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方法文章

利用溴尿苷三磷酸链特异性转录延伸（TRO）方法分析转录终止

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DOI：

10.3791/55446

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2017年3月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

本文内容

摘要

我们描述了一种用于分析RNA聚合酶II转录终止的基本实验方法 体内 利用BrUTP通过芽殖酵母的链特异性转录延伸（TRO）方法。该方案可拓展用于研究酵母及其他真核生物中其他RNA聚合酶的转录终止过程。

摘要

本文描述了一种检测转录终止缺陷的实验方案 体内使用BrUTP的链特异性TRO实验方案是一种在生理条件下分析转录终止缺陷的有力实验方法。与传统的TRO实验一样，该方法依赖于在基因3′端下游存在转录活性的RNA聚合酶，作为转录终止缺陷的指标。1它克服了传统TRO检测中的两个主要问题。首先，它可以检测到通过终止信号的聚合酶是否是从启动子近端区域起始转录的聚合酶，还是仅仅代表了从基因体内部或3′端非特异性起始的广泛转录聚合酶。其次，它可以区分在终止子区域之外检测到的具有转录活性的聚合酶信号，究竟是真正进行通读的正义mRNA转录聚合酶，还是从终止子起始的非编码反义RNA信号。简要而言，该实验方案包括对指数生长期的酵母细胞进行透化处理，允许已起始的转录本继续延伸 体内 在BrUTP核苷酸存在条件下进行延伸，通过亲和方法纯化BrUTP标记的RNA，将纯化的新生RNA进行逆转录，并利用位于基因启动子区和终止子区侧翼的链特异性引物扩增cDNA2.

引言

真核生物转录循环包括三个主要步骤：起始、延伸和终止。RNA聚合酶II介导的转录终止包含两个不同且相互依赖的步骤。3第一步涉及 mRNA 从模板上的切割、加多聚腺苷酸尾及释放，紧接着是第二步，其特征是聚合酶从模板上解离。正确的终止过程对于聚合酶在转录起始/再起始中的循环利用、防止对下游基因转录的干扰，以及通过限制广泛存在的非编码 RNA 的转录来控制异常转录具有关键作用。4,5尽管近年来取得了一些进展，但终止阶段仍是RNA聚合酶II转录循环中了解最少的步骤。建立一种可靠的终止检测方法对于研究RNA聚合酶II转录终止的分子机制至关重要。 体内.

在生理条件下，检测活跃转录基因终止缺陷的实验方法有多种。这些方法包括Northern印迹、终止因子ChIP（染色质免疫沉淀）以及传统的TRO分析。每种技术都有其优缺点。传统TRO分析曾是体内检测转录终止缺陷最可靠且最敏感的方法in vivo1。该方法可定位细胞内基因不同区域上具有转录活性的聚合酶分子。在正常情况下，该分析显示转录中结合的聚合酶分子严格分布于基因的启动子与终止子区域之间（图1A）。然而，当终止功能出现缺陷时，聚合酶无法识别终止信号，因而可在基因3′端下游区域检测到其存在（图1B）。

转录终止缺陷表现为：从启动子近端区域起始的正义链转录聚合酶无法识别终止信号，从而继续转录基因3′末端下游区域，如图2A所示。随着人们认识到真核生物基因组在基因内部及周围区域普遍存在广泛的正义链和反义链转录现象6,7,8,9,10，传统TRO检测方法的局限性很快显现——它无法判断基因下游的聚合酶信号究竟是由启动子起始的转录本（图2A）所致，还是在基因中间或终止元件下游某处起始的异常RNA（图2B），亦或是从基因3′末端起始沿反义方向转录的聚合酶活动（图2C）。本文所述的利用BrUTP进行的链特异性TRO检测方法，能够区分所观察到的通读聚合酶信号是来源于启动子起始的延伸型正义mRNA，还是来源于被检测基因下游起始的反义转录本。我们已成功应用该方法证明了Kin28激酶在芽殖酵母转录终止过程中的作用2。在此采用该方法进一步证明，Rna14对于芽殖酵母中ASC1基因的转录终止是必需的。

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方案

注意：本方法已在 Medler, S 和 Ansari, A. 的研究论文中使用2。

1. 细胞的培养与收获

  1. 从新划线的 Saccharomyces cerevisiae 平板中接种5 mL细胞培养物至YPD培养基（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，2%葡萄糖）中。
  2. 将细胞在30 °C、250 rpm条件下于摇床中过夜培养。
  3. 将过夜培养的菌液按100倍稀释，最终体积为100 mL，置于250 mL带挡板的锥形瓶中的YPD培养基中。
    注意：每进行一次TRO反应需要100 mL培养物；若需进行多个反应，则应使用更大体积的培养物。
  4. 将细胞培养至600 nm处的光密度值达到0.8 - 1.0（A600 ~ 0.8 - 1.0）。
  5. 在4 °C条件下，以820 × g离心5 min，使用无菌50 mL离心管收集细胞。
  6. 将细胞沉淀重悬于10 mL预冷的TMN缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl2，100 mM NaCl）中，并在冰上孵育5 min。
  7. 在4 °C条件下以820 × g离心5 min收集细胞沉淀。小心吸除上清液。

2. 转录延伸实验用细胞的透化与制备

  1. 使用截短的 P1000 枪头轻轻吹打，将细胞重悬于 1 mL 0.6% 的 Sarkosyl 溶液中。将细胞悬液转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中。
  2. 在平台摇床上于 4 °C 轻柔振荡细胞 25 分钟。
    注意：应将微量离心管装入装有冰块的 50 mL 离心管中，以维持低温环境，避免在此阶段启动子处发生新的转录起始事件。
  3. 使用台式制冷离心机在 4 °C 下以 1,200 × g 离心 6 分钟。
  4. 小心吸除上清液，以去除破膜细胞沉淀中的过量液体。

3. 转录延伸反应

  1. 向通透化的细胞沉淀中加入 150 µL 转录延伸缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM KCl，10 mM MgCl2，2 mM DTT（二硫苏糖醇），每种 ATP、CTP、GTP 和 BrUTP 各 0.75 mM，200 U RNase 抑制剂）。
  2. 使用截短的 P200 枪头轻轻吹打混匀。
    注意：若处理多个样品，应将所有样品置于冰上直至全部准备好，再进行下一步。
  3. 在 30 °C 水浴中孵育 5 分钟。
    注意：可将孵育时间调整为 1 至 5 分钟，以确保 BrUTP 有效掺入新生 RNA 中。
  4. 加入 500 µL 冷的即用型 RNA 提取试剂以终止反应，在室温下孵育 5 分钟。

4. RNA 提取

  1. 向细胞悬液（步骤 3.4）中加入 200 µL 酸洗玻璃珠，在涡旋混合器上于 4 °C 剧烈振荡 20 分钟。
  2. 使用加热的 22 号针头刺穿微量离心管底部，并将其置于一个 15 mL 无菌锥形管上方。
  3. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 1 分钟以收集细胞裂解液。将细胞裂解液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  4. 向细胞裂解液中加入 500 µL 冷 RNA 提取试剂和 200 µL 氯仿。在涡旋混合器上混匀内容物，并在 4 °C 下以 16,168 × g 离心 20 分钟。
  5. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
  6. 向其中加入等体积的冷酚/氯仿/异戊醇（125:24:1，pH 4–5）。在涡旋混合器上剧烈振荡，并在 4 °C 下以 16,168 × g 离心 15 分钟。
  7. 将含有 RNA 的上层水相转移至新的微量离心管中。重复步骤 4.6 两次。
  8. 向最终含有 RNA 的水相中加入 5 M NaCl 储存液，使终浓度为 0.3 M。加入 3 倍体积的冷乙醇以沉淀 RNA。
    1. 在 -20 °C 下孵育 1 小时或过夜。
      注：在抗 BrdU 磁珠进行封闭孵育期间（见步骤 5.3），可同时执行步骤 4.9–4.11。
  9. 在 4 °C 下以 16,168 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，并将 RNA 沉淀重悬于 100 µL DEPC（焦碳酸二乙酯）水中。
  10. 使用 RNA 提取小型试剂盒将 RNA 与未掺入的 BrUTP 核苷酸分离。用 100 µL 无 RNase 水从柱上洗脱 RNA。
  11. 将 RNA 置于 65 °C 水浴中孵育 5 分钟，然后转移至冰上至少 2 分钟。

5. BrUTP标记RNA的亲和纯化

  1. 向25 µL抗BrdU沉淀微珠中加入500 µL 0.25x SSPE（磷酸盐-氯化钠-EDTA）结合缓冲液（20x SSPE：3 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA，pH 7.4，1 mM EDTA，0.05% Tween，37.5 mM NaCl）。在4 °C下以200 × g离心30秒，弃去上清液。
  2. 重复步骤5.1三次。
  3. 向微珠中加入500 µL封闭缓冲液（1x结合缓冲液，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，1 mg超纯牛血清白蛋白（BSA）），在平台摇床上于4 °C轻轻振荡1–2小时。
  4. 用500 µL结合缓冲液再洗涤微珠两次，操作同步骤5.1所述。
  5. 向微珠中加入400 µL结合缓冲液。
  6. 直接将100 µL RNA（来自步骤4.11）转移至微珠中。在平台摇床上于4 °C轻轻振荡孵育1–2小时。
  7. 依次用500 µL结合缓冲液、500 µL低盐缓冲液（0.2x SSPE，1 mM EDTA，0.05% Tween）、500 µL高盐缓冲液（0.25x SSPE，1 mM EDTA，0.05% Tween，100 mM NaCl）以及两次500 µL TET缓冲液（1x TE，0.05% Tween）对微珠进行洗涤，每次洗涤之间在4 °C下以200 × g离心30秒。
  8. 用洗脱缓冲液（20 mM DTT，150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA，0.1% SDS）依次洗脱微珠上的BrUTP标记RNA，先用150 µL洗脱两次，再用200 µL洗脱一次；每次在42 °C水浴中孵育4分钟，随后短暂离心以分离微珠与上清液。

6. BrUTP 标记 RNA 的沉淀

  1. 向亲和纯化的BrUTP标记RNA中加入500 µL冷酚/氯仿/异戊醇（125:24:1）pH 4 - 5，涡旋混匀后，在4 °C下以16,168 × g离心15分钟。
  2. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
  3. 加入5 M NaCl母液，使终浓度为0.3 M，并加入3倍体积的冷乙醇以沉淀RNA。
  4. 在-20 °C下孵育过夜。
  5. 在4 °C下以16,168 × g离心30分钟，收集沉淀的RNA。
  6. 弃去上清液，让沉淀在空气中干燥10分钟。
  7. 将RNA沉淀重悬于26 µL DEPC处理水中。
  8. 使用分光光度计在260 nm处测定吸光度，确定最终RNA浓度；同时测定260/280比值，比值约为2表明RNA样品较纯。
  9. 将RNA样品分装后于-80 °C保存，直至进行cDNA合成时使用。

7. BrUTP标记RNA的逆转录

  1. 使用DEPC水将RNA浓度调整至100 ng/µL。每个cDNA合成反应使用0.5 µg RNA。
    注意：RNA模板的浓度可在0.5至1.0 µg之间调整，以获得最佳cDNA合成效果。
  2. 使用设计在poly(A)位点（终止位点）下游的多个反向引物进行RNA的反转录，如图3A所示。
  3. 向每个反转录反应体系中加入5 µl RNA模板（0.5 µg）、1 µL dNTP混合物（各10 mM）、2 µL反向引物C、D、E、F或G（各50 µM）（见图3A）以及无核酸酶水。每管最终反应体积为13 µL。
    注意：反转录反应的数量取决于用于cDNA合成的反向引物数量。例如，对于ASC1，使用了五个反向引物，因此设置了五个反转录反应。根据用于cDNA合成的反向引物，将各管标记为C、D、E、F和G。
  4. 将含有RNA模板、dNTP混合物和引物的反应管置于PCR仪中，在65 °C孵育5分钟以消除任何二级结构，随后冷却至4 °C至少2分钟。
  5. 向每个含有RNA模板和引物的反应管（步骤7.4）中加入1 µL反转录酶（200 U/µL）、4 µL缓冲液和2 µL 0.1 M DTT。通过轻柔吹打混匀。
  6. 在PCR仪中于42 °C孵育反应体系60分钟，进行反转录。
  7. 在65 °C孵育20分钟以灭活反转录酶。
  8. 将cDNA储存于-20 °C，或直接进行下一步操作。

8. cDNA 的扩增

  1. 按照以下步骤对第7.8步中制备的每种cDNA（标记为C、D、E、F和G，对应ASC1）进行PCR扩增反应：3.0 µL 来自第7.8步的cDNA模板，1.0 µL 正向引物B（10 µM），1.0 µL 反向引物C、D、E、F或G之一（10 µM），2.5 µL 10x聚合酶PCR缓冲液，0.5 µL dNTP混合物（各10 mM），1.0 µL MgCl2（2.5 mM），15.5 µL PCR级水，以及0.5 µL耐热聚合酶。
    注意：应测试从1:5至1:100的不同cDNA模板稀释度，以优化PCR产物产量。使用单一的启动子近端正向引物来扩增通过不同反向引物获得的cDNA。例如，位于启动子附近的单一正向引物B与五个反向引物C至G组合用于ASC1。B-C、B-D、B-E、B-F和B-G分别在标记为C、D、E、F和G的试管中使用，如图3A所示。
  2. 采用以下热循环参数运行PCR：95 °C预变性2分钟（1个循环，用于激活聚合酶的热启动），随后进行30–40个循环：95 °C变性30秒，54 °C退火15秒，68 °C延伸1分钟，并最后在68 °C下延伸5分钟（1个循环）。
    注意：退火温度将根据所用特定引物而变化，延伸时间则取决于预期产物的大小。
  3. 根据预期产物大小，通过0.8%、1.5%或2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。
  4. 按照El Kaderi 等，201211中所述方法定量PCR产物。
    注意：也可采用实时RT-qPCR策略来定量新生转录本的量。

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结果

为了验证 BrUTP 链特异性 TRO 方法在检测转录终止缺陷中的适用性，我们使用了一种转录终止功能缺陷的温度敏感型 RNA14 突变体，称为 rna14-1。Rna14 在 RNA 聚合酶 II 介导的转录终止过程中的作用，此前已通过传统的 TRO 检测方法得以证实，该方法可检测特定基因终止子近端区域的 RNA1。在非允许温度下，rna14-1 突变体中终止子区域以外检测到的 RNA 信号被解释为存在终止缺陷。然而，所观察到的信号也可能源于在基因 3′ 端附近某处启动转录的广泛延伸的聚合酶，如图 2B所示。为了确凿地证明 Rna14 在转录终止中的作用，我们在 37 °C 条件下对 rna14-1 突变体及其同源野生型菌株进行了 BrUTP 链特异性 TRO 检测。我们预期，在野生型菌株中，TRO 信号将局限于启动子与终止子区域之间，如图 1A所示；而在 rna14-1

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讨论

本文所采用的链特异性TRO（新生RNA测序）技术方案改编自用于哺乳动物细胞GRO-Seq（全基因组新生链测序）分析的实验流程12。我们成功对该方案进行了优化，以用于芽殖酵母中新生转录的研究。为了特异性地分析转录终止缺陷，我们进一步修改了该方案，去除了RNA水解步骤。这使得我们能够特异性地检测从启动子区域附近的转录起始位点开始、全长的新生转录本。

该实验方案中有多个关键步骤必须格外谨慎地操作，以获得有意义的结果。首先，实验必须使用处于指数生长期的酵母细胞进行。处于对数生长期（A600 ~ 0.8 - 1.0）的细胞效果最佳，因为此阶段的大多数细胞均处于活跃生长状态，并表现出强烈的转录活性。其次，RNA提取步骤应尽可能迅速地在2 - 4 °C的温度下进行。第三，在进行Br-UMP标记RNA的亲和纯化之前，必须从RNA样品中去除未掺入的BrUTP。我们使用RNA试剂盒从纯化的RNA样品中去除BrUTP。第四，使用性能稳定的逆转录酶对于实验方案的成功至关重要。

本文...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

安萨里实验室的研究工作得到了美国国家科学基金会研究资助（编号：MCB 1020911）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苯酚-氯仿-异戊醇混合液Sigma-Aldrich77619pH 4-5
TRIzol试剂Life technologies15596-026
RNase抑制剂，人胎盘来源New England BiolabsM0307S
抗BrdU磁珠Santa Cruz Biotechnologysc-32323AC
Protoscript IINew England BiolabsM03368L或等效酶
Advantage 2聚合酶混合液Clontech639201或等效酶
5-溴尿苷5'三磷酸钠盐Santa Cruz Biotechnologysc-214314A
RNeasy Mini试剂盒Qiagen74104
ATPNew England BiolabsN0451AA
CTPN0454AA
GTPN0452AA
超纯牛血清白蛋白（BSA）MC LabsUBSA-100
Asc1 BAGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 CGAACTTTATACATATTCTTAGTT
AGCAGTC
Asc1 DTGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 EGCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 FCTATGGAATGGGGGTTTTAAG
Asc1 GGGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNAAGATTGCAGCACCTGAGT
5’ 5s 反向引物GGTTGCGGCCATATCTAC
3’ 5s 反向引物TGAGTTTCGCGTATGGTC

参考文献

  1. Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
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