肪组织巨噬细胞（ATMs）。上述从特定组织中可分选获得的巨噬细胞总数足以用于通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）进行基因表达分析。对于巨噬细胞群体回收数量较少的组织（如主动脉），建议在需要提取RNA进行此类分析时使用共沉淀剂（例如糖原）并进行过夜沉淀。
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讨论
饮食诱导的代谢紊乱模型被广泛用于模拟动脉粥样硬化、单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎和2型糖尿病等共病，以更好地理解疾病进展背后的分子机制。依赖胶原酶的消化方法常用于解离组织，从而将细胞从细胞外基质（ECM）中释放出来16,27。胶原酶等酶类可破坏为邻近细胞提供结构支持的胶原蛋白。组织的结构组成决定了组织基质的硬度（即抵抗形变的能力），并影响哪种粗制胶原酶产品在有效破坏ECM方面最为高效28。白色脂肪组织（WAT）由"软基质"构成，通常使用II型胶原酶进行消化，以释放脂肪细胞和常驻免疫细胞，同时维持细胞表面胰岛素受体的完整性29。主动脉纤维成分的微观结构促成了"硬基质"特性，因此常联合使用具有最高胶原酶活性的XI型胶原酶及其他辅助酶类，以实现有效的主动脉消化。与主动脉不同，肝脏消化则采用酶活性较弱的IV型胶原酶来破坏基质，并释放具有活性的实质和非实质细胞30
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披露
作者无利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢宾夕法尼亚州立大学千年科学中心流式细胞术核心设施的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 26 G × 5/8 英寸针头 | BD | 305115 | |
| 23 G × 0.75 英寸针头 × 12 英寸管路血液采集套装 | BD | 367297 | 用于肝脏灌注过程中下腔静脉的插管 |
| 21 G 1 1/2 英寸针头 | BD | 305156 | |
| 带橡胶塞的 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 309604 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| 抗小鼠 CD16/32 Fc 封闭抗体 | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE 大鼠 IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 叙利亚仓鼠 IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 大鼠 IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue 大鼠 IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 μm 细胞筛 | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL 微型离心管 | Denville | C2170 | |
| 多聚甲醛水溶液 -16× | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| 微型解剖剪刀，3.5 英寸，直头，23 mm，锋利 | Stoelting | 52132-10P | 用于常规解剖操作 |
| 微型镊子，4 英寸，全弯，0.8 mm | Stoelting | 52102-37P | 用于常规解剖操作 |
| 弹簧解剖剪刀 – 3 mm 刃口 | Fine Science Tool | 15000-10 | 用于主动脉解剖步骤 1.3.3.17 至 1.3.3.28 |
| 弯曲尖端 0.07 mm × 0.04 mm 镊子 | Fine Science Tool | 11297-10 | 用于主动脉解剖步骤 1.3.3.17 至 1.3.3.28 |
| 止血钳（弯型） | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| 肝素钠盐 | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35 mm 细胞培养/培养皿 | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| 聚苯乙烯培养皿（10 cm）带盖 | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50 mL 圆锥形离心管 （聚丙烯） | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管 | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 乙醇（库存变性乙醇，无水） | Millipore | EX0285-1 | |
| 牛血清白蛋白 | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| II 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| XI 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| I 型透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| I 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500 mL 烧杯 | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm 止血夹 | Stoelting | 52120-40 | |
| 有齿镊 | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 μm 一次性滤器 | Systemex | 04-0042-2317 | |
| IV 型胶原酶 | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| 氯化铵钾（ACK） | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| 剃刀（0.22 mm（0.009"）） | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red 活/死细胞染色试剂 | 红色活力染料（见 图 1A） |
参考文献
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