用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

摘要

在此，我们展示了由诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞生成人源工程化心肌组织的方法。我们介绍了一种分析收缩力的方法，并以hERG通道抑制剂E-4031引起收缩模式改变的示例进行说明。该方法具有高度的稳健性，适用于心脏药物筛选。

摘要

心脏组织工程是指构建能够产生三维收缩力的工程化组织的技术。为了在基础研究和临床前药物开发中应用这些技术，建立在标准化条件下自动化生成和分析的方案至关重要。本文介绍了一种从不同物种（大鼠、小鼠、人）心肌细胞生成工程化心肌组织（EHT）的技术。该技术基于在24孔板中，将分散的心肌细胞与纤维蛋白凝胶组装于弹性聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱之间。在浇铸后两周内形成具有三维结构并能产生收缩力的EHT。该方法每周可生成数百个EHT，其技术限制仅取决于心肌细胞的可获得性（每个EHT需0.4–1.0 × 10⁶个细胞）。在一种改良的培养箱中对等长-等张肌肉收缩进行评估，该培养箱配备有用于24孔板的机械锁定装置，并在顶部放置摄像机。软件控制摄像机沿XYZ轴系统依次移动至各个EHT位置。通过自动图像识别算法检测EHT的收缩，收缩力则根据EHT的缩短程度以及PDMS支柱的弹性特性和几何结构进行计算。该方法可在标准化和无菌条件下实现对大量EHT的自动化分析。准确检测药物对心肌细胞收缩功能的影响，对于心脏药物研发和安全性药理学至关重要。我们以hERG通道抑制剂E-4031为例，证明人源EHT系统能够重现药物对人心脏收缩动力学的影响，表明其在心脏药物安全性筛选中具有良好的应用前景。

引言

由药物引发的长QT综合征等心脏副作用导致过去数年中多款药物被撤市。统计数据显示，约45%的药物撤市案例源于对心血管系统的不良反应¹药物在经历昂贵的研发过程并获批后却遭遇失败，这对制药公司而言是最糟糕的情况。因此，研发部门致力于尽早发现此类不良心血管反应。出于经济和伦理方面的考虑，人们正努力减少动物实验，并以新的替代方法取代动物实验 体外 筛选实验正在进行中。

美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）指南中包含了一系列既定的检测方法，用于药物致心律失常作用的临床前评估²体细胞重编程技术以及人诱导性多能干细胞（hiPSC）的分化技术推动了该研究领域的发展³现在提供了在人心肌细胞上筛选新药物候选物的可能性 体外 并避免了物种间差异带来的问题。近期的心肌分化方案^4,5 提供无限量的心肌细胞，且无伦理顾虑。然而，收缩力的测量——最重要且研究最充分的 体内 心肌细胞参数尚未明确建立，这与相对不成熟性有关⁶ 与成年心肌细胞相比，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）存在差异。一种可能的改进方法是利用单个....

方案

注意：以下步骤描述了一种细胞培养方案。请在无菌条件下操作，并使用预热的培养基。

1. hiPSC 的心脏分化

1. 培养人诱导多能干细胞
   1. 用生长因子减少型基底膜基质包被6孔板（每孔1 mL）或T75培养瓶（每瓶7 mL）例如 Geltrex，按1:200比例用DMEM稀释；参见材料表），在37 °C孵育30分钟。配制FTDA培养基¹² 通过将基础DMEM/F-12培养基与2 mM L-谷氨酰胺、0.5%青霉素/链霉素、5 mg/L转铁蛋白、5 µg/L硒、0.1%人血清白蛋白、1×脂质混合物、5 mg/L胰岛素、50 nM dorsomorphin、2.5 ng/mL activin A、0.5 ng/mL人TGFß1和30 ng/mL FGF2混合制备。
   2. 种子 hiPSC（约 3 x 10⁵/ 10 cm²）的FTDA培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养₂，21% O₂₂ 每日更换培养基（图1A）。当细胞融合度达到80%时，使用乙二胺四乙酸（EDTA；0.5 mM；孵育时间约4分钟）进行传代（1:2–1:6）。
2. 胚胎样体（EB）的形成

结果

心脏分化与工程化心肌组织的制备

人诱导多能干细胞（HiPSC）在低生长因子基底膜基质上扩增，用EDTA消化后，在旋转培养瓶中过夜形成拟胚体（EB）。经过三天的中胚层诱导后，使用Wnt抑制剂启动心肌分化。在分化方案进行约17天后，将跳动的拟胚体用II型胶原酶消化为单细胞（图1）。在拟胚体消化后立即取1.0 × 10⁶个新鲜分离的心肌细胞，加入100 µL组织中制备工程化心脏组织（EHT）（图2）。对于冻存细胞（例如 商业供应商提供的细胞），通过将细胞逐滴重悬于培养基中进行解冻，离心后重悬于细胞外基质（ECM）中。在48小时内，可在显微镜下观察到EHT中单个细胞出现自发性搏动。在随后的数天内，心肌细胞沿组织的受力方向纵向伸展、相互连接，形成协调跳动的EHT。通过EHT分析仪器测量PDMS支柱宏观可见的偏转程度。

讨论

工程化心肌组织为心血管研究工具箱提供了一种有价值的选项。采用24孔板格式的工程化心肌组织（EHT）已证明在疾病建模^8,14、药物安全性筛选^7,8,10,11,15以及基础心血管研究^16,17中具有重要价值。

对基本EHT方案的潜在改进包括心肌细胞与非心肌细胞特定混合物的细胞相互作用研究¹⁸以及后负荷增强研究¹⁴。故障排查的重要方面包括.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EHT分析仪器	EHT Technologies GmbH	A0001	包含软件
EHT PDMS支架	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE间隔片	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT电极	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT起搏适配器/电缆	EHT Technologies GmbH	P0002
24孔板	Nunc	144530
6孔细胞培养板	Nunc	140675
15 mL离心管，带刻度	Sarstedt	62,554,502
细胞刮刀	Sarstedt	831,830
旋转培养瓶	Integra	182 101
搅拌器 Variomag/Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	调节转子转速至40 rpm
T175细胞培养瓶	Sarstedt	831,812,002
V型沉降架	德国汉堡UKE定制	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-硫代甘油	Sigma Aldrich	M6145
2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
琼脂糖	Invitrogen	15510-019
抑肽酶	Sigma Aldrich	A1153
注射用水	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS胰岛素	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
胶原酶II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II，V型（来自牛脾）	Sigma	D8764
多索吗啡	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
胎牛血清	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
纤维蛋白原（牛源）	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	用于包被：1:200稀释
无Ca2+/Mg2+ 的HBSS	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
马血清	Life technologies	26050088
人血清白蛋白	Biological Industries	05-720-1B
人胰岛素	Sigma Aldrich	I9278
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	用于EHT重建混合液。
N-苄基-对甲苯磺酰胺	TCI	B3082-25G
无MgCl2/CaCl2的PBS	Biochrom	14190
青霉素/链霉素	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
聚乙烯醇	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
亚硒酸钠	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
凝血酶	Sigma Aldrich	T7513
转铁蛋白	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	德国汉堡UKE定制	na
iCell心肌细胞试剂盒	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte心肌细胞试剂盒	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC心肌细胞试剂盒	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis心肌细胞	Takara Bio USA, Inc.	Y10075