方法文章

人工程心脏组织的收缩自动分析心脏药物安全筛选

DOI：

10.3791/55461

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2017年4月15日

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1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

本文内容

摘要

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在这里，我们将展示人体工程心脏组织的产生从诱导多能干细胞（hiPSC细胞）衍生的心肌细胞。我们呈现由hERG通道抑制剂E-4031来分析收缩力和收缩图案的示例性改变的方法。这种方法显示的鲁棒性和适用性强心药物筛选的高水平。

摘要

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心脏组织工程技术描述以构成三维力产生工程化组织。对于在基础研究和临床前药物开发这些程序的执行，必须制定规范条件下的自动生成和分析的协议是非常重要的。在这里，我们提出了一种技术来生成来自不同物种（大鼠，小鼠，人）的心肌细胞工程化的心脏组织（EHT）。该技术依赖于含有聚二甲基硅氧烷弹性（PDMS）柱之间解离的心肌细胞在24孔格式的血纤维蛋白凝胶的组装。三维的，力生成EHTs铸造后构成两个星期内。此过程允许每周几百EHTs的产生和在技术上由心肌细胞的可用性只有有限的（0.4-1.0×10 6 / EHT）。 auxotonic肌肉收缩的评价是在修改的孵育室与mechan执行对24孔板的iCal联锁，并放置在该腔室的顶部上的照相机。软件控制了摄像机的XYZ轴系统到每个EHT上移动。 EHT收缩是由一个自动数字识别算法检测到，并且力是基于EHT的缩短和弹性倾向和几何形状的PDMS帖子的计算。该方法允许标准化并在无菌条件下高数EHT的自动分析。对心肌收缩药物效果的可靠检测心脏药物开发和安全药理学的关键。我们证明，与hERG通道抑制剂E-4031的例子，该人的EHT系统上复制人的心脏收缩动力学药物反应，这表明它是心脏药物安全性筛选一个行之有效的手段。

引言

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心脏的副作用，如药物性长QT综合征导致市场撤回在过去几年里。统计数据表明，所有提款的约45％是由于心血管系统1的不良影响。这种昂贵的发展过程和批准后药物失效是制药公司最糟糕的情况。因此，研究和开发部门重点检测的这种不良心血管作用早期。出于经济和伦理问题，努力减少动物实验，并与新的体外筛选测定代替他们正在进行中。

一组建立了试验的包括在美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）为致心律失常药物作用2临床前评价的准则。体细胞重编程，随后分化的技术人类诱导多能干细胞（hiPSC细胞）推动这一研究领域3。它现在提供了屏幕对人心肌细胞的新候选药物的可能性，并避免与物种间的差异问题。最近的心脏分化协议4，5不提供伦理关怀心肌无限量供应。然而，收缩力，最重要的，最特征的心肌细胞的活体参数测量，没有很好地建立起来。这与人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（的hiPSC-CM）相比，成人心肌细胞作为相对不成熟6。一种可能的改进是从单电池7（工程化的心脏组织，EH....

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方案

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注意:下面的步骤描述了一种细胞培养协议。请在无菌条件下进行，并使用预热媒体。

1.的hiPSC的心脏分化

  1. 培养的hiPSC
    1. 涂层6孔板（1毫升/孔）或T75烧瓶（7毫升/瓶）具有减少的生长因子基底膜基质（ 例如 geltrex，1:200;见的材料表）的Dulbecco改良的Eagle培养基中稀释（DMEM），用于在37℃下30分钟。通过混合制备FTDA介质12基本DMEM / F-12培养基含有2mM L-谷氨酰胺，0.5％青霉素/链霉素，5毫克/升运铁蛋白，5微克/升硒，0.1％人血清白蛋白，1×脂质混合，5 mg / L的胰岛素，50nM的dorsomorphin，2.5纳克/ ml激活素A，0.5毫微克/毫升人类TGFß1和30毫微克/毫升FGF2。
    2. 种子的hiPSC（〜3×10 5/10平方厘米）在FTDA培养基和培养在37℃，5％CO 2，21％O 2，每天更换培养基（图1A）。在80％汇合时，通道（1:2-1:6）与乙二胺四乙酸（EDTA; 0.5毫米;培养时间4〜分钟）。
  2. 胚胎体的形成（EB）
    1. 在T75烧瓶中，以高密度培养的hiPSC。
      1. ....

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结果

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心脏分化和EHT的制备

的hiPSC分别在低生长因子基底膜基质膨胀，用EDTA和形成在旋转烧瓶过夜胚体（EB）解离。中胚层诱导3天后，心脏分化与Wnt抑制剂的启动。后分化方案的〜17天，跳动将EB解离为单细胞的II型胶原酶（ 图1）。 EHTs从新鲜分离的心肌细胞制备每100μL的组织1.0×10 6个细胞的EB解离（ 图2）之后立即。对于从冷冻细胞制剂（ 例如，商业供应商），细胞在培养基逐滴悬浮解冻，并悬浮在ECM离心后。在48小时后，在EHT显微镜观察单个细胞的自发搏动。在接下来的日子里，心肌纵向摊开沿组织的力线，再加形成了连贯击败EHT。在PDMS职位的肉眼可见的变形与EHT分析仪进行测量。

收缩分析

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讨论

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工程心脏组织提供了一个有价值的选择，以心血管疾病研究的工具盒。在24井EHTs已经为疾病建模8，14，药品安全筛选7，8，10，11，15，或基本心血管研究16，17证明是有价值的。

的基本EHT协议潜在修饰包括与心肌细胞和非心肌细胞18和后负荷的增强14的定义混合物细胞相互作用的研究。故障排除的重要方面包括输入细胞群的质量和纤维蛋白.......

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披露

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IM，TE和AH是EHT技术公司，德国的联合创始人。

致谢

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作者非常感谢亚历山德拉·莫雷蒂和丹尼斯·施德其材料的实物捐助。我们承认，在实验药理学和UKE的毒理学部的大力支持IP和EHT工作组。作者的作品是由来自DZHK（德国中心心血管研究）和德国教育与研究部（BMBF），德国研究基金会（DFG居88 / 12-1，HA 3423 / 5-1资金支持），英国国家中心更换细化和在研究动物的减少（NC3Rs CRACK-IT授予35911-259146），英国心脏基金会的RM /30157分之13，欧洲研究理事会（高级格兰特IndivuHeart），德国心脏基金会和柏林自由UND Hansestadt汉堡。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EHT 分析仪器EHT Technologies GmbHA0001软件包括
EHT PDMS 机架EHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE 垫片EHT Technologies GmbHC0002
EHT 电极EHT Technologies GmbHP0001
EHT 起搏适配器/电缆EHT Technologies GmbHP0002
24 孔板Nunc144530
6 孔细胞培养板Nunc140675
15 mL falcon 管，带刻度 Sarstedt62,554,502
细胞刮刀Sarstedt831,830
旋转瓶Integra182 101
搅拌器 Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo Scientific70101将转子转速调整至 40 rpm
T175 细胞培养瓶 萨斯特德 831,812,002
V 型沉淀架 在 UKE Hamburgna
10× 定制DMEMGibco52100
1-硫代甘油 Sigma AldrichM6145
2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐Sigma Aldrich49752
激活素-A 研发&D 系统338-AC
琼脂糖 Invitrogen15510-019
肽酶Sigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS胰岛素 Gibco17504-044
BMP-4R&D 系统314-BP
胶原酶 II 沃辛顿LS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II，V 型（来自牛脾）Sigma D8764
多索吗啡 abcamab120843
乙二胺四乙酸 Roth8043.2
胎牛血清Gibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
纤维蛋白原（牛）Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302包被：1：200 稀释
HBSS，不含 Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
马血清Life 技术26050088
人血清白蛋白 生物工业05-720-1B
人胰岛素Sigma AldrichI9278
L-谷氨酸Gibco25030-024
脂质混合物 Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234用于 EHT 重组混合物。
N-苄基对甲苯磺酰胺TCIB3082-25G
PBS 不含 MgCl2/CaCl2Biochrom14190
青霉素/链霉素Gibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
聚乙烯醇 Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
亚硒酸钠Sigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
凝血酶Sigma AldrichT7513
转铁蛋白 Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCUKE 汉堡定制na
iCell 心肌细胞试剂盒Cellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
多细胞心肌细胞试剂盒PluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC 心肌细胞试剂盒Axiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
细胞炎心肌细胞Takara Bio USA， Inc.编号 Y10075
抑

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from:

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PDMS hERG E 4031

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