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方法文章

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

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DOI：

10.3791/55450

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2017年5月31日

 ,  ,  , 
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

本文内容

摘要

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR 小鼠进行气管内注射白喉毒素诱导产生。

摘要

光片荧光显微镜（LSFM）结合化学透明化技术，已成为分析大型生物样本中荧光标记结构的金标准，其分辨率可达单细胞水平。与此同时，基础实验方案的持续优化以及专用商业化系统的日益普及，使我们能够研究完整小鼠器官的微结构，甚至可在多种活细胞成像方法中表征细胞行为。本文介绍了一种用于空间整体成像并定量分析炎症小鼠心脏中CD45+白细胞群体的实验方案。该方法采用一种转基因小鼠品系（CD11c.DTR），该品系最近已被证实可作为研究暴发性致死性心肌炎发展的可靠且可诱导的模型，其特征为致死性心脏心律失常。本方案包括心肌炎诱导、活体抗体介导的细胞染色、器官制备以及LSFM成像，随后进行计算机辅助的图像后期处理。尽管本方案是针对特定科学问题高度优化的方法，但它代表了一个易于调整的系统框架，也可用于靶向其他器官甚至其他物种中完全不同的荧光结构。

引言

在光学显微镜的发展过程中，出现了许多专用形式，这些技术均旨在针对特定样本的观察过程，最大限度地克服成像中的局限性。其中一种方法是光片荧光显微镜（LSFM）。该技术最早由 Siedentopf 和 Zsigmondy 于 1903 年开发1 并在20世纪90年代初首次实现了基础生物学应用2，光片荧光显微镜（LSFM）已成为迄今为止最强大的显微工具，可用于可视化大型样本（如完整的小鼠器官），其荧光信号分辨率可达细胞水平。由于这些优势，加之其在活细胞成像方面的潜力，《自然-方法学》将LSFM评为 "2014年度方法3."

顾名思义，光片荧光显微镜（LSFM）中的样品照明是通过光片实现的，这些光片的取向垂直于用于收集发射光并进行后续成像的物镜光轴。光片通常通过两种方式产生：一是使用柱面透镜将宽幅平行激光束聚焦，二是在单一水平或垂直平面内快速横向移动细窄的聚焦激光束4,5。通过这种方式，仅对成像光学系统的焦平面进行照明，其典型厚度为1–4 µm。因此，对于置于照明平面内的荧光样品，来自焦平面上方或下方区域的散射光产生以及光漂白效应均被消除或显著抑制6,7。由于所有非焦平面均未被照明，这些区域中的光漂白效应也被避免。与标准共聚焦或多光子显微镜不同，照明光路与发射光路彼此分离，因此最终的图像质量不依赖于激发光束通过物镜时的完美聚焦。根据具体研究问题的不同，可以选用具有极大视场（FOV）的物镜，从而在无需任何部件沿xy方向移动的情况下，对被照明平面中尽可能大的区域进行成像。

在现代光片荧光显微镜（LSFM）系统中，生成的光学切片的荧光图像被采集到高灵敏度的电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机上，这些相机能够在微秒内获取整个视场（FOV）。因此，通过使样品在光片中移动，并在设定的z步长下采集图像，可以在合理的时间内获得样品完整的三维信息8,9，使得该技术适用于活细胞研究10,11,12。

然而，尽管光片荧光显微镜（LSFM）提供了一种快速、灵敏且对荧光友好的成像方法，光在样本中的穿透仍然是一个主要问题，尤其是在对较大的生物样本进行三维分析时。光的穿透受到吸收和在不同折射率结构界面处光散射等物理因素的显著影响13。因此，在对尺寸达数毫米的样本进行成像时，LSFM通常需与组织透明化技术联合使用，以使样本在光学上变得透明。这些技术的基本原理是去除生物组织中的水分，并将其替换为水性或（有机）溶剂基的浸没介质，这些介质的折射率被选择为与目标组织成分的折射率高度匹配。由此可最大限度地减少侧向光散射，使各种波长的光能够更高效地穿透组织13。在许多情况下，经过此类处理的生物样本在宏观上呈现出完全透明的状态，从而使得即使是对完整的小鼠器官，也能利用长工作距离、低倍物镜顺利进行LSFM成像。

本文介绍了一种用于光片显微镜（参见材料表）中大样本成像的制备方案，该方案由我们建立，旨在研究心肌炎小鼠模型中的心脏细胞浸润15。CD11c.DTR 小鼠在 CD11c 启动子的调控下表达灵长类白喉毒素受体（DTR）16。因此，这些小鼠中表达 CD11c 并同时表达 DTR 的细胞对Corynebacterium diphtheria（白喉毒素，DTX）的外毒素敏感；对这些动物进行系统性 DTX 处理可导致所有 CD11c+ 细胞的耗竭。CD11c 是一种整合素，作为多种可溶性因子的细胞表面受体，主要参与单核细胞谱系细胞的活化与成熟过程17。因此，CD11c.DTR 小鼠模型已被广泛用于研究树突状细胞及巨噬细胞亚群在多种免疫学问题中的作用。随着时间推移，已有报道指出，系统性接受 DTX 处理的 CD11c.DTR 小鼠可能出现严重的不良反应，并表现出显著升高的死亡率18,19。最近，我们成功鉴定了其致死原因15，即在这些动物中经气管给予 DTX 后引发暴发性心肌炎。毒素攻击导致心肌组织的细胞破坏，包括心脏电冲动传导系统的核心区域。此过程伴随大量 CD45+ 白细胞浸润，最终引发致死性心律失常。在此情况下，不仅白细胞群体的表型特征重要，其在心脏内的空间分布同样关键。这一实验问题对现代显微成像技术提出了挑战，我们通过结合活体抗体染色与基于有机溶剂的光学透明化方案的光片显微镜技术成功解决了该问题。

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方案

所有动物实验均按照欧盟指南进行，并获得了德国埃森市相关地方主管部门的批准（AZ 84-02.04.2014.A036 - 北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局，德国埃森）。动物在特定病原体-free（SPF）条件下饲养和使用。

1. 利用白喉毒素（DTX）诱导心肌炎

  1. 通过将DTX储备液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至1 µg/mL，配制用于诱导心肌炎的DTX工作液。
  2. 将100 µL该溶液经气管内（i.t.）注射至8至10周龄的CD11c.DTR小鼠约 5 ng/g 体重（bw），如 Hasenberg 所示 等 对于 i.t. 真菌孢子悬液的施用20.
    注意：毒素的腹腔注射可能引起类似的致死性心肌炎。然而，该方法首先需要经过验证。
    1. 对于气管内给药，通过腹腔注射每千克体重100 mg的氯胺酮和每千克体重10 mg的赛拉嗪对动物进行麻醉。
    2. 深度麻醉后（趾捏无反应），通过口腔使用22 G静脉留置导管对动物进行插管。通过小动物呼吸机以每分钟250次呼吸频率、每次250 µL潮气量对动物进行通气，以确认导管位置正确，该方法亦由Hasenberg展示。 等20.
      注意：当位置正确时，动物的呼吸频率会根据设定的通气参数而变化。
    3. 断开呼吸机系统，通过导管向肺部注入100 µL DTX溶液或等量的PBS作为对照，随后继续对动物通气1分钟。
  3. 让动物从麻醉中恢复，并监测其一般健康状况和体重变化，持续4天。
    注意：根据遗传背景、小鼠品系或初始体重的不同，心肌炎的严重程度和发病时间可能有所差异，应首先确定。

2. 光片显微镜样品制备

  1. 毒素处理4天后，使用2%异氟烷/氧气混合气体麻醉小鼠。通过眶后静脉注射途径，在50 µL PBS中静脉注射15 µg直接标记的抗CD45抗体（克隆30-F11，AlexaFluor647（AF647）），该途径可确保抗体快速、准确地注入预定剂量。
    注意：当小鼠呈侧卧状态且对脚趾夹捏测试无反应时，即已达到所需的麻醉深度。
  2. 孵育2小时后，通过颈椎脱位处死小鼠，并灌注心脏 原位 用5 mL PBS/EDTA（5 mM）处理。
    1. 暴露心脏，使用21 G导管将灌注液注入右心室。以缓慢且恒定的压力进行灌注，并在切开主动脉后确保血液能够排出。
      注意：这种经心脏灌注可能会产生轻微的制备伪影，从而影响器官最终的三维可视化效果。因此，经验丰富的动物实验人员可通过下腔静脉进行灌注，并切除腹主动脉。
  3. 通过同一隐窝用 5 mL 4% 多聚甲醛（PFA）对心脏进行灌注固定。保持导管位置不变，仅更换装有 PFA 的新注射器，以缓慢且恒定的压力进行灌注。
    注意：多聚甲醛具有高毒性，避免接触皮肤、眼睛及其他黏膜。
    1. 用有齿镊轻轻夹住心脏，稍向上提起，剪断所有组织连接，包括进出的动脉和静脉。将器官置于4%多聚甲醛中继续固定4小时。
  4. 为了对器官进行脱水，将心脏置于递增浓度的乙醇系列中孵育，依次为50%、70%和两次100%乙醇，每次12小时，于4 °C避光条件下进行。此处使用黑色5 mL聚丙烯反应管，并将其置于管式旋转仪中以缓慢转速持续旋转，以防止气泡形成。
  5. 通过化学透明化完成样本制备。为使心脏组织透明，将其置于98%二苄基醚（DBE）中，在持续旋转条件下孵育过夜。
    注意：DBE 对眼睛、皮肤和呼吸系统有刺激性。

3. 光片显微镜

  1. 使用光片显微镜（参见材料表）进行光片荧光显微成像（LSFM）。将样品置于标准样品架上，并放入盛有二苯醚（DBE）的比色皿中，适用于尺寸不超过 30 mm × 30 mm × 15 mm 的样本。
  2. 使用脱水并透明化的琼脂糖块在图像采集过程中牢固固定样品。
    1. 制备琼脂糖块时，将 2% 熔融琼脂糖倒入模具（15 mm × 15 mm × 5 mm）中。待琼脂糖冷却至完全凝固。
    2. 将琼脂糖块依次浸入递增浓度的乙醇溶液中脱水（50%、70% 和两次 100%）。随后在 98% DBE 中孵育过夜。之后将琼脂糖块保存于 DBE 中，待用。
      注意：由于琼脂糖主要由水组成，各脱水步骤的孵育时间可能需根据琼脂糖块的大小适当延长。
      注意：DBE 对眼睛、皮肤和呼吸系统具有刺激性。
    3. 使用时，用锋利的解剖刀将制备好的琼脂糖块切割成所需形状。通常切割为棱柱形或楔形，置于样品架边缘固定样品。
      注意：由于琼脂糖块具有弹性，施加轻微压力即可使样品稳定固定。
  3. 使用合适的激发和发射滤光片设置，检测目标荧光信号（此处为自发荧光和抗 CD45 抗体染色信号）。
    1. 检测结缔组织来源的自发荧光信号时，采用 488 nm 激发波长（OPSL：50 mW），使用 525/50 nm 带通滤光片；检测 AF647 标记抗体对 CD45 的染色信号时，采用 647 nm 激发波长（半导体激光器：50 mW），在 668 nm 处检测信号（带通滤光片：680/30 nm）。
    2. 选择 4 µm 作为相邻两个 z 层图像之间的间距。

4. 图像后期处理

注意：获取的数字图像数据需使用科学的 3D/4D 图像处理与分析软件进行进一步处理（参见材料表）。

  1. 打开并预调整数据文件。
    1. 启动分析软件后，选择左上角的 "Surpass" 按钮。要打开图像堆栈，请选择 "文件"、"打开"，然后选择包含第一个采集通道数据的文件夹。选择 "编辑" 和 "添加通道" 以添加其他已采集的通道。
      注意：根据数据大小和计算机系统，此过程可能需要数分钟。本方案以两个采集通道（自发荧光和 AF647）为例演示所有步骤。
    2. 通过点击 "编辑" 并选择 "图像属性" 来校正 x、y 和 z 体素尺寸。新窗口打开后，调整相应参数。
      注意：此步骤取决于所使用的显微镜系统和特定数据格式。正确的 x-y-z 值对于后续的尺寸和距离测量至关重要。大多数情况下，这些参数作为元数据存储在显微图像文件中。然而，如果分析软件无法正确解析文件格式，则必须手动输入像素尺寸。x 和 y 维度的像素尺寸取决于相机像素尺寸、可能应用的像素合并（binning）以及物镜和镜头的放大倍数。z 维度的像素尺寸等于自定义的 z 步长（例如，4 µm）。
  2. 通道调整
    1. 首先通过打开 "显示调整"（"编辑" 和 "显示显示调整"）将自发荧光信号转换为灰度图像。新窗口将列出所有已打开的通道及其显示设置；为更改其默认颜色，选择自发荧光通道并选择 "白色" 显示样式。点击 "确定" 应用设置。
    2. 进行黑电平调整时，返回到 "显示调整"，并调整黑电平值，以排除不代表样品结构的非必要背景信号。
      1. 为此，使用通道条左上角的三角形，将其从左向右拖动。
        注意：更改将立即可视化。确保仅抑制非来源于样品的信号。背景中的最小值不应为 "0"，以避免出现纯黑色像素，因为噪声信号可能在后续计算中需要。确保所有黑电平调整均在图像采集完成后进行，否则可能丢失有价值的样品信息。黑电平调整仅用于可视化目的。若要在不同样品间使用相同的显示设置，可将精确数值输入通道列表下方的 "最小值" 数值框中。这对定量分析非常有帮助。
    3. 通过使用通道条右上角的三角形调整相应通道的强度，或在通道列表下方的 "最大值" 数值框中输入精确值，进行强度调整。
    4. 通过拖动通道条中间下方的三角形来增加或减少伽马值，或输入精确数值，进行对比度调整。
    5. 将 AF647 通道的调整参照自发荧光通道进行。不同之处在于，将 AF647 信号的可视化设置为热图颜色查找表。可通过在类似步骤 4.2.1 的方法中选择通道模式 "fire" 来实现。
      注意：由于 AF647 通道的整体信号强度显著低于自发荧光通道，黑电平通常需调整至更低的值。与自发荧光通道类似，该通道的亮度通常也需要提高。
    6. 选择 "混合模式" 以详细显示组织结构。对同一系列的所有样品使用相同的参数值进行分析。
  3. 虚拟裁剪
    1. 在导出 3D 场景前，若需虚拟切开器官，可在渲染的 3D 对象上应用裁剪平面。
      1. 点击对象列表中的 "裁剪平面" 图标（剪刀）。在图像视图内将出现一个黄色框架和一个操纵器（白色纺锤形）。用鼠标旋转纺锤形较细的一端，从而改变裁剪平面的方向，并移动纺锤形较粗的中间部分以选择所需的裁剪深度。
      2. 通过取消勾选对象列表下方相应的复选框来隐藏框架和操纵器，并生成所需的快照。

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结果

所介绍的光片荧光显微镜方法用于分析小鼠心脏在诱发重度心肌炎后白细胞的分布与数量。 图1A 说明用于心肌炎诱导的转基因 CD11c.DTR 小鼠的预处理方案。该步骤是触发白细胞向心肌募集所必需的。成功给予 DTX 后，动物在 2–4 天内出现严重疾病症状，如全身虚弱、厌食和体重下降。4 天后，通过尾静脉注射对白细胞进行标记. 在经心脏灌流以清除循环血液之前，应用荧光染料偶联的抗-CD45抗体。若操作成功，心脏及其他器官将呈现苍白色。随后切除器官，通过梯度乙醇脱水并最终在DBE中孵育，置换组织中的水分。 图1B 展示了器官在各个孵育步骤中的时间表，期间器官会发生显著收缩。化学透明化处理后的器官随后被转移至装有DBE的成像腔室，并置于标准显微镜组织支架上。为在三维图像采集过程中稳定器官，使用透明琼脂糖块对其进行固定。样品的详细定位如图所示。 图2整个图像堆栈的采集包含两个通道（自发荧光和抗 CD45），耗时约 20–30 分钟，生成的数据文件大小约为 16 G...

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讨论

在现代生命科学中，生物过程的显微可视化正发挥着越来越重要的作用。在此背景下，过去两个世纪取得了许多进展，使得此前无法回答的问题得以解决。首先，光学显微镜的分辨率能力出现了显著的根本性提升。通过结构照明显微术（structured illumination microscopy, SIM）21,22、受激发射损耗显微术（stimulated emission-depletion microscopy, STED）23、光激活定位显微术（photo-activated localization microscopy, PALM）24,25以及随机光学重建显微术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）26，曾经因光衍射所提出的分辨率限制

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Gunzer 实验室的研究得到了德国联邦教育与研究部（资助号：0315590 A-D）和德国研究基金会（资助号：GU769/4-1，GU769/4-2）的支持。我们进一步感谢 IMCES 提供的技术支持，以及 Sebastian Kubat 在 3D 卡通建模方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
白喉毒素Sigma AldrichD0564
磷酸盐缓冲液BiochromL182-10
氯胺酮 [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
赛拉嗪 [2%]Ceva
注射器布劳恩参考编号 9161502Braun Omincan F 
留置静脉导管 Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
小型动物呼吸机哈佛仪器73-0044MiniVent
抗CD45抗体（AF647）BioLegend103124
乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物卡尔·罗斯8043.2
导管（21 G）BD 生物科学参考编号 387455BD valu-set
多聚甲醛Sigma AldrichP6148
PE管（5 mL）卡尔·罗特EKY9.1Rotilabo
乙醇卡尔·罗斯9065.4
二苄基醚Sigma-Aldrich108014
试管旋转仪Miltenyi Biotec130-090-753MACSmix
琼脂糖（低凝胶温度）Sigma AldrichA4018
模具（15 × 15 × 5 mm）Tissue Tek4566冷冻模具 
光片显微镜系统LaVision Biotec超微显微镜 
显微镜主体OlympusMVX10 
目的Olympus0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 毫米 
sCMOS相机 5.5MPAndor Technology
488 nm OPSL（50 mW）激光器相干
647 nm  二极管激光器（50 mW）相干
三维图像处理 &和分析软件BitplaneIMARIS 版本 8.3
转基因小鼠品系Steffen Jung 等CD11c.DTR
野生型小鼠品系EnvigoBalb/c Ola Hsd J
激光模块LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC物镜

参考文献

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