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方法文章

活体肺树突状细胞成像的精密小鼠肺切片制备

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DOI：

10.3791/55465

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2017年4月5日

 ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH

本文内容

摘要

我们介绍一种制备精密切割肺组织片（PCLS）并对其进行免疫染色以可视化肺内多种免疫细胞类型定位的方法。本方案可进一步扩展，用于在多种条件下观察不同类型细胞的位置与功能。

摘要

吸入过敏原和病原体会引发肺部多种免疫细胞类型的多重变化。流式细胞术是一种用于定量分析免疫细胞表面蛋白的强有力技术，但它无法提供这些细胞在肺内定位和迁移模式的信息。同样， 趋化性实验可用于研究细胞对趋化因子的响应能力 体外但这些检测方法无法重现完整肺组织的复杂环境。与上述技术不同，通过制备精密切割肺组织片（Precision-cut Lung Slices, PCLS），使用 commercially available 的荧光标记抗体进行染色，并利用共聚焦显微镜观察切片，可直观显示肺内各类细胞的定位。PCLS 既可用于活体肺组织，也可用于固定肺组织，其切片范围可大至涵盖整个肺叶的横截面。我们已成功应用该方案可视化肺内多种细胞类型的分布，包括不同类型的树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T 细胞和 B 细胞，以及淋巴管细胞、内皮细胞和上皮细胞等结构细胞。在活体三维肺组织中观察细胞间的相互作用（如树突状细胞与 T 细胞之间的相互作用），有助于揭示细胞在稳态及炎症状态下在肺内迁移和相互作用的方式。因此，当 PCLS 与其他技术（如流式细胞术和定量 PCR）联合使用时，可促进对肺部过敏性和炎症性疾病背后细胞事件的全面理解。

引言

吸入脂多糖（LPS）等促炎性刺激物后，免疫细胞会协调有序地迁移进入、在肺内移动以及从肺中移出。例如，中性粒细胞会迅速被招募至肺实质和气道。此外，某些被称为传统树突状细胞（cDCs）的专业抗原呈递细胞会经历相对复杂的迁移过程1,2。可通过流式细胞术鉴定cDCs，部分依据是其表面标志物CD11c的表达。不同亚群的DCs可通过CD103和CD11b表面表达的差异加以区分3。当获取吸入性抗原后，部分cDCs会离开肺组织，经淋巴管迁移至肺引流淋巴结（LNs），并在其中向抗原特异性T细胞呈递肽段4。这是启动适应性免疫应答的关键早期事件。然而，由于未知原因，并非所有获取了吸入性抗原的cDCs都会离开肺组织，其中许多细胞可在该器官中存留数月之久5,6。这一现象在一定程度上可通过这些细胞的发育来源加以解释，因为缺乏趋化因子受体CCR7的单核细胞来源CD11c+细胞无法迁移至局部淋巴结7,8。cDCs的迁移潜能似乎也至少部分取决于其在肺内的解剖位置。然而，这些不同cDC亚群在肺内的精确定位尚未完全明确。要更深入理解肺免疫系统如何被激活，有必要进一步了解免疫细胞在肺内的定位及其调控分子机制。

肺切片（PCLS）正越来越多地被用作一种ex vivo（离体）方法，用于在保持肺部结构完整性的前提下观察细胞定位及细胞间相互作用9,10。PCLS 已被用于研究多种物种的肺组织，包括小鼠、牛、猴子、绵羊、马和人类11。该技术的一个主要优势在于，从小鼠单个肺叶可制备约 20 片切片，从而显著减少单次实验所需的动物数量。几乎所有类型的免疫细胞，包括树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、中性粒细胞和 T 细胞，均存在于 PCLS 中，并能维持其正常结构。

PCLS 还可用于研究经乙酰胆碱处理后气道和平滑肌细胞的钙信号传导及收缩性12 或氯化甲胆碱13在此方法中，仅需对肺部的一小部分进行显微分析，但已有研究报道，肺切片中气道收缩程度的测量值在不同切片之间的差异约为10%，该变异程度与在完整动物中进行肺功能检测时观察到的变异程度相当。14其他研究人员已将PCLS用作一种 离体 研究经LPS孵育后细胞因子表达和细胞表面标志物变化的方法15. PCLS 也被用于 离体 小肺泡内动脉低氧性肺血管收缩模型。这些血管位于肺部其他方法无法触及的区域，包括离体动脉节段记录或胸膜下血管分析等技术均难以触及16我们实验室主要利用肺切片（PCLS）来观察稳态下及刺激后活体肺组织中免疫细胞的定位 在体 炎症刺激。我们为此开发的实验步骤如下。

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方案

本文所述动物实验程序已获得国家环境健康科学研究所动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 肺组织准备

  1. 根据机构动物护理和使用委员会提供的指南，在特定病原体阴性条件下饲养6至12周龄的实验小鼠。
    注：成像所用小鼠可根据各研究人员的具体研究兴趣选择未经处理的 naïve 小鼠或经处理的小鼠。本文描述了 naïve 小鼠以及经100 µg 卵清蛋白（OVA）和0.1 µg 脂多糖（LPS）处理的小鼠中免疫细胞的定位情况，以磷酸盐缓冲液（PBS）作为溶剂，总体积为50 µL。为将OVA/LPS经口咽途径灌注至气道，使用异氟烷吸入麻醉动物，并用橡皮筋将其牙齿固定，垂直悬挂。用镊子轻轻夹住舌头并拉向一侧以防止吞咽，然后将50 µL OVA/LPS溶液滴加至口腔后部，操作方法如前所述17。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死小鼠，并将动物固定在聚苯乙烯基板上。
  3. 使用剪刀从腹部中线向上剪开皮肤和腹膜直至下颌，打开腹腔。用镊子或剪刀钝端将肠道移开，剪断下腔静脉以使肺部血液排出。用剪刀尖端刺破膈肌，使肋骨扩张，注意避免损伤肺组织。
  4. 用镊子夹住气管周围的唾液腺及其他组织并手动将其从下方气管上剥离清除。使用精细镊子或剪刀，在最厚软骨环的前侧气管壁上做一个小切口，注意不要完全切断气管。切口大小应刚好允许20 G针头通过即可。
  5. 将一段长约1.5英寸、20 G的针头套入一段聚乙烯导管，使导管末端超出针头约1 cm。将导管末端以约45°角斜切以形成斜面，将针头连接至1 mL注射器，并通过针头吸取0.8 mL温热（40 °C）的2%低熔点琼脂糖溶液至注射器内。
  6. 将导管末端插入气管切口，缓慢将琼脂糖注入肺内。在不移动针头或注射器的情况下，用胶带将注射器固定在聚苯乙烯基板上，确保针头保持在气管内。
    注：注射后，肺组织会增大并在胸腔内膨胀。右肺叶先扩张，随后左肺叶扩张。若仅一侧肺叶扩张，说明针头插入过深（已越过支气管），需稍许回撤后再继续操作。此步骤需尽快完成，以免琼脂糖开始凝固。
  7. 将小鼠连同基板及仍插入气管的注射器一起置于冷室或冰箱中至少10分钟。如有需要，即使后续将进行活体视频显微成像观察细胞迁移，动物也可在此条件下保存数小时。
  8. 待小鼠冷却后，用剪刀小心切除已被琼脂糖充胀的肺组织，并将其置于盛有冰冻PBS的3 cm培养皿中，保持冰上保存。
  9. 选择用于切片的肺叶（例如，右上肺叶）。确保肺组织的内侧部分（即连接气管的一侧）朝下放置于培养皿中。
    注：所选肺叶及其在推杆上的方向将决定可见血管和气道的大小。此处描述的方向最适合观察大口径气道及肺实质。小鼠具有一片较大的左肺叶和右侧四片较小的肺叶。在通过口咽或鼻内吸入方式将过敏原引入肺部后进行PCLS成像时，通常选择右上肺叶进行切片，部分原因是其尺寸适中，也因为吸入物质可在其中均匀分布。然而，其他肺叶（尤其是左肺叶）也可用于研究。在比较不同小鼠品系或处理条件时，应确保使用相同的肺叶进行对比分析。

2. 肺组织切片

注意：根据制造商的说明，使用自动切片机、金属冷却块、柱塞和金属注射器进行切片。

  1. 在柱塞上滴一滴通用型不流淌凝胶状万能胶，然后以环形方式将胶水涂抹均匀，注意不要让胶水接触到金属注射器的管壁。如果胶水接触到注射器管壁，会导致注射器和柱塞粘连在一起。
  2. 在将胶水涂于柱塞后，立即用镊子轻轻夹住已切除的肺叶，使气管面朝下，轻触纸巾以去除多余液体，然后小心地将其放置在柱塞顶部。修剪掉超出柱塞边缘的任何多余组织。
  3. 将活塞向下推动，使金属注射器的侧壁向上移动并覆盖组织，形成一个底部粘附肺组织的腔室，深度不超过几厘米。用胶带缠绕金属注射器底部，以固定该位置。
  4. 将40 °C的2%低熔点琼脂糖小心倒入孔中，使其刚好覆盖组织小叶顶部。
  5. 用预冷的冰块包围金属注射器，并将叶瓣和琼脂糖冷却 1 - 2 分钟。
    注意：围绕组织的琼脂糖冷却时间过短可能导致切片过程中琼脂糖解体，进而造成肺切片（PCLS）切割不均匀。
  6. 将样本注射器装入自动切片机中，并用冰冻的PBS填充缓冲液箱。将步进电机驱动器与样本注射器对齐，移除底部的胶带。将开关拨至快进（FF）位置，直至步进电机驱动器轻轻接触推杆后端。
  7. 将新刀片与标本注射器对齐。在切片机上设置组织厚度、连续/单片切割、振荡频率和速度。例如：组织厚度：150 µm，连续切割（cont.），振荡频率：9，速度：3 - 4。按下启动键。上述参数需根据具体自动切片机的规格进行调整。
  8. 使用细刮勺或画笔，逐个收集落入缓冲液储液罐中的PCLS，并将其放入含有冰冻PBS的24孔板中。
    注意：保持切片顺序对于确保实验间的一致性至关重要。尽管每例肺组织因年龄、性别和体重不同而存在差异，但第10th 切片，例如，通常可获得大小相似的气道。

3. 抗体染色

  1. 根据目标细胞类型设计一组荧光标记抗体组合，同时考虑潜在的荧光光谱重叠以及显微镜的检测能力。
    注：例如，用于树突状细胞亚群检测的抗体组合如下：CD11c/alpha X 整合素 - BrilliantViolet (BV) 605（激发：405 nm，峰值发射：605 nm），CD324/E-钙黏蛋白 - Alexa 488 (AF488)（激发：488 nm，峰值发射：519 nm），CD88/C5Ra1 - 藻红蛋白 (PE)（激发：561 nm，峰值发射：578 nm），CD103/alpha E 整合素 - 别藻蓝蛋白 (APC)（激发：633 nm，峰值发射：660 nm）。使用荧光光谱查看工具（见材料清单）有助于设计抗体组合。
  2. 配制含有目标抗体的抗体混合液。
    1. 对于固定后的肺切片（PCLS）成像，向一个1.5 mL微量离心管中加入800 µL染色缓冲液、100 µL Fc阻断剂、50 µL正常小鼠血清和50 µL正常大鼠血清，总体积为1 mL。对于活细胞成像，则使用800 µL含10%胎牛血清（FBS）的Leibovitz's培养基（1x）（即Leibovitz-10）代替染色缓冲液。
    2. 加入抗体，调节每种抗体至所需终浓度。将抗体溶液转移至一个3 cm培养皿中，避光保存直至使用。
      注：每种抗体的终浓度需单独优化（通常为1 - 5 µg/mL）。
  3. 选择含有目标解剖区域（如大气道或肺外周）的肺切片（PCLS），将其放入盛有1 mL抗体溶液的3 cm培养皿中。
  4. 将肺切片（PCLS）置于冰上、避光条件下，缓慢振荡孵育30或60分钟进行染色。
  5. 对于固定后的肺切片（PCLS）成像，请进入第4节；对于活细胞成像，请进入第5节。

4. PCLS 的静态成像

  1. 孵育PCLS与抗体60分钟后，从培养皿中移除抗体溶液，并用1 mL冰冻PBS将组织片冲洗两次。
  2. 用移液器将50 µL PBS滴加到3 cm圆形玻璃底培养皿上。使用刮勺或画笔将染色后的PCLS转移至液滴中，轻轻操作组织切片，使其展平。用移液器吸除PBS。切片应尽可能平铺。上述操作需迅速完成，以避免荧光淬灭。
  3. 在切片上加入一滴室温封片剂，轻轻盖上盖玻片 将玻璃盖玻片放入孔板的孔中。在成像前，将PCLS置于4 °C避光保存，时间不超过一小时。
  4. 使用共聚焦显微镜观察时，采用20倍物镜（参见 材料清单）。使用 "瓷砖" 用于定位并标记组织边缘的工具 "凸包" 设置。这有助于减少平铺扫描的时间。
  5. 设置z轴堆叠范围时，应在切片的多个区域（尤其是边缘区域）进行验证，以确认所设置的范围是否合适。
    注意：由于组织很难完全展平，z轴扫描范围通常需要大于组织本身的厚度。例如，对于厚度为150 µm的PCLS，z轴堆栈范围可能需要设置为200–250 µm，以容纳切片中的隆起和弯曲。根据z轴堆栈范围和组织大小的不同，使用20倍物镜完成一次完整的肺组织扫描需要7–12小时。每份肺组织均具有独特性，因此每次实验都必须调整参数设置。

5. 肺切片活细胞成像

  1. 孵育PCLS与抗体30 min后，从培养皿中移除抗体溶液，并用1 mL冷Leibovitz-15溶液清洗切片两次。
  2. 将50 µL新鲜的Leibovitz-10培养基移液至八槽腔室载玻片的一个槽内。用刮铲将PCLS转移至培养基中，并轻轻操作使其切片展平。上述操作需迅速完成，以避免光漂白。
  3. 用移液器吸除50 µL培养基。切片应尽可能平放。
    注意：切片边缘垂直翻起紧贴孵育 chamber 壁是可接受的。此外，如有条件，可在进行下一步操作前使用铂金丝重物固定切片。参见所附材料列表中提供的铂丝示例，该铂丝可剪裁并弯折成小型重物。
  4. 在4 °C冷室中，将100 µL不含酚红且生长因子减少的细胞外基质与100 µL Leibovitz-10混合。操作时应使用预冷的移液器吸头，否则细胞外基质会在吸头中凝固。
    注意：基质与培养基的这一比例（1:1）可形成足够致密的凝胶，以在组织培养条件下固定肺切片（PCLS）。
  5. 轻轻吹打基质以混匀，然后小心地将基质滴加到PCLS上方，确保凝胶覆盖在肺组织切片之上，且组织切片不会上浮至凝胶表面。该凝胶应起到配重作用，将PCLS固定在培养板底部。
  6. 将带腔室的盖玻片小心转移至37 °C培养箱中，使基质固化约5分钟。
  7. 将带有分格的盖玻片整体转移至已预热的共聚焦显微镜载物台上。成像过程中始终维持腔室温度为 37 °C。CO2 使用Leibovitz培养基时，细胞孵育过程中无需提供气体供应。
  8. 根据所需帧间间隔设置z轴扫描范围和图像拼接范围。在共聚焦显微镜下观察时，使用20倍物镜（见材料列表）。使用 "瓷砖" 用于标记组织中感兴趣区域的工具，使用 "居中网格" 设置（例如，一个 2x2 的中心网格。
  9. 设置z轴堆叠范围时，需在切片的多个区域确认所设定的范围是否合适。
    注意：z轴范围通常等于组织的厚度。每只肺均具有独特性，因此每次实验均需调整参数设置。一般情况下，2×2拼接图像和10层z轴堆栈将产生约每2分钟1帧的成像速度。开始实验前，请确保已启用自动对焦功能，以尽量减少成像期间的x-y平面和z轴漂移。

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结果

为了确定两种树突状细胞（DC）亚群——CD11bhi cDCs 和 CD103+ cDCs 的定位，我们对来自 C57BL/6 小鼠的肺组织切片（PCLS）进行切割，并使用针对 CD11c、CD88、CD103 和 CD324（E-钙黏蛋白）的单克隆抗体（mAbs）进行染色。抗 CD324 抗体可标记气道上皮细胞，而 CD88 在巨噬细胞和中性粒细胞表面表达，但在 cDCs 上不表达8。这使我们能够将 cDCs 与 CD11c+ 巨噬细胞区分开来，并观察每种细胞类型与气道之间的空间关系（图 1）。我们发现，CD11bhi cDCs 主要定位于肺实质，而 CD103+ cDCs 则主要分布在气道周围及胸膜下区域。尽管在本实验中通过直接染色细胞表面 CD103 可轻松检测到 CD103+ cDCs，但对 CD11bhi cDCs 的检测则依赖于...

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讨论

本文所述方案最初旨在可视化肺组织内两种cDC亚群的定位。然而，该方案可轻松改造用于研究多种不同类型的细胞，同时保持细胞活力及肺组织的三维结构。后者相较于细胞培养系统具有重要优势，并有助于稀有细胞类型的鉴定。该方法依赖于从肺组织制备肺切片（PCLS），并采用适当的抗体组合来识别特定细胞类型，同时尽量减少背景染色。在很大程度上，这一过程需通过实验经验优化，因为在其他应用（包括流式细胞术）中表现良好的抗体，未必适用于PCLS染色。我们在该方面已取得显著进展，但若研究者希望研究本文未涵盖的细胞类型，则可能需要测试不同的抗体，并优化荧光染料种类及其浓度。

通过采用此处描述的方案，我们发现肺中存在定位不同的CD103+ cDCs和CD11bhi cDCs。在稳态条件下，CD103+ cDCs主要分布于气道周围及胸膜下区域，而CD11bhi cDCs则主要位于肺实质中。尽管本方案不适用于细胞内分子的染色，但可用于细胞表面标志物以及分泌性分子的成像。因此，我们能够在PCLS中检测到趋化因子CCL21和CCL19...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Jeff Tucker、Erica Scappini 和 Agnes Janoshazi 在显微镜技术方面的帮助，Ligon Perrow 对小鼠品系的管理，Jun Chen 和 Michael Sanderson 在组织切片机使用方面的协助，以及 Michael Fessler 和 Derek Cain 对手稿的审阅。本研究由美国国立环境卫生科学研究所（NIEHS）院内研究项目（NIH，项目编号 ZIA ES102025-09）资助，该项目由美国卫生与公共服务部资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratory000664
Prox1-TdTomato 转基因小鼠 Jackson Laboratory018128B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA特异性TCR x Nur77-GFP 转基因小鼠Jackson Laboratory004194, 016617B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
Rag1 基因敲除小鼠Jackson Laboratory002216B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
卵清蛋白，低内毒素，纯化Worthington Biochemical CorporationLS003059
大肠杆菌来源的脂多糖Sigma-Aldrich Co.L2630-25MG
聚乙烯管（非无菌）100 英尺BD Diagnostic Systems427421内径 0.86 mm，外径 1.27 mm
GeneMate Sieve GQA 低熔点琼脂糖BioExpressE-3112-125在 PBS 中配制成 2% 溶液，70 °C 溶解，保持在 40 °C。
Compresstome VF-300Precisionary Instruments, Inc.VF-300
双刃不锈钢剃须刀片Electron Microscopy Sciences72000一次性使用；每盒 250 片。每只肺应更换新刀片。
Krazy Glue 通用速干凝胶胶水VWR500033-484在当地药店通常以每管 3 美元的价格出售 
Leibovitz L-15 培养基，无酚红ThermoFisher Scientific21083027
正常大鼠血清 (NRS)Jackson ImmunoResearch Inc.012-000-120
正常小鼠血清 (NMS)Jackson ImmunoResearch Inc.015-000-120
胎牛血清 (FBS)HycloneSH30071.03HI
染色缓冲液实验室自制N/APBS 含 0.5% 牛血清白蛋白，0.1% NaN3，pH 7.4
Fc 封闭剂（抗 CD16/32 抗体）实验室自制N/A杂交瘤细胞系 2.4G2 培养上清液
抗小鼠 CD11b eFluor 450eBioscience48-0112-80抗小鼠 CD11b eFluor 450（克隆号：M1/70） 
抗小鼠 CD11c Brilliant Violet 605BioLegend101237Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD11c（克隆号：M1/70）
抗小鼠 CD11c 藻红蛋白eBioscience12-0114-82PE 标记的抗小鼠 CD11c（克隆号：N418）
抗小鼠 CD11c 别藻蓝蛋白BD Phamingen550261APC 标记的抗小鼠 CD11c（克隆号：HL3）
抗小鼠 CD88 藻红蛋白BioLegend135806PE 标记的抗小鼠 CD88（克隆号：20/70）
抗小鼠 CD103 别藻蓝蛋白eBioscience17-1031-82抗小鼠 CD103 APC（克隆号：2E7）
抗小鼠 CD90.2/Thy1.2 eF450eBioscience48-0902-82抗小鼠 CD90.2 eFluor 450（克隆号：53-2.1）
抗小鼠 CD172a/Sirp1a 别藻蓝蛋白eBioscience17-1721-82抗小鼠 CD172a APC（克隆号：P84）
抗小鼠 CD324 Brilliant Violet 421BD Horizon564188BV421 小鼠抗 E-钙黏蛋白（克隆号：5E8，又称 5E8-G9-B4）
抗小鼠 CD324 Alexa Fluor 488eBioscience53-3249-82抗 CD324（E-钙黏蛋白）Alexa Fluor 488（克隆号：DECMA-1）
抗小鼠 CD324 Alexa Fluor 647eBioscience51-3249-82抗 CD324（E-钙黏蛋白）Alexa Fluor 647（克隆号：DECMA-1）
玻璃底微孔培养皿，35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 1.5 盖玻片MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek 带腔室盖玻片ThermoFisher Scientific155411PK 每包 16 片
15 mm 盖玻片，No. 1.5 玻璃厚度MatTek CorporationPCS-1.5-15
裸铂丝World Precision InstrumentsPTP201直径 0.020"（0.5 mm），切成约 1 cm 长的小段，并弯成 "L" 形状
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP369344 °C 保存，使用前恢复至室温。
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无酚红，*无LDEVCorning356231
Zeiss 880 多光子激光扫描显微镜Carl ZeissZen Black 软件版本 8.1，2012（Zeiss）
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 物镜Carl Zeiss420650-9901-000

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