通过轻型显微镜对小鼠急性心肌炎模型中白细胞浸润的定量可视化

摘要

在这里，我们描述了在无菌暴发性心肌炎的鼠模型中可视化心脏CD45 ⁺白细胞浸润的光照片显微镜方法，其由气管内白喉毒素治疗CD11c.DTR小鼠诱导。

摘要

光谱荧光显微镜（LSFM）与化学清除方案相结合，已经成为分析大型生物标本中荧光标记结构的黄金标准，并且归功于细胞分辨率。同时，不断改进的底层协议和增强的专业商业系统的可用性使我们能够调查整个小鼠器官的微结构，甚至允许表征各种活细胞成像方法中的细胞行为。在这里，我们描述了空间整体可视化和发射小鼠心脏CD45 ⁺白细胞群体定量的方案。该方法采用最近已被证明可用作研究暴发性致命性心肌炎发展的鲁棒诱导型模型的转基因小鼠株（CD11c.DTR），其特征在于致死性心律失常。该方案包括心肌炎诱导，玻璃体内抗体介导的细胞染色，器官制备和随后的计算机辅助图像后处理的LSFM。尽管该方案作为我们特殊科学问题的高度适应性方法，但协议代表了易于调整的系统的蓝图，也可以在其他器官甚至其他物种中完全不同的荧光结构。

引言

在光学显微镜的进化过程中，出现了许多专门的形式，它们都被开发出来，以最小化特定标本的可视化过程的限制。一种这样的方法是光片荧光显微镜（LSFM）。首先在1903年由Siedentopf和Zsigmondy ^1开发 ，并在20世纪90年代早期找到了其第一个基本的生物应用² ，LSFM已经成为迄今为止最大的微观工具，可以显示大样本，如完整的小鼠器官，具有荧光信号分辨率下降到细胞水平。由于这些优点，结合其活细胞成像的潜力，自然方法将LSFM命名为"2014年度方法³ "。

顾名思义，LSFM中的样品照明由光片进行，光片垂直于所用物镜的轴定向或发射光收集和随后的图像形成。光板通常通过将宽的准直激光束与柱面透镜聚焦或者通过在仅一个水平或垂直平面^4,5中的窄的聚焦激光束的快速侧向运动来产生。以这种方式，只有成像光学器件的焦平面被照亮，通常具有1-4μm的厚度。因此，对于放置在照明平面中的荧光样品，消除或大大抑制^6,7的散射光的产生和来自焦平面上方或下方的区域的光漂白的影响。由于所有失焦的飞机都不被照亮，所以在这些区域中不会出现光漂白效果。与标准共聚焦或多光子显微镜相反，照明和发射光的路径彼此分离，因此最终图像质量不依赖于通过目标的激发光束的完美聚焦。根据潜在的问题，因此可以使用具有巨大视场（FOV）的物镜，使得照射平面的最大可能面积可被成像，而没有任何部件在xy方向上移动。

在现代LSFM系统中，产生的光学部分的荧光图像被捕获在能够获得整个视场（FOV）的高灵敏度电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）照相机上，微秒。因此，通过将样品移动通过光片并通过以确定的z步骤获取图像，可以在合理的时间量8,9获得样本的完整3D信息，使得该技术适用于活细胞研究^{10 ，}ass ="xref"> 11，12。

然而，尽管LSFM提供了一种快速，灵敏和荧光友好的方法，但通过样品的透光性仍然是一个主要问题，特别是当大型生物样品成为3D分析的目标时。通过吸收的物理方面和具有不同折射率的结构的界面处的光散射来严格地改变透光性。因此，当大小成像采样数毫米时，LSFM主要与清除协议相结合，使样本光学透明。这些技术基于从相应的生物组织中除去水并将其与基于溶剂的浸渍介质（基于溶剂的浸渍介质）进行交换的想法，所述浸渍介质被选择为与特定目标组织组分的折射率窄度匹配。结果，横向光散射最小化，并且所有的波长的光可以更有效地穿过组织¹³ 。在许多情况下，以这种方式处理的生物标本在宏观上看起来是晶体透明的，即使在整个小鼠器官上，使用长工作距离，低放大倍数的目标，也可以进行LSFM。

在这里，我们提出了在光照片显微镜（参见材料表）中大样本成像的准备方案，我们已经建立了这一方案来研究心肌炎鼠模型中的细胞心脏浸润¹⁵ 。 CD11c.DTR小鼠在CD11c启动子¹⁶的控制下表达灵长类白喉毒素受体（DTR）。因此，与DTR一起表达CD11c的这些小鼠中的细胞对白喉白喉毒素（DTH）的外毒素敏感 ;用DTX对这些动物的系统治疗导致所有CD11c ⁺ ce的耗尽LLS。 CD11c是整联蛋白，并且作为各种不同可溶性因子的细胞表面受体，主要参与单核细胞谱系^17的细胞的激活和成熟过程。因此，CD11c.DTR小鼠模型已被广泛用于研究树突状细胞和巨噬细胞亚群在许多不同免疫学问题背景下的作用。随着时间的推移，据报道，用DTX系统治疗的CD11c.DTR小鼠可能会​​产生不良副作用，并可显示强烈升高的死亡率^18,19 。最近，我们能够确定死因的原因¹⁵ ，描述了在这些动物中气管内DTX应用后暴发性心肌炎的发展。毒素挑战引起细胞破坏，包括在心脏刺激传播系统的中心部分。伴随着大量的CD45+白细胞浸润，最终导致致命的心律失常。在这种情况下，不仅白细胞群体的出现是重要的，而且也是其心脏内部的空间分布。这个实验问题是现代显微成像的一个挑战，我们已经通过光镜显微镜方法解决了这一点，该方法由活体抗体染色和基于有机溶剂的光学清除方案支持。

方案

所有动物实验均按照欧盟指南进行，并得到了埃森相关地方当局的批准（AZ 84-02.04.2014.A036 - LandesamtfürNatur，Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen，Essen，Germany）。使用动物并在特定无病原体（SPF）条件下饲养。

白喉毒素诱导心肌炎（DTX）

1. 通过将DTX储备溶液用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释到1μg/ mL工作溶液中，制备DTX溶液用于诱导心肌炎。
2. 应用100μL这种溶液气管内（它）到8至10周龄的CD11c.DTR小鼠（ 约 5ng / g体重（bw）），如Hasenberg 等人所示。为了应用真菌孢子悬浮液²⁰ 。
   注意:腹膜内施用毒素可能导致类似的诱导致命性心肌炎。但是，这种方法必须首先被验证。
   1. 对于它的应用，通过腹膜内（ip）注射100mg / kg bw氯胺酮和10mg / kg bw赛拉嗪麻醉动物。
   2. 达到深度麻醉（脚趾压缩测试）后，通过使用22 G静脉导管通过口腔插管动物。通过使用小型动物呼吸器以每分钟250次呼吸和每次呼吸250μL的吸入体积通气，检查镜片管的正确定位，Hasenberg 等也显示。人。 ²⁰ 。
      注意:正确定位时，动物的呼吸速率将根据应用的通气设置而改变。
   3. 断开通气系统，并将100μLDTX溶液或等量的PBS作为对照通过导管滴入肺内，并继续对动物进行再通气1分钟。
3. 让动物从麻醉中恢复，并监测一般健康状况和体重变化4天。
   注意:根据遗传背景，小鼠应变或初始体重，心肌炎的严重程度和发作可能有所不同，应首先确定。

2.光照显微镜的样品制备

1. 毒素施用后4天，用蒸发的2％异氟烷/氧气混合物冲洗诱导室，麻醉小鼠。使用后视镜应用途径静脉内（iv），在50μLPBS中注射15μg直接标记的抗CD45抗体（克隆30-F11，AlexaFluor647（AF647）），这确保了非常快速和高度准确的应用正确量的抗体。
   注意:当小鼠躺卧并且不对脚趾夹紧测试做出反应时，达到了所需的麻醉深度。
2. 孵育2小时后，通过颈椎脱位处死小鼠d用5 mL PBS / EDTA（5 mM）灌注心脏。
   1. 使用21 G导管将心脏暴露于右心室注射灌注溶液。灌注缓慢，恒定的压力，并确保在切开主动脉后可以排出血液。
      注意:这种经心脏灌注可能会导致较小的准备工件，这可能会干扰器官的最终3D可视化。因此，先进的动物实验者可以通过下腔静脉进行灌注，切除腹主动脉。
3. 对于化学固定，通过与5mL的4％多聚甲醛（PFA）相同的凹处灌注心脏。将导管保持在适当位置，然后轻轻地安装一个装有PFA的新注射器。充满缓慢和恒定的压力。
   注意:对甲醛有剧毒性;避免与皮肤，眼睛和其他粘膜接触。
   1. 用锯齿镊子轻轻抓住心脏; PU稍微向上;并切割所有组织连接，包括进入和输出的动脉和静脉。将器官在4％PFA中另存4 h，以进一步固定。
4. 为了使器官脱水，以50％，70％和100％的上升乙醇系列将心脏孵育12小时，在黑暗中4℃孵育。在这里，使用黑色的5毫升聚丙烯反应管，使其能够以较慢的转速在管旋转器中恒定旋转，以防止气泡形成。
5. 通过化学清除完成样品制备。为了使心脏透明，将其在98％二苄醚（DBE）中孵育，同时不断旋转过夜。
   注意:DBE刺激眼睛，皮肤和呼吸系统。

3.光照显微镜

1. 使用光照显微镜进行LSFM（参见材料表）。将样品放在显微镜的标准样品架上放入DBE填充的铜中vette，适用于高达30 mm x 30 mm x 15 mm的样品。
2. 在使用脱水和清除的琼脂糖块的图像采集过程中将样品牢牢固定在适当位置。
   1. 为了制备琼脂糖块，将2％熔融琼脂糖倒入模具（15 mm x 15 mm x 5 mm）。让琼脂糖冷却下来，直到凝固。
   2. 以升序乙醇系列（50％，70％，100％100％）脱水。在98％DBE中孵育琼脂糖块过夜。将琼脂糖储存在DBE中直至使用。
      注意:由于琼脂糖主要由水组成，每个脱水步骤的孵育时间可以根据块的大小而延长。
      注意:DBE刺激眼睛，皮肤和呼吸系统。
   3. 当需要时，使用锋利的手术刀将制备的琼脂糖块切割成所需的形状。通常，切割棱镜或楔形形状以放置在样品适配器的边缘。
      注意:由于琼脂糖块具有弹性，当用力稍微推动时，样品保持原位。
3. 用适当的激发和发射滤光片设置检测感兴趣的荧光信号（这里为自发荧光和抗CD45抗体染色）。
   1. 为了检测结缔组织来源的自发荧光信号，使用波长488 nm（OPSL:50 mW）的525/50 nm带通滤波器。在668nm（带通滤波器:680/30nm）和647nm的激发波长（二极管激光器:50mW）下检测到具有AF647偶联抗体的CD45染色。
   2. 选择4μm作为两个单独z平面之间的距离。

图像后处理

注意:采用科学的3D / 4D图像处理和分析软件进一步处理获取的数字图像数据（参见材料表）。

1. 打开和预先调整数据文件。
   1. 开始分析软件后，选择左上角的"Surpass"按钮。要打开图像堆栈，请选择"文件"，"打开"，然后选择包含第一个获取的通道数据的文件夹。选择"编辑"和"添加频道"以添加更多获取的频道。
      注意:根据数据大小和计算机系统，此过程可能需要几分钟。所呈现的协议演示了2个采集通道（自发荧光和AF647）的所有步骤。
   2. 通过单击"编辑"并选择"图像属性"来更正x，y和z体素尺寸。当新窗口打开时，调整参数。
      注意:此步骤取决于所用的显微镜​​系统和特定的数据格式。正确的xyz值对于随后的尺寸和远距离测量是至关重要的。在大多数情况下，这些参数作为元数据存储在显微图像文件中。但是，如果文件fo分析软件无法正确解释rmat，手动输入像素大小很重要。 x和y尺寸中的像素尺寸取决于相机像素大小，潜在应用的合并，以及镜头和物镜放大倍数。 z中的像素大小等于自定义的z步长（ 例如 4μm）。
2. 频道调整
   1. 首先通过打开"显示调整"（"编辑"和"显示调整"）将自动荧光信号转换为灰度。新窗口将列出所有打开的通道和所有显示设置;要更改其默认颜色，选择自动荧光通道并选择"白色"显示样式。点击"确定"以应用。
   2. 对于黑色电平调整，返回"显示调整"，并调整黑色电平值，以排除不代表样品结构的不需要的背景信号秒。
      1. 为此，请使用通道栏上的左上角三角形并将其从左向右拖动。
         注意:更改将立即可视化。确保仅抑制不是从样品得到的信号。背景中的最小值不应该是"0"，以避免音调黑色像素，因为可能需要噪声信号进行额外的计算。确保在图像采集后执行所有黑色电平变化。否则，宝贵的样品信息可能会丢失。黑色调整只是代表性的目的。要在不同的样品上使用相同的显示设置，可以在通道列表下面的"最小"数值区域中输入精确的值。这对定量分析非常有帮助。
   3. 执行强度调整，要么通过使用右上角的三角形来调整相应的通道强度，要么将精确值输入到通道下方的"最大"数值范围列表。
   4. 通过拖动通道条中间的下三角形来进行对比度调整，以增加或减少伽马值或输入精确值。
   5. 根据自动荧光通道调整AF647通道。不同的是，将AF647信号的可视化设置为热图颜色查找表。通过类似于步骤4.2.1的方法选择频道模式"火"。
      注意:由于整体信号强度与自发荧光通道相比显着降低，黑色电平通常调整到更低的值。对于自发荧光通道，该通道的亮度通常增加。
   6. 选择"混合模式"来细化组织结构。用相同的参数值分析来自一个系列的所有样品。
3. 虚拟剪辑
   1. 在3D场景展示之前虚拟切割器官rt，在渲染的3D对象上应用裁剪平面。
      1. 点击对象列表中的"剪切平面"图标（剪刀）。在图像视图中，将出现黄色框架和操纵器（白色主轴）。用鼠标旋转较薄端的主轴，从而改变裁剪平面的方向，并移动主轴较厚的中间部分，以选择所需的裁剪深度。
      2. 通过取消选中对象列表下方的相应复选框来隐藏框架和操纵器，并创建所需的快照。

结果

所提出的LSFM方法分析诱导重度心肌炎时小鼠心脏中的白细胞分布和量。 图1A说明转基因CD11c.DTR小鼠心肌炎诱导的预处理方案。该步骤代表将白细胞募集到心肌的必要触发因素。 DTX应用成功后，动物会发生严重的疾病症状，如2-4天的全身无力，厌食，体重减轻。 4天后，白细胞被iv染色。在经心脏灌注之前应用荧光染料偶联的抗CD45抗体以从循环中除去血液。如果成功执行，心脏和其他器官发白。随后，切除器官，组织水通过上升的乙醇排和DBE中的最终孵育与DBE交换。 图1B显示了时间表的器官经历显着收缩的个体孵育步骤。然后将化学清除的器官转移到标准显微镜组织支架上的DBE填充的成像室中。为了在3D图像采集期间稳定器官，它由透明琼脂糖块固定。样品的详细定位可见于图2 。由2个通道（自动荧光和抗CD45）组成的整个图像堆栈的获取大约需要20-30分钟，并生成大约16 GB的数据文件。最后，将所得数据分析为人造3D渲染，其中白细胞分布在热图中显示。在图...

讨论

在现代生命科学中，生物过程的微观可视化起着越来越重要的作用。在这种情况下，在过去两个世纪里已经取得了许多发展，帮助回答到目前为止无法解决的问题。首先，从根本上提高光学显微镜的分辨能力有明显的趋势。使用结构照明显微镜（SIM） ^{21,22 ，}受激发射耗尽（STED）显微镜²³和光激活定位显微镜（PALM） ^24,25或随机光学重建显微镜（STORM） ²⁶ ，一度假设的分辨率限制光衍射²⁷明显破裂。第二个经常针对性的挑战是在类似环境中观察细胞行为自然条件尽可能接近。在这方面， 原位或体内成像方法的发展被迫。为了克服复杂生物组织中有限的光穿透深度，双光子显微镜^28,29为本研究领域树立了新的标准。

然而，所有这些显微技术通常所共有的特征是使用高N...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
白喉毒素	Sigma Aldrich	D0564
磷酸盐缓冲盐水	Biochrom	L182-10
氯胺酮 [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
甲苯噻嗪 [2 %]	Ceva
注射器	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
INWELT 静脉导管	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
小动物呼吸器	哈佛仪器	73-0044	MiniVent
anit-CD45 抗体 （AF647）	BioLegend	103124
乙二胺四乙酸 （EDTA） 二钠盐二水合	Carl Roth	8043.2
导管 （21 G）	BD Biosciences	REF 387455	BD 价值套装
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
PE 管 （5 mL）	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
乙醇	Carl Roth	9065.4
二苄醚	Sigma-Aldrich	108014
管旋转器	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
琼脂糖（低胶凝）	Sigma Aldrich	A4018
模具 （15 x 15 x 5 mm）	Tissue Tek	4566	Cryomold
光片显微镜系统	LaVision Biotec		Ultramicroscope
显微镜本体	Olympus		MVX10
物	镜 Olympus		0.5 北美 MVPLAPO 2XC，WD 5.5 嗯
sCMOS 相机 5.5MP	Andor Technology
488 nm OPSL （50mW） 激光器	相干
647 nm  二极管激光器 （50mW）	相干
3D 图像处理和分析软件	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
转基因小鼠品系	Steffen Jung 等人。		CD11c.DTR
wt 小鼠品系	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
激光模块	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC 物镜