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使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

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DOI：

10.3791/55448

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2017年5月16日

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1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。

摘要

SPHIRE（用于高分辨率电子显微镜的SPARX）是一款新颖的开源、用户友好的软件套件，用于单颗粒电子冷冻显微镜（cryo-EM）数据的半自动化处理。本文所述方案详细介绍了如何从cryo-EM显微图像电影出发，通过引导用户完成单颗粒结构解析流程的各个步骤，最终获得接近原子分辨率的结构。这些步骤均由全新的SPHIRE图形用户界面进行控制，所需用户干预极少。利用本方案，可获得TcdA1（一种Tc毒素复合物）的3.5 Å分辨率结构 Photorhabdus luminescens，仅由9500个单颗粒衍生而来。这种简化的流程将有助于缺乏丰富处理经验的新手用户 先验的 结构信息，以获得其纯化的大分子复合物在天然状态下的无噪声、无偏倚的原子模型。

引言

在直接电子探测器技术发展之后，单颗粒冷冻电镜技术的显著进步目前正在重塑结构生物学领域 1与X射线晶体学相比，该技术仅需少量蛋白质样品，无需结晶步骤，同时对样品纯度的要求较低，仍可实现近原子分辨率的结构解析。重要的是，现在可通过计算方法将不同组分或状态分离，并以前所未有的细节水平对不同构象进行结构解析。近期，一些难以处理的分子已获得密度图，其分辨率足以 从头合成 模型构建，从而深入理解其作用机制 2,3,4,5.

在三维电子显微镜（3DEM）领域，有多种图像处理软件包可供使用（https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy），其中大多数软件包正处于持续开发中。利用包括 EMAN2 6、IMAGIC7、FREALIGN 8、RELION 9、SPIDER 10 和 SPARX 11 在内的多个不同软件包，已对具有不同分子量和对称性的蛋白质实现了接近原子分辨率的结构解析。每个软件包对用户专业知识的要求不同，并在用户引导、自动化程度和可扩展性方面提供不同程度的支持。此外，一些程序提供了完整的分析环境，以支持图像分析的全部步骤，而另一些程序则专注于优化特定任务，例如从已知参考结构出发优化取向参数的精修。近年来，已开发出多个整合性平台，如 APPION 12 和 SCIPION 13，它们构建了统一的处理流程，整合了上述各类软件包中的方法与操作协议。

为了推动冷冻电镜（cryo-EM）技术的当前发展，SPARX 被重新开发为一个全新的独立且完整的单颗粒分析平台，称为 SPHIRE（用于高分辨率电子显微镜的 SPARX）。为了提高该技术对领域内新研究人员的可及性，并应对现代全自动高端电子显微镜产生的大量数据，处理流程经过重新设计和简化，引入了易于使用的图形用户界面（GUI），并对工作流程中的主要步骤实现了自动化。此外，新增了多种算法，以实现从冷冻电镜图像中快速、可重复且自动地进行结构解析。同时，引入了基于可重复性的验证方法，以避免在精细结构优化和异质性分析过程中常见的伪影。

尽管该程序经过了大量修改，但其备受认可的核心特性得以保留：简洁的开源代码、现代的面向对象设计，以及所有基本功能的 Python 接口。因此，该程序并未被改造成一个黑箱程序，用户仍可研究并轻松修改 Python 代码，以创建附加应用或调整整体工作流程。这对于非标准的冷冻电镜项目尤为有用。

本文介绍了一种利用SPHIRE图形用户界面（GUI）从冷冻电镜（cryo-EM）图像中获得近原子分辨率密度图的实验方案。该方案详细描述了从原始的冷冻电镜直接电子探测器电影数据生成密度图所需的全部步骤，且不限定于任何特定类型的生物大分子。本方案主要旨在为该领域的新手提供工作流程指导，并对数据处理中的关键步骤以及可能遇到的陷阱和障碍提供重要信息。SPHIRE的更高级功能及其理论基础将在其他文献中另行阐述。

方案

注意：要遵循本实验方案，必须在已安装 MPI 的系统（目前为 Linux 集群）上正确安装 SPHIRE。请从 http://www.sphire.mpg.de 下载 SPHIRE 和 TcdA1 数据集，并按照安装说明进行操作：http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download。此过程同时会安装 EMAN2。SPHIRE 当前使用 EMAN2 的 e2boxer 进行颗粒挑选，使用 e2display 显示图像文件。对于原始显微照片电影的剂量加权运动校正，SPHIRE 使用 unblur 14。请下载该程序并按照安装说明操作（http://grigoriefflab.janelia.org/unblur，Grigorieff 实验室）。为实现对所得结构的交互式可视化，本方案将使用分子图形软件 Chimera 15（https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html）。可通过以下链接学习熟悉本方案中所用功能的优秀教程：https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html。有关如何通过 SPHIRE 图形用户界面（GUI）向集群提交并行作业的说明，请参见：http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions。SPHIRE 图形用户界面的整体布局以及本方案中涉及的主要工作流程步骤如图 1所示。

1. 项目：为本项目设置常量参数值

  1. 通过输入命令启动 SPHIRE 图形用户界面应用程序 "sphire &" 以及在终端窗口中按回车键。
  2. 调整项目范围参数（例如， 像素大小、颗粒半径和对称性）在项目设置页面的相应输入字段中，然后将这些值注册到工作流程的后续所有步骤中。
    1. 点击 "项目" 左侧面板右下角的图标，以打开项目设置页面。
    2. 使用 e2display.py 图像交互显示工具测量颗粒的最长轴，然后将颗粒尺寸的一半输入到 "蛋白质颗粒半径". 如果测量单位为 Å，需注意使用像素尺寸将单位换算为像素例如， 如果一个颗粒的长度为 200 Å，像素大小为 1.2 Å/像素，则该颗粒最长轴的长度为 200/1.2 = ~166 像素，半径为 166/2 = 83 像素。
    3. 设置 "颗粒盒尺寸" 至少为粒子尺寸的1.5倍。避免使用包含大质数的窗口尺寸。同时请注意，当前的3D refinement算法要求盒尺寸为偶数。
      注意：窗口应包含一定边距，以弥补因挑选颗粒时初始定位不准而需在窗口内移动颗粒所产生的误差，同时确保颗粒边界外有足够的背景区域，以进行准确的CTF校正（对于较大离焦值尤其重要）。16).
    4. 设置 "CTF 窗口大小" 与……相同 "颗粒盒尺寸"对于对比度较低的数据项目，应使用较大的窗口以获得更平滑的功率谱估计。
    5. 设置 "点群对称性" 复合物的例如， "C5"）。如果目标结构的对称性未知，则保持其默认设置 "C1" （不对称）。然而，如果在后续处理过程中识别出特定的高阶对称性，则应相应地更改此对称性设置，并从ISAC的二维比对步骤之后重复后续操作。
    6. 设置 "蛋白质分子质量" 以 kDa 为单位（近似值即可）。按下 "注册设置" 按钮

2. 视频：对每张电影显微照片的帧进行对齐，以校正样品的整体运动

  1. 对于所有电影显微图像，需计算每帧的 x/y 平移量，然后生成其未加权剂量和加权剂量的运动校正平均图像（参见讨论部分）。请注意，前者仅用于 CTF 估计，因为 CTF 估计在使用加权剂量平均图像时效果不佳；而后者则用于结构解析的所有其他步骤。
    1. 点击 "视频" 图标，然后 "显微图像序列对齐" 按钮。设置 "Unblur 可执行文件路径" 通过选择可执行文件来设置 "输入显微图像路径模式 " 通过选择一幅原始的未对齐电影显微图像，并将文件名中的变量部分替换为通配符 "*" (例如， TcdA1_*.mrc)。指定路径以 "输出目录".
    2. 设置 "Summovie 可执行文件路径" 通过选择可执行文件。
    3. 设置 "电影帧数" 与每张电影显微照片中的帧数。设置 "显微镜电压" 和 "每帧曝光时间" 与数据采集期间使用的数值一致。（例如，如果总剂量为 60 e-/Å2 以20帧无预曝光记录，每帧的曝光量为60/20=3 e-/A2.) 按下 "运行命令" 按钮用于对齐每段电影显微图像的帧。
      注意：这将自动创建两个包含输出文件的目录 剂量未加权 和 剂量加权 运动校正后的平均显微图像

3. CTER：估计CTF的离焦与像散参数

  1. 为每张未按剂量加权的平均显微照片估算CTF参数（离焦值和像散；其余参数由用户设定）。
    1. 点击 "CTER" 图标，然后 "CTF 估计" 按钮。设置 "输入显微图像路径模式"选择一张未加权剂量的运动校正显微照片，然后将文件名中的变量部分替换为通配符 "*"。同时，指定路径为 "输出目录".
    2. 设置 "振幅对比" 到实验室中此类数据（冰层厚度是一个主要因素）和显微镜电压通常使用的数值例如， 10%）。典型值范围为 7 - 14%17.
    3. 设置 "显微镜球面像差（Cs）" 和 "显微镜电压" 数据采集过程中使用。
    4. 设置 "最低频率" 和 "最高频率" CTF 模型拟合的搜索范围设为 0.0285 和 0.285 Å-1 （40 - 4 Å）， respectively。按下 "运行命令" 按钮以估算CTF参数。
      注意：CTF 参数将自动存储在指定输出目录中的 partres.txt 文件中。对 112 张显微照片的 CTF 估计在 Linux 集群上使用 96 个核心进行计算，约 3 分钟后完成，所得结果具有代表性。

4. 窗口：从剂量加权平均显微照片中提取颗粒

  1. 使用 e2boxer 从显微照片中手动或自动挑选颗粒6 并生成坐标文件，每个文件包含相应显微照片中颗粒的xy坐标列表。
    1. 点击 "窗口" 图标，然后 "颗粒挑选" 按钮。按下 "运行命令" 单击按钮以启动 e2boxer 6并手动或自动挑选每张显微照片中的颗粒18 （参见 讨论）。将每张显微照片的最终颗粒坐标以 EMAN1 文件格式（.box）保存。或者，在将其他程序生成的坐标文件转换为 EMAN1 格式后导入。
  2. 通过从剂量加权的显微照片中提取颗粒图像来创建颗粒堆栈（在SPHIRE中，颗粒堆栈通常简称为 "堆叠").
    1. 按压 "颗粒提取" 按钮。指定 "输入显微图像路径模式" 通过选择一个 剂量加权 经运动校正的显微图像，然后将文件名中的可变部分替换为通配符 "*" (例如， TcdA1_*.mrc)。同样地，设置 "输入坐标路径模式" 通过选择一个坐标文件（例如， TcdA1_*.box）。指定路径以 "输出目录".
    2. 设置 "CTF 参数来源" 通过选择CTF参数文件（步骤3.1中生成的partres.txt）。按下 "运行命令" 按钮
  3. 将提取的粒子图像堆栈合并为一个。
    1. 点击 "颗粒堆栈" 按钮。指定路径到 "输出虚拟图像堆栈" 使用 BDB 文件路径格式（例如， "bdb：颗粒/堆栈"，其中 "颗粒" 指向包含BDB数据库目录的路径，该目录的名称始终为EMAN2DB "堆栈" 指该数据库中的特定图像堆栈。指定 "输入BDB图像堆栈模式" 通过选择以...开头的目录 "mpi_proc" 然后将目录名称中的变量部分替换为通配符 "*" (例如， 颗粒/mpi_proc_000 至 颗粒/mpi_proc_*）。按下 "运行命令" 按钮

5. ISAC：二维粒子图像分类

  1. 通过将颗粒进行对齐并根据其二维形态进行聚类，计算二维类别平均图像。
    注意：与单个颗粒图像相比，所得的二维平均图像具有更高的信噪比（SNR），因此可用于直观评估数据集的质量和异质性，并从图像堆栈中剔除不理想的图像例如， 冰晶、碳边缘、聚集体、碎片以及 等等。)19此外，它们将被用于确定一个初始的三维模型。
    1. 点击 "ISAC" 图标，然后 "ISAC - 二维聚类" 按钮.设置 "输入图像堆栈" 通过选择包含已提取颗粒的堆栈文件。指定路径以 "输出目录".
    2. 使用 200 - 1000 作为 "每类图像数量"根据预期的二维分类数量（粒子总数除以每类图像数量）选择合适的数值。根据信噪比（SNR）和数据集大小调整此参数。若数据集噪声过高，应增加每类成员数量；当可用粒子数量较少时，则应减少该数值。
      注意：由于内存限制，对于较大的数据集（>100,000 粒子），将完整数据集拆分为子集，对每个子集独立执行 ISAC，最后合并结果。有关此处理方案的详细说明，请访问 http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php。
    3. 检查 "相位翻转" 复选框。保留默认值 "目标颗粒半径" 和 "目标颗粒图像尺寸" 以加快进程，可使用这些设置自动缩小所有粒子图像。按下 "运行命令" 单击按钮以计算二维分类平均值。
      注意：此步骤对计算资源要求较高，运行时间随粒子数量、分类数、目标半径和图像尺寸的增加而显著延长。在配备96个进程的集群上，约10,000个粒子的二维分类耗时约90分钟完成。
  2. 显示并目视检查所得的ISAC二维平均图像，以确保其质量令人满意（参见讨论部分）。
    1. 按压 "显示数据" 按钮下方 "实用工具"设置 "输入文件" 通过选择包含ISAC 2D平均图像的文件（步骤5.1中生成的class_averages.hdf）。按下 "运行命令" 单击按钮以显示由 ISAC 提供的最终可重复且经过验证的类别平均图像。
  3. 创建一个新堆栈，仅包含已验证类别平均图像中的粒子成员。
    1. 按压 "创建堆栈子集" 按钮。设置 "输入图像堆栈" 通过选择与步骤 5.1.1 中相同的堆栈文件来设置 "ISAC 平均值" 通过选择ISAC二维平均图像（在步骤5.1中生成的class_averages.hdf）。指定路径以 "输出目录". 按下 "运行命令" 按钮

6. VIPER：计算初始三维模型

  1. 选择一小部分类别平均图像（≥100张），通过删除所有质量差的类别平均图像及颗粒的重复视角图像来完成（见讨论部分） 并使用它们通过 VIPER 计算可重复的初始模型。请注意，所选粒子应包含至少 60–80 个高质量的平均图像，每个平均图像包含约 200–500 个成员。
    1. 点击 "VIPER" 图标，然后 "显示数据" 按钮。设置 "输入文件" 通过选择ISAC二维平均图像（步骤5.1中生成的class_averages.hdf）。按下 "运行命令" 按钮
    2. 在 e2display 的图形窗口中某处按下鼠标中键，以激活 "DEL " 弹出窗口中的按钮。删除所有质量差的类别平均图像及粒子的重复视图（参见 讨论）。按压 "保存" 按钮，将剩余的2D类别平均值保存至新文件。
  2. 从选定的ISAC平均图像中，生成用于后续三维精修的初始参考模型。
    1. 点击 "初始三维模型 - RVIPER" 按钮。设置 "输入图像堆栈" 通过选择已筛选的类别平均图像（在步骤 6.1 中生成）来指定路径 "输出目录".
    2. 确保使用相同的数值 "目标颗粒半径" 如ISAC步骤5.1.3所述。按下 "运行命令" 按钮以生成可重复的结果 从头算 3D模型
      注意：此步骤计算量较大，运行时间随平均图像数量和颗粒尺寸的增加而显著延长。在配备96个进程的集群上，该任务（约100个类别平均图像）耗时约15分钟完成。
  3. 通过参考分类平均图像以及其结构完整性，检查所得三维模型是否合理即 无断开部分和/或方向性伪影）。要显示该图谱，请使用程序 Chimera15此时，如果存在同源蛋白或目标蛋白某个结构域的晶体结构，则应首先进行比对（示例见章节） 代表性结果).
  4. 对于后续的3D精细重构，从一个初始模型生成初始3D参考和3D掩模 从头算 通过去除其周围的噪声并重新缩放以匹配原始像素尺寸，获得三维模型。
    1. 点击 "创建3D参考" 按钮。设置 "输入体积" 通过选择 从头算 3D 模型（在步骤 6.2 中生成的 average_volume.hdf）。指定路径以 "输出目录".
    2. 设置 "重采样比率来源" 通过选择ISAC收缩比率文件（在步骤5.1中生成的README_shrink_ratio.txt）。按下 "运行命令" 按钮

7. MERIDIEN：优化初始三维体积

  1. 从初始的三维模型开始优化三维体积。
    1. 点击 "MERIDIEN" 图标，然后 "3D 精修" 按钮。设置 "输入图像堆栈" 和 "初始三维参考" 通过选择粒子堆栈和 从头算 3D 模型（在步骤 5.3 中生成） & 6.4，分别）。指定路径以 "输出目录".
    2. 设置 "3D 面具" 通过选择第6.4步生成的3D掩模文件。应始终使用3D掩模，但在分析的早期阶段，尤其建议使用球形掩模或边缘柔和的掩模，并使其大致贴合参考结构，以避免因掩模不准确而引入偏差。
    3. 检查 "应用硬性二维掩膜" 复选框。设置 "起始分辨率" 20 - 25 Å 的截止频率值。保持在 请注意，将对此初始三维结构应用截止频率为该值的低通滤波器，以降低初始模型偏差。
    4. 检查用于此过程的集群规格，然后进行设置 "每节点内存" 可用内存（GB）。按 "运行命令" 按钮可基于初始三维模型，以完全自动化的方式优化三维体积。
      注意：此步骤将数据集分为两半，独立优化两个模型，并输出两个原始体积图，每个图仅基于一半的粒子。该过程计算量较大，运行时间将随粒子数量显著增加。在该集群上，使用192个进程（约8,000个粒子，盒尺寸352）运行约2.5小时后完成meridian优化。
  2. 从优化后的体积数据创建一个边缘柔和的三维掩膜，用于后续的锐化步骤。
    1. 点击 "自适应三维掩模" 按钮。设置 "输入体积" 通过选择一个未过滤的半体积样本（在步骤7.1中制备），指定路径以 "输出掩模".
    2. 设定一个值 "二值化阈值"使用Chimera确保在此特定阈值下，噪声明显位于未过滤半图谱溶剂区域中目标体积之外，且蛋白质的所有密度仍相互连接。按下 "运行命令" 单击按钮以创建柔边3D掩膜。
      注意：生成的掩膜主体部分（由其值为的体素组成） >0.5）应紧密贴合颗粒结构，同时仍包含所有感兴趣的密度区域。软边缘衰减的宽度应至少为8-10像素。
  3. 合并通过3D refinement获得的两个未过滤的半体积数据。然后，根据探测器的调制传递函数（MTF）、估计的B因子以及分辨率的FSC（Fourier Shell Correlation）评估，调整功率谱以对合并后的体积进行锐化。
    1. 选择 "磨刀" 按钮。设置 "初滤半体积液" 和 "第二次未过滤的半体积" 通过选择相应的文件（步骤 7.1 中生成的 vol_0_unfil.hdf 和 vol_1_unfil.hdf）。始终使用 "B因子增强"通常，保持默认值，以便利用最终分辨率频率与10 Å之间的范围，从输入数据集中估算B因子值。或者，可指定一个 临时的 值（例如， -100).
    2. 保留默认值 "低通滤波器频率" 应用基于FSC的滤波器。
    3. 设置 "用户提供的掩膜" 通过选择第7.2步生成的3D掩膜。请注意，报告的分辨率将使用该掩膜通过FSC确定。按下 "运行命令" 按钮以锐化精细的3D图像。
  4. 由上述三维精细重构步骤估计的所有粒子的投影方向生成三维角度分布图。
    1. 点击 "角分布" 按钮。设置 "比对参数文件" 通过选择文件（第 7.1 步生成的 final_params.txt），然后按 "运行命令" 按钮。
  5. 使用 Chimera 目视检查经锐化的 3D 模型。确保该结构在达到的分辨率下呈现合理（参见 讨论).
  6. 使用 Chimera 目视检查角向分布。验证该分布在整个三维角空间中大致均匀覆盖。需要注意的是，对于对称结构，其分布被限制在唯一的非对称三角形区域内。

8. SORT3D：通过聚焦高变异性区域对三维异质性进行分类

  1. 根据3D精细重构所用的颗粒堆栈计算3D变异性图谱。
    1. 点击 "SORT3D" 图标，然后 "三维变异性估计" 按钮。设置 "输入图像堆栈" 通过选择提供给3D精细筛选步骤7.1.1的相同已筛选粒子堆栈，指定路径以 "输出目录".
    2. 保留默认值 "投影数量".
      注意：将使用来自角度邻域的图像来估计每个三维投影角度下的二维方差。该数值越大，估计的噪声越小，但分辨率越低，且旋转伪影更为明显。
    3. 检查 "使用 CTF" 复选框。按下 "运行命令" 按钮
  2. 使用3D变异性图谱为下方的3D聚类步骤创建聚焦掩膜。
    1. 选择 "二元三维掩模" 按钮。设置 "输入体积" 通过选择第8.1步生成的3D变异性图。指定文件路径以 "输出掩膜".
    2. 设置 "二值化阈值" 通过使用输出的 "水平" 领域中的 "体积查看器" 嵌合体。按下 "运行命令" 按钮
  3. 通过关注结构上高度可变的区域，将颗粒图像分类为结构均一的组别。
    1. 按压 "3D 聚类 - RSORT3D" 按钮。设置 "输入3D精修目录" 通过选择第7.1步生成的3D精修输出目录。指定路径以 "输出目录".
    2. 设置 "3D 面具" 通过选择软边缘3D掩膜（在步骤7.2中生成）。设置 "3D聚焦掩模" 通过选择在步骤8.2中生成的二值化三维变异性图。
    3. 对于大型数据集，至少使用 5,000–10,000 个 "每组图像"请注意，该程序始终将每组图像的数量保持在此设定值以下。调整该数值时，应考虑预期的3D组数量（粒子总数除以 "每组图像" 值）、数据集、信噪比以及异质性程度。如果粒子数量足够，除非预计数据集中存在更多不同的结构状态，否则初始3D分类组数建议设为约5-10个。
    4. 至少使用 3,000–5,000 个颗粒 "最小组规模"请注意，该程序将忽略图像数量少于设定值的组 "最小组规模". 按下 "运行命令" 单击按钮以执行三维聚类。
      注意：RSORT3D 分为两个步骤。第一步 "sort3d" 步骤可分离出三维异质性，随后利用上述三维精修步骤确定的三维对齐参数，重建每个均质结构组的体积。第二个 "rsort3d" 该步骤通过两次独立分选运行的双向比较，找出各组中可重复的成员，随后仅利用可重复分配的颗粒重构均一结构。在配备96个核心的集群上，该任务（约8,000个颗粒，盒尺寸352）耗时约3小时完成。
  4. 程序运行结束后，使用 Chimera 选择一个均一的三维类别。选取表观分辨率最高的结构，该结构通常对应于粒子数最多的类别。在选择结构时，需结合目标蛋白的二维分类平均图像及其生物学特性，确保所选结构在视觉上合理（参见 讨论）。如果其他体积在相似分辨率下具有几乎相同的结构，则将其视为来自单一均质三维组。
  5. 对最均一的三维类别（分辨率最高）中的颗粒成员进行局部优化。
    1. 点击 "局部子集优化" 按钮。设置 "子集文本文件路径" 通过选择包含所选组颗粒ID的文本文件（例如， 步骤8.3中生成的Cluster0.txt）。设置 "3D 精修目录" 通过选择上一步3D精修的输出目录（在步骤7.1中生成）来完成。
    2. 设置 "重新启动迭代" 达到上一轮三维精修最高分辨率的那一个。按下 "运行命令" 单击按钮以对选定的粒子群体进行局部优化。
  6. 与步骤7.2类似，利用局部子集精细重构生成的未过滤的最终半体积数据，创建一个边缘柔和的三维掩模。
  7. 类似于步骤 7.3，合并由局部子集精细化得到的两个未过滤的最终半体积，并对合并后的体积进行锐化。但此次不要对锐化后的体积进行过滤。
    注意：如果步骤 8.4 中的异质性分析表明存在多个分辨率相近的明显状态，可考虑对所有不同状态进行独立优化。

9. LOCALRES：估算最终三维体积的局部分辨率

  1. 评估从均一粒子集获得的三维体积的局部分辨率。
    1. 点击 "LOCALRES" 图标，然后点击 "Local Resolution" 按钮。在“局部子集精细化”步骤（第8.5步）中生成的未滤波最终半体积文件中，选择作为 "First half-volume" 和 "Second half-volume"。使用第8.6步生成的软边缘三维掩膜作为 "3D mask"。为 "Output volume" 指定输出文件路径。
    2. 将 "FSC window size" 保持默认值7像素。请注意，该参数定义了用于计算局部实空间相关性的窗口大小；较大的窗口尺寸会产生更平滑的分辨率图，但会降低局部可分辨能力。
    3. 将 "Resolution cut-off" 的分辨率阈值保持默认值0.5。
      注：对于每个体素，程序将报告局部分辨率为局部FSC下降至所选阈值以下时对应的频率。不建议使用低于0.5的阈值，因为较低的相关性值具有较高的统计不确定性，因此对应的局部分辨率在不同体素间会有较大波动。
    4. 对于 "Overall resolution"，设置局部子集精细化后在锐化步骤中估计的绝对分辨率（第8.7步）。点击 "Run command" 按钮以计算该体积的局部分辨率。
  2. 利用三维局部分辨率图，对局部子集精细化后锐化的体积应用三维局部滤波。
    1. 点击 "3D Local Filter" 按钮。在“输入体积”"Input volume" 中选择第8.7步生成的已锐化但未滤波的三维体积。类似地，分别设置第9.1步和第8.6步生成的 "Local resolution file" 和 "3D mask"。请注意，三维掩膜定义了将应用局部滤波的区域。指定 "Output volume" 的输出路径。点击 "Run command" 按钮以应用三维局部滤波。
  3. 使用Chimera可视化检查最终的三维模型和三维局部分辨率图（分别由第9.2步和第9.1步生成）。选择 "Surface color" 选项，根据局部分辨率对三维体积进行着色。请注意，局部分辨率的分布应平滑（参见 讨论）。

结果

上述方案从A组分的112个直接检测器电影文件开始执行 Photorhabdus luminescens Tc复合物（TcdA1） 20,21,22该数据集是在一台配备高亮度场发射枪（XFEG）的Cs校正电子冷冻显微镜上采集的，加速电压为300 kV。图像采用自动采集模式获取，总剂量为60 e⁻-/Å-2 在样品尺度上像素大小为1.14 Å。对电影帧进行对齐后（步骤 2），所得运动校正后的平均图像显示出各向同性的Thon环，可延伸至高分辨率（图2a）。单个颗粒清晰可见且彼此分离良好（图 2b）。随后使用 e2boxer 的 swarm 工具选取颗粒 18 (步骤 4.1）。在这种情况下，使用更具选择性的选项设置了适当的阈值（图 2c）。这112张数字显微照片共获得9,652个颗粒。大多数提取的图像（步骤 4.2) 包含轮廓清晰的颗粒，其盒尺寸约为颗粒尺寸的1.5倍，符合推荐要求（图 2d）。接下来，使用ISAC进行二维异质性分析（实验步骤 5）。共获得 98 个类别平均值（图3a）。利用这些二维分类平均图像，一个 从头算 模型使用 VIPER 计算得出步骤 6）在中等分辨率下（图 3b该模型与先前解析的TcdA1晶体结构（分辨率为3.9 Å）高度吻合。 22 (图 3c）。这 从头算 模型被用作三维精修（MERIDIEN）的初始模板，得到分辨率为3.5 Å（0.143标准）的重构结构（步骤 7仅来自约 40,000 个非对称单元（图4）。该近原子分辨率图谱在 24 小时内获得，流程中受益于多核并行计算的步骤最多使用了 96 个 CPU。

用于三维变异性分析 （实验步骤 8） 每组仅使用 2,000 张粒子图像进行步骤 8.3.3 的分析（即 该过程从5个初始3D分类组开始，在步骤8.3.4中，由于粒子数量较少（约10,000个），最小分组的图像数量为200张。分析结果显示，复合物的N端区域存在局部柔性，该区域包含用于纯化的His标签（图 5a）。事实上，在先前发表的TcdA1晶体结构中，N端的十二个残基和His标签均未解析。 22 而这一极可能无序的区域在当前的冷冻电镜密度图中仍未解析，可能因其具有较高的柔性所致。在受体结合域和BC结合域也检测到了额外的变异性。图 5a）。由于整体结构的分辨率令人满意，且数据集相对较小，这种异质性被认为可以接受，因此进行了聚焦的三维分类 23 未进行。最后，计算了最终密度图的局部分辨率（实验步骤 9.1，图 5b）以及锐化后的3D图谱进行了局部滤波（步骤 9.2）. 此质量的体积可用于 从头合成 使用 Coot 进行模型构建 24 或任何其他优化工具（图6).

SPHIRE 工作流程图；图像处理步骤：比对、CTF 估计、颗粒提取。
图 1：使用 SPHIRE 进行图像处理。（a）SPHIRE 软件包的图形用户界面（GUI）。通过选择 GUI 左侧相应的图标（“工作流程步骤”），可激活特定的工作流程步骤。与该步骤相关的命令和工具将显示在 GUI 的中央区域。选择其中一个命令后，相应的参数将显示在 GUI 右侧区域。高级参数通常无需修改预设的默认值。（b）使用 SPHIRE 图形界面进行单颗粒图像处理的工作流程各阶段。请点击此处查看此图的放大版本。

冷冻电镜成像过程；傅里叶变换、颗粒筛选、二维分类平均用于结构分析。
图2：运动校正与颗粒提取。 (a, b典型的高质量、低剂量、漂移校正的数字显微照片，记录于欠焦状态下 1.7 µm注意功率谱（a）中各向同性的Thon环延伸至2.7 Å的分辨率，以及二维图像中清晰可辨的颗粒b). (c使用 e2boxer 进行颗粒筛选。绿色圆圈表示已选中的颗粒。d) 从剂量加权显微照片中提取的典型原始颗粒。标尺 = 20 nm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

冷冻电镜分析；三维结构重建；蛋白质复合物可视化；电子显微镜。
图3：二维聚类与初始模型生成。（a）二维分类平均图像集，其中大多数代表颗粒的侧视图。比例尺 = 20 nm。（b）基于无参考分类平均图像，使用RVIPER获得的TcdA1的从头计算（ab initio）三维图谱。（c）将TcdA1晶体结构（带状图，PDB编号 1VW1）刚体拟合至初始冷冻电镜密度图（透明灰色）中。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜结构分析、蛋白质复合物、三维密度图、分子构型、结构生物学。
图 4：TcdA1 的冷冻电镜三维结构。（a，b）基于约 9,500 张颗粒图像计算得到的 TcdA1 最终 3.5 Å 密度图：（a）侧视图和（b）顶视图。（c）α-螺旋和 β-折叠的冷冻电镜密度图代表性区域。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质结构分析、受体结合域、结构示意图、分子可视化
图 5：变异性分析与局部分辨率。（a）经锐化的 TcdA1 冷冻电镜图谱表面（灰色）与变异性图谱（绿色）。为更清晰显示，变异性图谱已进行 30 Å 低通滤波处理。（b）根据局部分辨率（Å）着色的 TcdA1 锐化冷冻电镜图谱表面渲染图。注意高变异性区域与低局部分辨率区域之间的拓扑一致性。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结构可视化；线框模型图；分子建模软件界面
图6：使用Coot构建TcdA1的3D模型 展示了α-螺旋的代表性冷冻电镜密度图与原子模型。原子模型已构建完成 从头合成 使用 Coot。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

近年来，单颗粒冷冻电镜技术发展迅速，已解析出大量具有重要生物学意义的大分子复合物的原子分辨率结构25。为了支持当前大量进入该领域的初学者用户，我们开发了单颗粒图像分析平台 SPHIRE，并在此提供涵盖整个工作流程的详细操作方案，包括电影图像校正、颗粒挑选、CTF 估计、初始模型计算、二维和三维异质性分析、高分辨率三维重构以及局部分辨率估计与过滤。

本文所述方案旨在提供一份简明指南，用于利用目标蛋白的冷冻电镜显微图像，结合SPHIRE独立图形用户界面提供的计算工具，进行三维结构的测定。

该工作流程的主要特点是，由于其基于可重复性验证的概念19，且无需调整参数，大多数步骤仅需运行一次。这种自动验证机制是SPHIRE相较于其他软件包的主要优势，因为其结果不仅客观且可重复，更重要的是能够在可接受的计算成本下获得。此外，该流程还为有经验的用户提供大量诊断信息，以便使用自己的方法进行进一步的独立验证和评估。尽管如此，只要具备结构生物学和电子显微镜基本理论背景的新手用户，也应能够利用自己的数据和自动化验证流程获得接近原子分辨率的结构。

然而，获得接近原子分辨率的结构并不总是容易的，结果在很大程度上取决于样品质量和输入数据的质量。本文所述方法假设已具备足够数量的高质量未对齐原始电镜电影数据，其平均图像应能清晰显示均一且随机取向的单颗粒。通常情况下，分子的对称性、大小或整体形状并无限制，但低分子量可能成为限制因素，特别是当蛋白质呈无特征的球状结构时。一般而言，对具有高点群对称性的较大、有序颗粒进行分析的要求较低。因此，强烈建议初学者首先使用一个特征明确的冷冻电镜数据集运行本方案。SPHIRE 教程数据（http:/sphire.mpg.de）或 EMPIAR 提交的带有原始电影数据的数据集（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）都是良好的起点。

在处理自身数据时，某些数据集或某些图像很可能不满足特定的质量标准。因此，除了程序对工作流程主要步骤进行的自动化稳定性与可重复性检查外，仍建议用户在实验方案的某些"检查点"对结果进行目视检查，特别是当最终重建结果不理想时。

在完成影片对齐（实验步骤 2）和CTF估计（实验步骤 3）后，可首先在显微照片水平进行初步视觉检查。所得的运动校正平均图像应能清晰分辨出独立且分离良好的单颗粒，其功率谱应显示出清晰可辨、各向同性的萨恩环（Thon rings）。这些环可见的空间频率通常决定了该结构原则上最终可达到的最高分辨率。足够质量的运动校正平均图像及其功率谱示例见“"代表性结果"”部分。可借助SPHIRE提供的漂移与CTF评估图形界面工具（http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php）剔除可能对最终结果产生负面影响的异常图像。

在颗粒筛选方面，SPHIRE 流程中的关键步骤是使用 ISAC 进行二维分类（实验步骤 5.2）。在此步骤中，用户应确认程序自动识别出的可重复二维类别平均图是否涵盖了足够范围的取向，从而近似均匀地覆盖角度空间。如果类别平均图的质量不理想（图像噪声大和/或模糊）和/或可重复的类别平均图数量过少，则应考虑改进自动颗粒挑选的质量、优化数据集成像条件或样品制备。在大多数情况下，若无法获得良好的二维类别平均图，则无法从该数据集中计算出可靠的三维重构结果。高质量二维类别平均图的示例如“"代表性结果"”部分所示。

使用 RVIPER 自动化方式获得可靠的初始三维模型至少需要 100 个类别平均图像（实验步骤 6.1）。在此步骤中，用户应选择质量最高的平均图像，并尽可能包含颗粒的多种不同取向。初始模型的质量对于后续高分辨率三维精修的成功至关重要。

在其他软件包中，有时会进行三维分类以去除"不良"颗粒8,9。然而，在 SPHIRE 中，这些颗粒中的大多数已在使用 ISAC 进行二维分类时被自动剔除。因此，仅当重构结果和三维变异性分析表明数据集存在异质性时，才建议执行计算量较大的三维分类步骤。

最重要的是，用户应始终仔细检查生成的三维结构（实验步骤 9.3），并确认相应密度特征与标称分辨率相符。在约 <9 Å 的分辨率下，对应于 α-螺旋的棒状密度开始可见；在约 <4.5 Å 的分辨率下，对应于 β-折叠中β链的密度通常能清晰分离，且体积较大的氨基酸变得可见。高分辨率图谱（约 <3 Å）应能清楚分辨侧链，从而可构建精确的原子模型。

迄今为止获得的结果表明，在 SPHIRE 的自动化可重复性测试和最少视觉检查的帮助下，本方案通常适用于任何类型的单颗粒冷冻电镜项目。各处理步骤的代表性结果以 TcdA1 毒素的重构为例展示 Photorhabdus luminescens 21，该结构已解析至接近原子级分辨率。类似质量的密度图可用于构建可靠的原子模型 从头合成 骨架追踪以及互易空间或实空间精修，从而为理解复杂的分子机制提供坚实的结构框架。

登录号：

EM结构的坐标以及未处理的电影数据已分别存入电子显微镜数据银行和电子显微镜试点图像档案库，登录编号分别为EMD-3645和EMPIAR-10089。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢D. Roderer提供了TcdA1的显微照片。我们感谢Steve Ludtke对EMAN2基础设施的持续支持。本工作获得了马克斯·普朗克学会（资助对象：S.R.）的资金支持，以及欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）提供的资助（项目编号：615984，资助对象：S.R.），同时获得了美国国立卫生研究院R01 GM60635项目对P.A.P.的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SPHIRE马克斯·普朗克分子生理学研究所-德国多特蒙德  和德克萨斯州休斯顿医学院 http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera加利福尼亚大学旧金山分校http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur珍利亚农场研究园区，阿什本http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot英国剑桥分子生物学MRC实验室 http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2贝勒医学院，休斯顿http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
含1824个核心的计算集群马克斯·普朗克分子生理学研究所由76 个节点组成的Linux集群，每个节点配备2个Xeon E5-2670v3 12核2.30 GHz处理器和128 Gb内存
TITAN KRIOS电子显微镜 FEI300 kV，球差校正，XFEG
Falcon II直接电子探测器FEI
EPU（自动化数据采集软件）FEIhttps://www.fei.com/software/epu/

参考文献

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

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